劉 韙 銘， 楊 明， 李 憲 臻， 楊 帆

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

微生物在降解纖維素的過程中，纖維素酶編碼基因通過轉(zhuǎn)錄、表達(dá)、修飾等過程生產(chǎn)一系列的纖維素酶，例如內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、葡萄糖苷酶等，纖維素在多種纖維素酶共同作用下降解[1]。宏基因組測序分析技術(shù)直接分析復(fù)雜環(huán)境中纖維素降解菌群的物種結(jié)構(gòu)、組成以及基因的功能，這一過程不依賴于微生物的純培養(yǎng)，這在挖掘潛在的新型纖維素酶上應(yīng)用廣泛[2]。僅依靠宏基因組序列分析無法揭示菌群中物種和基因的活性信息[3]，因此在宏基因組研究的基礎(chǔ)上需要在對基因編碼產(chǎn)物表達(dá)情況以及活性微生物的種類進(jìn)行分析。宏蛋白質(zhì)組學(xué)是近年來新出現(xiàn)的一門學(xué)科，主要在特定時間點(diǎn)對復(fù)雜的環(huán)境微生物群落中的全部蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，并對這些蛋白質(zhì)的種類和功能進(jìn)行解析[4]。由于宏蛋白質(zhì)反映了有關(guān)代謝反應(yīng)和調(diào)控級聯(lián)反應(yīng)的實際功能，并且比基因以及相應(yīng)的mRNA提供更多有關(guān)微生物活性更為直接的信息，這在一定程度上彌補(bǔ)了宏基因組學(xué)的缺陷[5]。目前，已有許多研究利用宏蛋白質(zhì)組學(xué)方法探究纖維素降解菌群的結(jié)構(gòu)及酶系統(tǒng)。Liu等[5]利用宏蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析了堆肥微生物群落，揭示了堆肥過程中的主要微生物組成，同時檢測到纖維素降解所需的三種關(guān)鍵酶，并發(fā)現(xiàn)堆肥反應(yīng)早期真菌是纖維素酶的主要生產(chǎn)者。Hori等[6]通過宏蛋白質(zhì)組學(xué)對腐爛松木的微生物群落進(jìn)行分析，顯示其含有11種碳水化合物酯酶和23種糖苷水解酶，分別歸類為纖維素酶和半纖維素酶。然而在不同纖維素降解時期微生物群落宏蛋白質(zhì)的差異表達(dá)，以及應(yīng)用宏蛋白質(zhì)組學(xué)手段推測蛋白質(zhì)功能等方面少有報道。

本實驗室在前期工作中分離純化了一個能夠高效降解纖維素的微生物群落(FPDM)，并進(jìn)行了宏基因組學(xué)分析[7]，然而對于FPDM菌群中活性纖維素酶的種類以及此過程中微生物種群的代謝作用等工作仍有待探索。本實驗應(yīng)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)對菌群FPDM在降解纖維素不同時期的宏蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析，通過與數(shù)據(jù)庫比對，從微生物及酶兩方面解構(gòu)了群落FPDM的組成，進(jìn)而揭示菌群FPDM降解纖維素的策略。最后通過短時間序列表達(dá)水平挖掘機(jī)(STEM)的聚類方法預(yù)測部分未注釋蛋白的功能，以期挖掘潛在的纖維素酶以及構(gòu)建纖維素生物降解途徑纖維素的代謝網(wǎng)絡(luò)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

液體培養(yǎng)基(g/L)：NaNO3、MgSO4·7H2O、KCl 0.5，K2HPO41.0，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，pH 7.0。固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中加入20 g/L瓊脂。將干熱滅菌后Whatman No.1濾紙(5 g/L)剪碎加入液體培養(yǎng)基為濾紙液體培養(yǎng)基，將直徑8.5 cm的圓形雙層濾紙平鋪于固體培養(yǎng)基上為濾紙固體培養(yǎng)基。

胰蛋白酶、糜蛋白酶、碘乙酰胺(IAA)、1，4-二硫蘇糖醇(DTT)、三氟乙酸(TFA)、甲酸(FA)等，美國Sigma-Aldrich公司；鹽酸胍，阿拉丁科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)，生工生物工程(上海)有限公司；其他試劑均為分析純。

Ultimate 3000 RSLC液相色譜儀，Dionex公司；Q Exactive組合型四極桿Orbitrap質(zhì)譜儀，賽默飛世爾科技公司。

1.2 數(shù)據(jù)庫及分析軟件

Proteome Discoverer 2.2.038軟件，賽默飛世爾科技公司；R軟件， https：//www.r-project.or；R軟件包“VennDiagram”， https：//cran.r-project.org/webpackages/VennDiagram。

1.3 方 法

1.3.1 菌體培養(yǎng)

使用實驗室前期富集培養(yǎng)的菌群樣本。將纖維素降解菌群(FPDM)分別接種于濾紙固體、濾紙液體培養(yǎng)基，有氧條件下30 ℃培養(yǎng)，并分別培養(yǎng)3、8和15 d，在8 000g離心3 min收集菌體。

1.3.2 蛋白樣品的制備

取培養(yǎng)不同時間的FPDM菌體懸于5 mL Buffer (6 mol/L鹽酸胍，50 mmol/L Tris，1.5 mol/L 尿素)，使用超聲破碎的方法裂解細(xì)胞。將破碎液在10 000g條件下離心20 min獲得粗酶液，用3 ku的超濾離心管對蛋白進(jìn)行濃縮，蛋白質(zhì)濃度測定采用Bradford法[8]。

1.3.3 蛋白質(zhì)樣品的酶解

將500 μg的蛋白樣品加入10 ku超濾離心管，先加入終濃度20 mmol/L DTT溶液，55 ℃反應(yīng)1 h；再加入終濃度20 mmol/L的IAA溶液，室溫避光反應(yīng)40 min；最后加入20 μL 10 mmol/L NH4HCO3，重復(fù)一次；注意以上操作在加入下一種溶液前均需14 000g離心20 min后棄膜外溶液。加入蛋白酶在37 ℃水解樣品12 h，14 000g離心20 min即可獲得肽段。

1.3.4 高分辨LC-MS/MS質(zhì)譜分析

以0.1% FA溶液復(fù)溶凍干后的多肽樣品，Acclaim PepMap RSLC分析柱(50 μm ×15 cm，2 μm， 10 nm)分離，并在Ultimate 3000 RSLCnano系統(tǒng)進(jìn)行分析。將得到的肽歸屬于nanoESI源，在Q Exactive中串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)在線偶聯(lián)至UPLC。在Orbitrap中檢測到完整的肽和離子片段，分別為70 000和17 500。m/z在350～1 800 獲得全掃描MS，以數(shù)據(jù)依賴性模式獲得MS/MS譜。選擇15種最強(qiáng)離子用于MS/MS，自動增益控制(AGC)目標(biāo)為3×106。將27%標(biāo)準(zhǔn)化的碰撞能量用于選擇用于MS/MS肽。累積1×105離子用于產(chǎn)生MS/MS譜。動態(tài)排除設(shè)置為30.0 s，施加電噴霧電壓2.5 kV。

1.4 蛋白質(zhì)表達(dá)水平變化模式分析

蛋白質(zhì)表達(dá)水平模式采用STEM算法對蛋白質(zhì)的表達(dá)水平進(jìn)行聚類分析[9]，具體步驟：(1)去除三組樣本中總相對豐度過低(小于0.01%)、組間不存在顯著差異以及未獲得物種分類信息的蛋白。(2)根據(jù)KEGG和CAZy等功能數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果篩選出纖維素降解相關(guān)的蛋白質(zhì)，同時篩選出未獲得功能注釋信息但來自纖維素降解菌的蛋白質(zhì)。(3)應(yīng)用STEM算法對篩選出的纖維素降解功能蛋白進(jìn)行了差異豐度模式分析，將差異豐度模式一致的蛋白聚類，將功能相似的聚類到一起。將已獲得功能注釋與未獲得功能注釋的蛋白混合在一起再次聚類分析，隨后根據(jù)聚類信息來預(yù)測未注釋蛋白的功能。

1.5 數(shù)據(jù)分析

R軟件用于執(zhí)行蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸分析，同時R軟件的“VennDiagram”包用于繪制Venn圖。質(zhì)譜分析結(jié)果得到的二級質(zhì)譜的譜圖以Sequent HT作為搜索引擎，應(yīng)用Proteome Discoverer(version 2.2.0.388)軟件進(jìn)行比對分析。多肽的誤檢率控制在1%以下。胰凝乳蛋白酶(胰凝乳蛋白酶，或胰凝乳蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)為裂解酶，允許2個缺失的裂解。前體離子質(zhì)量誤差為10-5，碎片離子質(zhì)量誤差為0.02 u。肽段的最小長度為6，最大長度為144。Cys上的碳脒甲基化(+57.021 u)被指定為靜態(tài)修飾。設(shè)置Met氧化(+15.995 u)和蛋白N端乙?；?+42.011 u)為動態(tài)修飾。

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維素降解過程中菌群FPDM的蛋白質(zhì)組鑒定

實驗室前期工作中已探究出群落FPDM對濾紙的降解分為早期(3 d)、中期(8 d)以及后期(15 d)三個階段[7]。因此本工作在此基礎(chǔ)上應(yīng)用LC-MS/MS技術(shù)對群落FPDM在濾紙降解過程中3個時間點(diǎn)(3、8和15 d)的宏蛋白質(zhì)組進(jìn)行定性分析，在所有三組樣本共檢測到蛋白質(zhì)共628種。韋恩圖分析顯示如圖1所示，在3個不同時期共有蛋白質(zhì)285種，兩個樣本共有的蛋白質(zhì)有451種，占總蛋白質(zhì)數(shù)量的75.50%，纖維素降解3、8和15 d的樣本中分別包括91、17和45個特有的蛋白質(zhì)。

圖1 不同纖維素降解時間點(diǎn)FPDM菌群鑒定 出蛋白質(zhì)的韋恩圖

2.2 群落FPDM在纖維素降解過程中的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

通過對LC-MS/MS的結(jié)果進(jìn)行分析并比對數(shù)據(jù)庫，繪制了群落FPDM中宏蛋白質(zhì)組的熱圖，如圖2所示。已注釋的纖維素降解相關(guān)蛋白質(zhì)/酶共有40種，其中糖苷水解酶包括GH1、GH3、GH5、GH8～9，分別有2、5、5、7和14種；碳水化合物結(jié)合模塊(CBM)包括1個CBM4、2個CBM6、3個CBM9和1個CBM35。此外可以觀察到這些蛋白質(zhì)的相對豐度變化模式共有9種，其大體上可以分為兩類，一類為下降型，包括模式1、2、3、4、7、9；另一類為上升型，包括模式8、13、14。推測下降型中，模式1、3、4、7的蛋白質(zhì)是與纖維素降解相關(guān)的酶，主要是內(nèi)切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)，說明這類型的酶主要作用于纖維素降解的前中期，為后續(xù)的外切酶作用提供更多的作用末端[10]。而上升型的纖維素酶主要包括纖維二糖水解酶II(EC 3.2.1.91)、纖維糊精酶(EC 3.2.1.74)，還有部分是β-D-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)及6-磷酸-β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.86)，這類型酶主要分解纖維素降解的中間產(chǎn)物，例如纖維糊精或纖維二糖等[11-12]，這說明其主要在纖維素降解的中后期起作用。

FPDM.3、FPDM.8和FPDM.15分別為纖維培養(yǎng)基中培養(yǎng)3、8和15 d的FPDM樣本圖2 群落FPDM中宏蛋白質(zhì)組的相對豐度熱圖Fig.2 Heat map of relative abundance of metaproteome in microbiota FPDM

2.3 基于宏蛋白質(zhì)組微生物來源分析

對群落FPDM中檢測到的蛋白質(zhì)的物種來源進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖3所示。群落FPDM中的微生物共有8種相對豐度變化模式。這8種相對豐度變化模式同樣可以分為上升型以及下降型兩類，其中下降型包括模式0、4；而上升型包括模式8、11、12、13、14、15。

在下降型菌屬中相對豐度變化顯著的是Sporocytophaga(生孢噬纖維菌屬)和Herbaspirillum(草螺菌屬)，但二者中更顯著的是Sporocytophaga，該屬的相對豐度變化模式為模式4，僅在纖維素降解前中期發(fā)現(xiàn)相對豐度顯著下降(P<0.05)。Sporocytophaga屬已被證明可以有效地降解纖維素，尤其是結(jié)晶纖維素[13-15]。因此推測該屬為FPDM中關(guān)鍵的纖維素降解菌，主要作用于纖維素降解的前中期，直接參與纖維素降解。對于Herbaspirillum，推測其功能與Sporocytophaga相似。

上升型菌屬在纖維素降解過程在其相對豐度呈上升趨勢，這一類型的菌屬可能主要參與纖維素的中后期降解。其中相對豐度較高的是Cohnella(科恩氏菌屬)，有研究表明該屬中的一些細(xì)菌具有編碼纖維素酶的基因，并具有利用纖維素、半纖維素和纖維二糖的能力[16-19]。

如圖3所示，本研究所檢測到的蛋白主要來自6個核心屬。由表1可以看出，在所有檢出的蛋白質(zhì)中已經(jīng)獲得功能注釋的纖維素降解相關(guān)蛋白質(zhì)僅來自Sporocytophaga和Cohnella兩個屬。LC-MS/MS在Sporocytophaga中檢出了內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶II、纖維糊精酶、β-D-葡萄糖苷酶和6-磷酸-β-葡萄糖苷酶等與纖維素水解相關(guān)的酶，與文獻(xiàn)[15]報道的基因組分析結(jié)果一致。Sporocytophaga中的這些纖維素水解酶來自GH1、GH3、GH5和GH8～9等糖苷水解酶家族，分別有1、2、4、6和12種，這與Taillefer等[14]對Sporocytophaga的蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果相似。另外，Sporocytophaga中還發(fā)現(xiàn)存在CBM6和CBM9等纖維素結(jié)合模塊。Cohnella中發(fā)現(xiàn)僅有纖維糊精酶和β-D-葡萄糖苷酶被檢出，這些酶來自GH2和GH3糖苷水解酶家族，意味著該屬更傾向于在纖維素降解中后期發(fā)揮作用，艾士奇等[20]在應(yīng)用復(fù)合菌系降解纖維素時也發(fā)現(xiàn)Cohnella纖維素降解的中后期起著重要作用。在其他優(yōu)勢菌屬中并未檢測到已獲得功能注釋的纖維素降解相關(guān)蛋白質(zhì)。

FPDM.3、FPDM.8和FPDM.15分別為纖維培養(yǎng)基中培養(yǎng)3、8和15 d的FPDM樣本

表1 菌群FPDM核心屬中檢測到的蛋白質(zhì)數(shù)量Tab.1 Observed proteins belonged to the core genera in microbiota FPDM

由于STEM算法能夠?qū)⒐δ芟嗨频牡鞍拙垲怺7]，以此對未被注釋的蛋白功能進(jìn)行預(yù)測，表1結(jié)果顯示，來自Sporocytophaga的蛋白質(zhì)大多數(shù)被預(yù)測為主要參與纖維素的前中期降解，而大多數(shù)來自Cohnella的蛋白質(zhì)被預(yù)測為參與纖維素的中后期降解的基因。這進(jìn)一步說明二者在纖維素水解過程中有著不同的功能傾向。另外在Herbaspirillum、Achromobacter、Paenibacillus和Microbacterium4個優(yōu)勢屬中，分別檢測到16、9、2和1個與纖維素降解相關(guān)的蛋白。結(jié)果證明Sporocytophaga和Cohnella兩個核心優(yōu)勢屬在纖維素降解過程中的功能主導(dǎo)作用：二者都能夠產(chǎn)出纖維素酶，Sporocytophaga傾向于參與在纖維素前中期的水解，Cohnella則更傾向于纖維素中后期的水解。實驗室在前期工作中通過進(jìn)一步的分離得到了純化后的Sporocytophaga以及Cohnella菌株，在Sporocytophaga的上清液中僅檢測到內(nèi)切葡聚糖酶的活性，而在Cohnella的上清液檢測到了纖維糊精酶、纖維二糖脫氫酶和β-D-葡萄糖苷酶的活性，此外未檢測到其他纖維素酶的活性[7]，可能是由于其余酶的分泌水平低。結(jié)合前面的結(jié)論可以推測兩種優(yōu)勢菌株對纖維素的降解機(jī)理：在纖維素降解的前中期，纖維素在Sporocytophaga分泌的內(nèi)切葡聚糖的作用下逐漸水解為纖維糊精或纖維二糖，在這一過程中Sporocytophaga為優(yōu)勢菌株源源不斷的分泌內(nèi)切葡聚糖酶，這一過程為后續(xù)酶作用提供了大量的作用末端。而在纖維素降解的中后期，纖維素在Cohnella分泌的纖維糊精酶、纖維二糖脫氫酶和β-D-葡萄糖苷酶的作用下將纖維糊精或纖維二糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，在小分子糖逐漸增多以后Cohnella逐漸變?yōu)閮?yōu)勢菌株，在酶的動態(tài)協(xié)同作用下纖維素逐漸水解完全，這符合纖維素降解的協(xié)同作用理論[21]。

在纖維素的降解過程中，存在菌群間的共生現(xiàn)象，這其中可能包括纖維素降解菌以及可以利用纖維素降解產(chǎn)物(纖維二糖和葡萄糖等)的微生物，在共同作用下協(xié)同降解纖維素，這同之前的研究結(jié)論相似[22-23]。與這一結(jié)論相反的是，在自然環(huán)境中微生物間也存在著更為激烈的競爭關(guān)系，為了爭奪空間與資源，不同物種的豐度呈現(xiàn)出此消彼長的現(xiàn)象，這種自然選擇的結(jié)果也為微生物的多樣性提供了動力[24]。在群落FPDM降解纖維素的過程中也觀察到這種現(xiàn)象，如圖3所示，這意味著群落FPDM中種類繁多的低豐度物種可作為物種儲備庫，用以增加菌群的環(huán)境適應(yīng)性，即當(dāng)環(huán)境變化時，某些低豐度物種豐度升高，甚至可能成為優(yōu)勢物種。

2.4 未知蛋白質(zhì)的功能預(yù)測

應(yīng)用KEGG和CAZy等數(shù)據(jù)庫對蛋白質(zhì)進(jìn)行了注釋，但依然存在101種蛋白未獲得注釋，為挖掘更多潛在的纖維素降解相關(guān)蛋白，基于STEM算法可以將相似功能的蛋白聚類到一起的原則[7]，對未被注釋蛋白進(jìn)行功能預(yù)測，列舉了4種典型變化模式，如表2所示。其中模式4、7屬于下降型，這些蛋白主要在降解纖維素前中期發(fā)揮作用，這其中包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維糊精酶、外切葡聚糖酶、β-D-葡萄糖苷酶等。因此可以推測同一模式的其他兩種未被注釋的蛋白可能與纖維素降解前中期相關(guān)，例如：FPDM.15.1_27877、FPDM.15.3_15711。模式8、13則屬于上升型，這些蛋白主要在降解纖維素中后期發(fā)揮作用，這其中主要包括纖維糊精酶、β-D-葡萄糖苷酶以及纖維二糖脫氫酶等，因此推測這一類型的蛋白質(zhì)很可能與降解纖維低聚糖或二糖有關(guān)例如FPDM.15.2_28070、FPDM.15.1_10860以及FPDM.15.1_23217。

表2 纖維素降解相關(guān)蛋白的4種相對豐度變化模式Tab.2 Four relative abundance patterns of cellulose degradation-related proteins

3 結(jié) 論

本實驗應(yīng)用LC-MS/MS對不同纖維素降解時期的微生物群落FPDM進(jìn)行了差異宏蛋白質(zhì)組水平的分析，探究了在纖維素降解過程中微生物間的協(xié)同作用關(guān)系以及纖維素酶功能，揭示了群落FPDM在纖維素降解過程中宏蛋白質(zhì)組的動態(tài)變化，證實了在群落FPDM降解纖維素的過程中Sporocytophaga和Cohnella是主要作用菌屬，二者均能夠通過分泌纖維素酶來降解纖維素，但有著不同的功能傾向，分析了群落中FPDM能降解的纖維素，并應(yīng)用聚類分析的方法預(yù)測了部分蛋白的功能。為后續(xù)構(gòu)建多組學(xué)水平的纖維素代謝網(wǎng)絡(luò)圖譜提供了蛋白質(zhì)組學(xué)證據(jù)。