谷 金 蕓， 李 憲 臻， 楊 帆

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

黃原膠寡糖是一種新型功能性寡糖，具有抗氧化[1]、清除自由基[2]、DPPH清除和抑菌等生理活性，在商業(yè)上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。例如，作為益生元應(yīng)用于保健品改善人的胃腸功能、增強(qiáng)免疫力，作為農(nóng)用制劑促使植物自身免疫達(dá)到抑制病原菌的功效[3]。

目前黃原膠寡糖主要通過化學(xué)法進(jìn)行制備，利用酸、堿、過氧化氫等[4]隨機(jī)作用于黃原膠糖苷鍵并使其發(fā)生斷裂，但該作用過程為非特異性切割，且有副產(chǎn)物多、環(huán)境不友好、產(chǎn)量低等缺點(diǎn)。這些問題是制約黃原膠寡糖商業(yè)化生產(chǎn)的主要原因。酶法降解技術(shù)成為實(shí)現(xiàn)社會可持續(xù)發(fā)展的重要突破口，但是至今為止采用酶法降解黃原膠制備寡糖的相關(guān)研究仍然十分匱乏，因此需要開發(fā)高效的黃原膠降解酶系，從而達(dá)到黃原膠寡糖工業(yè)化生產(chǎn)的目的。

大腸桿菌是自然界中廣泛存在的細(xì)菌，也是常用的基因工程菌?；蜃⑨屝畔⒆C實(shí)大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)含有大量的內(nèi)源性糖苷水解酶[5]，這其中可能包括潛在的黃原膠酶，因此本實(shí)驗(yàn)擬利用大腸桿菌的粗酶液水解黃原膠，并對其水解條件進(jìn)行優(yōu)化，最終對獲得的寡糖產(chǎn)品進(jìn)行表征，以期為功能性黃原膠寡糖的工業(yè)化制備打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

EscherichiacoliBL21(DE3)，獲贈(zèng)于大連化學(xué)物理研究所趙宗保研究員課題組。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L；LB固體培養(yǎng)基：瓊脂粉15.0 g/L，其余同LB液體培養(yǎng)基；黃原膠，美國Spectrum Chemical有限公司。

Constant Systems高壓破碎儀，英國Constant Systems有限公司；TECAN酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司；ICS-5000離子色譜，美國Thermo Fisher Scientific公司；凝膠滲透色譜1260，安捷倫科技有限公司；ImageQuant LAS400凝膠成像分析系統(tǒng)，美國GE healthcare公司。

1.2 方 法

1.2.1 菌體培養(yǎng)及胞內(nèi)酶液提取

大腸桿菌BL21(DE3)是的大腸桿菌表達(dá)菌株，其中T7噬菌體RNA聚合酶基因的表達(dá)受控于λ噬菌體DE3區(qū)的lacUV5啟動(dòng)子，該區(qū)整合于BL21的染色體上。將60%甘油保存的大腸桿菌BL21(DE3)從凍管中取出少許劃線于LB固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)16 h，挑取BL21(DE3)單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12 h。種子液1∶50轉(zhuǎn)接于500 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)OD600至0.6；發(fā)酵液于16 ℃培養(yǎng)20 h；8 000g離心3 min收集菌體，40 mL磷酸鹽緩沖液重懸菌體。采用高壓勻漿儀進(jìn)行細(xì)胞破碎，預(yù)先打開冷卻循環(huán)系統(tǒng)冷卻樣品，設(shè)定高壓勻漿儀壓力207～241 MPa，重復(fù)破碎菌體3次。

粗酶樣品采用SDS-PAGE進(jìn)行分析，通過考馬斯亮藍(lán)G-250染色。蛋白質(zhì)濃度測定采用Bradford法[6]測定，得到的蛋白樣品采用真空冷凍干燥儀進(jìn)行凍干保存。

1.2.2 胞內(nèi)酶液的酶活測定

內(nèi)切酶活力測定：100 μL酶液與100 μL 0.2%黃原膠混勻，40 ℃反應(yīng)20 min，冰浴10 min終止反應(yīng)，在酶反應(yīng)體系中加入等體積的冰冷聚氰基丙烯酸正丁酯BCA溶液，75 ℃反應(yīng)30 min，測定OD562。以滅活的酶液作為陰性對照[7]。內(nèi)切酶活力單位定義：每分鐘釋放1 μmol/L葡萄糖當(dāng)量所需的酶量為1 U。

裂解酶活力測定：100 μL酶液與100 μL 0.1%黃原膠混勻，40 ℃反應(yīng)120 min，煮沸10 min 終止反應(yīng)，測定OD235。以滅活的酶液作為陰性對照。裂解酶活力單位定義：每分鐘OD235增大1.0所需的酶量為1 U。

1.2.3 胞內(nèi)酶液降解黃原膠反應(yīng)條件的優(yōu)化

最適酶解條件采用正交試驗(yàn)的方法[8]，分別選取酶質(zhì)量濃度0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL；黃原膠底物質(zhì)量濃度2、4、6、8、10 mg/mL；溫度梯度30、35、40、45、50 ℃；酶液緩沖液體系的pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0；反應(yīng)時(shí)間為30、60、90、120、150 s。

按照表1條件進(jìn)行酶解反應(yīng)，煮沸10 min終止反應(yīng)，10 000g離心10 min取上清，加入等體積冰冷的聚氰基丙烯酸正丁酯BCA溶液，75 ℃反應(yīng)30 min，測定OD562，計(jì)算產(chǎn)物DE。

表1 正交試驗(yàn)的因素和水平Tab.1 Factors and levels of the orthogonal experiment

1.2.4 胞內(nèi)酶液降解黃原膠制備黃原膠寡糖

100 mg黃原膠干粉，溶于50 mL 20 mmol/L pH 8.0的K2HPO4-KH2PO4的緩沖液。稱取1 g 蛋白干粉充分溶解在黃原膠底物中，40 ℃反應(yīng)24 h，煮沸10 min終止反應(yīng)，10 000g離心10 min 取上清。選取截留量為3.5 ku的透析袋，透析除鹽14 h，10 000g離心10 min取上清，液氮速凍后冷凍干燥得到黃原膠寡糖干粉。

1.2.5 黃原膠寡糖DE值的測定

DE代表葡萄糖當(dāng)量，是指在反應(yīng)體系中將還原性的糖全部當(dāng)作葡萄糖來計(jì)算其占干物質(zhì)的百分比。反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算體系中還原糖質(zhì)量和反應(yīng)起始黃原膠干重，求得黃原膠寡糖的DE[9]。

DE=m/m0×100%

式中：m為還原糖的質(zhì)量，mg；m0為反應(yīng)起始黃原膠的干重，mg。

1.2.6 黃原膠寡糖的凝膠滲透色譜分析

使用Agilent 1260 Infinity系統(tǒng)，色譜柱采用三柱串聯(lián)(PL aquagel-OH 60，PL aquagel-OH MIXED-M和PL aquagel-OH 30分離柱)。柱溫設(shè)定為40 ℃，樣品為20 μL 1 g/L黃原膠寡糖，0.1 mol/L NaNO3洗脫，體積流量0.8 mL/min。采用示差折光檢測，采用普魯蘭糖作為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品。用各組分的積分折射率(RI)峰面積除以18～33 min測得的總RI峰面積，計(jì)算相對分子質(zhì)量分布[10]。

1.2.7 黃原膠寡糖的離子色譜分析

使用ICS-5000系統(tǒng)，色譜柱為陰離子交換保護(hù)柱Carbo Pac PA100 (Guard，50 mm×4 mm，Dionex)和陰離子交換分析柱Carbo Pac PA100 (Analytical，250 mm×4 mm，Dionex)。柱溫設(shè)定為30 ℃，樣品(25 μL，1 g/L)由流動(dòng)相200 mmol/L NaOH和1 mol/L NaAc梯度洗脫，體積流量為1 mL/min。確定產(chǎn)物中黃原膠寡糖組分。

1.2.8 黃原膠寡糖的DPPH自由基清除活性測定

實(shí)驗(yàn)組將500 μL 1.0～5.0 mg/mL的寡糖樣品與500 μL 0.1 mmol/L DPPH混勻；空白組將500 μL水與500 μL乙醇混勻，33 ℃避光反應(yīng)30 min，靜置冷卻至室溫；對照組將500 μL黃原膠寡糖溶液與500 μL乙醇混勻，在517 nm測定吸光度。

清除率=(1-(Ai-Aj)/A0)×100%

式中：Ai、Aj、A0分別為實(shí)驗(yàn)組、對照組、空白組的吸光度。

1.2.9 黃原膠寡糖的羥基自由基清除活性測定

實(shí)驗(yàn)組加入500 μL 0.2 mol/L pH 7.5磷酸鹽緩沖液、100 μL 0.52 mg/mL番紅、500 μL 2 mmol/L 的EDTANa2-Fe2+和500 μL不同質(zhì)量濃度(0.5～4.0 mg/mL)的寡糖樣品，用水定容至4.9 mL，加入100 μL 1% H2O2混勻，40 ℃反應(yīng)30 min，在517 nm處測定吸光度；空白組以等體積的水代替黃原膠寡糖溶液；對照組等體積的水代替黃原膠寡糖溶液和EDTANa2-Fe2+溶液。

清除率=(A′i-A′0)/(A′j-A′0)×100%

式中：A′i、A′j、A′0分別為實(shí)驗(yàn)組、對照組、空白組的吸光度。

1.2.10 黃原膠寡糖的還原力測定

實(shí)驗(yàn)組加入400 μL不同質(zhì)量濃度(1.0～5.0 mg/mL)的寡糖樣品、500 μL 0.2 mol/L pH 6.6磷酸鹽緩沖液和500 μL 1%鐵氰化鉀，50 ℃反應(yīng)20 min，用水定容至4.9 mL，加入0.1 mL 1%過氧化氫溶液混勻，40 ℃反應(yīng)30 min，冰浴10 min冷卻，加入500 μL三氯乙酸，3 000g離心10 min，取400 μL上清加入500 μL水和100 μL 0.1%三氯化鐵溶液，靜置10 min，在700 nm處測定吸光度。吸光度增大表明還原能力增強(qiáng)。

1.2.11 黃原膠寡糖的過氧化氫的清除活性測定

實(shí)驗(yàn)組500 μL過氧化氫溶液(0.1 mol/L)與500 μL 1.0～5.0 mg/mL的寡糖樣品混勻，33 ℃反應(yīng)30 min，測定230 nm處的吸光度；空白組以等體積的水代替黃原膠寡糖溶液和過氧化氫溶液；對照組以等體積的水代替黃原膠寡糖溶液。清除率按照DPPH清除率進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶學(xué)性質(zhì)分析

從圖1可以看出，胞內(nèi)總蛋白分子質(zhì)量分布在14.3～200.0 ku。經(jīng)Bradford法檢測胞內(nèi)酶液質(zhì)量濃度為12.02 mg/mL。黃原膠內(nèi)切酶、裂解酶的比活力測定結(jié)果如表2所示，分別為(104.00±1.36)U/g、(1.28±0.62)U/mg，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道微桿菌XT11中黃原膠內(nèi)切酶MiXen酶活力為(15.70±0.98)U/g[11]，芽孢桿菌GL1中黃原膠裂解酶酶活力為0.13 U/mg[12]。胞內(nèi)酶液的內(nèi)切酶、裂解酶的比酶活力分別為文獻(xiàn)報(bào)道中的6.6倍和9.8倍。

1，胞內(nèi)酶液；M，蛋白marker圖1 大腸桿菌BL21(DE3)胞內(nèi)酶液的 SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE analysis of intracellular enzyme solution of BL21(DE3)

2.2 降解黃原膠的條件優(yōu)化分析

通過正交試驗(yàn)的方法進(jìn)行黃原膠水解的最適酶解反應(yīng)條件分析，如表2所示。胞內(nèi)酶液的質(zhì)量濃度為1.0～2.5 mg/mL時(shí)具有較高DE，當(dāng)酶質(zhì)量濃度小于1.0 mg/mL時(shí)，DE急劇下降。黃原膠底物的質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時(shí)具有較高的DE，隨著反應(yīng)體系中黃原膠底物質(zhì)量濃度的升高，DE降低。胞內(nèi)酶液與黃原膠底物在45 ℃ 反應(yīng)時(shí)顯示出了最高DE，當(dāng)酶反應(yīng)溫度低于45 ℃或高于45 ℃時(shí)，DE均有降低。胞內(nèi)酶液與黃原膠底物在pH 6.0～8.0的緩沖液中DE逐漸上升，因此該酶解體系的最適反應(yīng)pH為8.0。當(dāng)胞內(nèi)酶液降解黃原膠反應(yīng)120 s時(shí)DE最高，該反應(yīng)的最佳反應(yīng)時(shí)長為120 s。

表2 黃原膠酶解條件分析Tab.2 Analysis of xanthan enzymolysis conditions

正交試驗(yàn)結(jié)果得到該反應(yīng)的最優(yōu)酶解條件為pH 8.0的緩沖體系中1.0 mg/mL胞內(nèi)酶液與2.0 mg/mL黃原膠底物，45 ℃孵育2 min。在此條件下制備出黃原膠寡糖的DE為3.7%。

2.3 黃原膠寡糖的結(jié)構(gòu)性質(zhì)

通過使用凝膠滲透色譜對胞內(nèi)酶液水解黃原膠產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布進(jìn)行測定，結(jié)果如圖2所示。黃原膠酶解后的產(chǎn)物包含兩個(gè)主要組分，一種為部分降解的黃原膠，其分子質(zhì)量為2 619 u，保留時(shí)間為19～26 min；一種為降解后低分子質(zhì)量的黃原膠寡糖(941 u)，保留時(shí)間為30～36 min。產(chǎn)物中未被酶解的黃原膠是由于其致密有序的螺旋結(jié)構(gòu)使得BL21(DE3)胞內(nèi)酶液無法接觸到對應(yīng)的酶切位點(diǎn)[13]。與之前相關(guān)研究結(jié)果相比，胞內(nèi)酶液更好的突破了黃原膠降解的瓶頸，能夠?qū)⒏呔酆隙取⒔Y(jié)構(gòu)復(fù)雜的黃原膠水解為低分子質(zhì)量的產(chǎn)物[14]。

圖2 胞內(nèi)酶液水解黃原膠產(chǎn)物的凝膠滲透色 譜結(jié)果

利用離子色譜對黃原膠酶解后低分子質(zhì)量產(chǎn)物的組分進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示。在5～10 min 處出現(xiàn)的寡糖峰的聚合度(DP)為7～8，約為1個(gè)五糖結(jié)構(gòu)單元；在17～23 min出現(xiàn)峰的聚合度為12～14，約為2個(gè)結(jié)構(gòu)單元；在23～30 min 出現(xiàn)峰的聚合度為15～18，約為3個(gè)結(jié)構(gòu)單元。這3組寡糖峰對應(yīng)的分子質(zhì)量在900～2 700 u，證明了凝膠滲透色譜結(jié)果中出現(xiàn)了941 u。說明胞內(nèi)酶液具備良好的黃原膠降解能力。

圖3 胞內(nèi)酶液水解黃原膠產(chǎn)物的離子色譜結(jié)果

2.4 黃原膠寡糖的生理活性

黃原膠寡糖對DPPH自由基的清除作用如圖4(a)所示。DPPH自由基清除作用隨黃原膠寡糖濃度的增加而增強(qiáng)。黃原膠寡糖的IC50為3.46 mg/mL。與酸氧化法制備的DPPH自由基清除活性對比有提高[1]，可能是因?yàn)槊阜ūＡ粝铝舜蟛糠值谋峄鶊F(tuán)，從而提高了黃原膠寡糖抗氧化活性。

黃原膠寡糖對羥自由基的清除作用如圖4(b)所示。清除能力隨黃原膠寡糖質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，黃原膠寡糖的IC50為1.03 mg/mL。以抗壞血酸為對照，其IC50為4.71 mg/mL。結(jié)果表明，與抗壞血酸相比，黃原膠寡糖具有更強(qiáng)的清除羥自由基能力。與酸、堿氧化法制備黃原膠寡糖的羥基自由基IC50相比分別提高2.4倍和9.1倍[1]。

還原力試驗(yàn)也通常被用來評估抗氧化劑提供電子的能力[15]。黃原膠寡糖的還原力如圖4(c)所示。隨著黃原膠寡糖質(zhì)量濃度的增加，吸光度隨之增大。質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL時(shí)，黃原膠寡糖的吸光度為0.065。較之酸氧化法還原力有所提高，但略低于堿氧化法[1]。

1.0～5.0 mg/mL黃原膠寡糖對H2O2的清除活性如圖4(d)所示。黃原膠寡糖的IC50為2.995 mg/mL，與酸、堿氧化法制備黃原膠寡糖的H2O2清除率IC50對比，清除活性略低[1]。

(a) DPPH自由基清除率

(b) 羥基自由基清除率

(c) 還原力

(d) H2O2清除率

3 結(jié) 論

對大腸桿菌BL21(DE3)胞內(nèi)酶液水解黃原膠的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其對黃原膠具有較高的內(nèi)切酶和裂解酶活力，分別為(104.00±1.36) U/g和(1.28±0.62) U/mg。對黃原膠酶解條件優(yōu)化分析結(jié)果表明，該酶解體系中最適酶質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，底物質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL，酶反應(yīng)溫度為45 ℃，pH為8.0，反應(yīng)時(shí)間2 min。在此條件下制備出黃原膠寡糖的DE為3.7%。BL21(DE3)胞內(nèi)酶液能有效切割黃原膠主鏈，得到不同聚合度大小的黃原膠寡糖。通過與既往文獻(xiàn)相比，使用優(yōu)化后的方法酶解制備出的黃原膠寡糖在DPPH自由基清除活性、羥基自由基清除活性、還原力、過氧化氫清除活性方面效果良好。