顧仁艷，何 麗，張秋梅，宋國(guó)宏，龐保珍

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院，烏魯木齊 830011；2.聊城市中醫(yī)醫(yī)院，山東 聊城 252000）

卵巢功能減退（diminished ovarian reserve，DOR）是指卵巢產(chǎn)生卵子的功能降低，卵細(xì)胞質(zhì)量下降的一類常見(jiàn)的女性內(nèi)分泌臨床疾病[1]。臨床表現(xiàn)程度不一，可表現(xiàn)為無(wú)癥狀，月經(jīng)不調(diào)，高流產(chǎn)率，不孕等[2-3]。隨著病情發(fā)展可進(jìn)一步發(fā)展為卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）與 卵 巢 早 衰（premature ovarian failure，POF）[4]。近年來(lái)卵巢功能減退的發(fā)生率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)和年輕化[5]。卵巢功能減退的影響因素復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚不清楚。基因變化、免疫力降低、外部損傷、傷口感染、放化療、心理因素、生活習(xí)慣等都可導(dǎo)致其發(fā)生發(fā)展[6]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于卵巢功能減退的治療手段缺乏，主要以心理輔導(dǎo)，生活方式改變和脫氫表雄酮、輔酶Q10、褪黑素等藥物使用為主[7]，僅能改善部分臨床癥狀，治療效果不佳，不良反應(yīng)較大。中醫(yī)改善卵巢功能減退療效肯定且無(wú)明顯不良反應(yīng)[8-10]。根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，可將“卵巢功能減退”歸類為“不孕”“月經(jīng)后期”“月經(jīng)過(guò)少”等范疇，主要病機(jī)為腎虛，多以補(bǔ)腎活血為主。本次研究所用滋陰溫陽(yáng)序貫方在臨床治療中可顯著改善患者臨床癥狀，但其作用機(jī)制尚不清楚。本次課題擬通過(guò)研究滋陰溫陽(yáng)序貫方治療卵巢功能減退模型大鼠，從動(dòng)物水平探討滋陰溫陽(yáng)序貫方在卵巢功能減退疾病中的調(diào)節(jié)作用，為研究滋陰溫陽(yáng)序貫方的作用機(jī)制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 8～12 周齡SPF 級(jí) SD 健康雌性大鼠，體質(zhì)量（180±20）g，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心（許可證號(hào)：SCXK-2020-0018），動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：42000600041829，新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理中心倫理委員會(huì)倫理審批號(hào)：IACUC202101113-01。普通級(jí)別安靜環(huán)境中單籠飼養(yǎng)，相對(duì)濕度40%～70%，人工晝夜節(jié)律（白天夜晚各12 h），恒溫（20±2）℃，自由飲水，自由攝食條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。TIANScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；大鼠抗繆勒管激素（AMH）酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒、大鼠雌二醇（E2）酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒、大鼠促卵泡激素（FSH）酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒、大鼠促黃體生成激素（LH）酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢elabscience 公司；IGF1 Antibody、SCF Polyclonal Antibody 購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；微量移液器，酶標(biāo)儀，thermo 購(gòu)自美國(guó)；倒置顯微鏡，OLYMPUS購(gòu)自美國(guó)；低速離心機(jī)，Eppendorf 購(gòu)自美國(guó)；電子天平，賽多利斯購(gòu)自中國(guó)；病理切片機(jī)，Leica RM 購(gòu)自德國(guó)；組織攤烤片機(jī)、包埋機(jī)均購(gòu)自武漢。滋陰溫陽(yáng)序貫方藥滋陰方：熟地黃10 g，山藥10 g，山茱萸10 g，女貞子10 g，旱蓮草10 g，當(dāng)歸10 g，白芍10 g，麥冬10 g，沙參10 g，百合10 g。溫陽(yáng)方：淫羊藿10 g，仙茅10 g，巴戟天10 g，山藥10 g，山茱萸10 g，菟絲子10 g，杜仲10 g，鹿角霜10 g，醋香附10 g，郁金10 g。上述中藥材，均購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院免煎中藥房制備的配方顆粒，廠家：三九醫(yī)藥股份有限公司。臨用前使用雙蒸水配成混懸液備用。滋陰方濃縮顆粒日用藥量為17.651 g，相當(dāng)于原生藥100 g。溫陽(yáng)方濃縮顆粒日用藥量為11.151 g，相當(dāng)于原生藥100 g。參考《中藥藥理研究方法學(xué)》中劑量換算方法“體表面積比”換算動(dòng)物臨床等效劑量，根據(jù)公式所得大鼠給藥劑量，并以此設(shè)置為滋陰溫陽(yáng)序貫方藥中藥組，以10 mL/kg 灌胃。戊酸雌二醇片（補(bǔ)佳樂(lè)）：每片1 mg，由拜耳醫(yī)藥廣州分公司提供，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào) J20150009。參考《中藥藥理研究方法學(xué)》中劑量換算方法“體表面積比”換算動(dòng)物臨床等效劑量，大鼠用量為0.09 mg/kg。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，每日11:00 起對(duì)大鼠進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，連續(xù)10 d，光鏡下觀察，篩選出有規(guī)律動(dòng)情周期為4～5 d 的健康雌性大鼠納入正式實(shí)驗(yàn)。按照隨機(jī)數(shù)表法將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、滋陰溫陽(yáng)序貫方藥組（中藥）和戊酸雌二醇片組（西藥），共4 組，每組8 只。正常對(duì)照組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，予0.9% 氯化鈉溶液2 mL，每日灌胃1 次，連續(xù)14 d。除正常對(duì)照組大鼠外均予雷公藤多甙片75 mg/kg 混懸液2 mL，每日灌胃1 次，連續(xù)14 d，建立卵巢功能減退動(dòng)物模型[11]。各組均于造模后灌胃給藥，正常對(duì)照組、模型組10 mL/kg灌胃0.9%NaCl；中藥組均以10 mL/kg 灌胃給予滋陰溫陽(yáng)序貫方藥，根據(jù)大鼠動(dòng)情周期檔案，按大鼠動(dòng)情間期—?jiǎng)忧榍捌凇獎(jiǎng)忧槠凇獎(jiǎng)忧楹笃陧樞?，模擬人的月經(jīng)周期循環(huán)用藥，以動(dòng)情期為界限，滋陰溫陽(yáng)序貫方藥在動(dòng)情前期先給予滋陰方灌胃，每日灌胃1 次，然后在動(dòng)情后期序貫給予溫陽(yáng)方灌胃；西藥組給予戊酸雌二醇片按0.09 mg/kg 灌胃給藥。各組均每天灌胃給藥1次，連續(xù)2 周。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 一般情況觀察 開(kāi)始給藥后，分別在第1 天、第7 天、第14 天觀察大鼠體質(zhì)量，第14 天計(jì)算卵巢質(zhì)量和卵巢系數(shù)。

1.3.2 病理檢測(cè) 用4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定卵巢組織標(biāo)本，進(jìn)而石蠟包埋、切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining,HE），染色后在光鏡下觀察組織病理變化。

1.3.3 ELISA 法檢測(cè)AMH、FSH、LH、E2的表達(dá)變化 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫；試劑或樣品配制時(shí)，均需充分混勻，并盡量避免起泡。加樣：分別設(shè)正常對(duì)照孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。正常對(duì)照孔加樣品稀釋液100 μL，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100 μL。給酶標(biāo)板覆膜，37 ℃孵育90 min。棄去液體，洗板5 次，每孔加生物素化抗體工作液100 μL，加上覆膜，37 ℃溫育60 min。棄去液體，洗板5 次，每孔加酶結(jié)合物工作液100 μL，加上覆膜，37 ℃溫育30 min，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次。每孔加顯色劑（TMB）100 μL，酶標(biāo)板加上覆膜37 ℃避光孵育15 min。每孔加終止液100 μL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。立即用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度（OD 值）。

1.3.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)IGF-1 和SCF 的表達(dá)變化 切片常規(guī)脫蠟水化，加3% H2O2室溫處理10 min，在枸櫞酸鹽緩沖液（pH=6.0）中微波加熱10 min（92～98 ℃）進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻后5%小牛血清室溫處理10 min，分別滴加1:100 稀釋的IGF-1 和SCF一抗抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，再分別滴加1:200 稀釋的二抗，室溫處理30 min，再加SP（1:100）工作液室溫處理30 min，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片后光鏡下觀察并攝片。

1.3.5 Western blot 法檢測(cè)不同分組中蛋白表達(dá)情況 將少量組織塊置于1～2 mL 勻漿器中球狀部位，加400 μL 裂解液（含PMSF）于勻漿器中進(jìn)行勻漿，重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎，裂解30 min 后，在4 ℃，12 000 r/min 離心5 min，取適當(dāng)稀釋的上清液用BCA 法來(lái)測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度后采用免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)組織內(nèi)IGF-1 和SCF 的表達(dá)，其步驟大致如下：經(jīng)過(guò)灌膠、加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜后，將膜裝入 5% BSA 封閉液，制置室溫?fù)u床 1 h，加5 mL 一抗稀釋液（1:1 000）于4 ℃冰箱過(guò)夜。然后加10 mL 二抗稀釋液（1:50 000）置于搖床上2 h，顯色，在暗室中壓片曝光顯影，結(jié)果用 Quantity-one 圖像軟件分析并進(jìn)行光密度值掃描，分別計(jì)算目的蛋白條帶與GAPDH 強(qiáng)度比值（%）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行單因素方差分析，采用LDS 法進(jìn)行兩兩比較。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 一般情況 本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠體質(zhì)量在給藥第1天、第7 天、第14 天時(shí)間點(diǎn)上西藥組和中藥組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均較對(duì)照組顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表1。第14 天取卵巢組織，大鼠卵巢質(zhì)量和卵巢系數(shù)變化比較，見(jiàn)表2。

表1 大鼠體質(zhì)量變化（，n =8） g

表1 大鼠體質(zhì)量變化（，n =8） g

注：與對(duì)照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

表2 大鼠卵巢質(zhì)量及卵巢系數(shù)變化（，n =8）

表2 大鼠卵巢質(zhì)量及卵巢系數(shù)變化（，n =8）

注：與對(duì)照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

2.2 病理變化 本次研究通過(guò)HE 檢測(cè)不同分組中卵巢組織中卵泡、黃體、顆粒細(xì)胞的病理變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠各級(jí)卵泡數(shù)量較多，竇卵泡形態(tài)飽滿，顆粒細(xì)胞完整。與對(duì)照組比較，模型組小鼠各級(jí)卵泡數(shù)量減少，顆粒細(xì)胞完整度破壞。與模型組比較，西藥組和中藥組小鼠卵巢內(nèi)可見(jiàn)新生卵泡，顆粒細(xì)胞層數(shù)增加，見(jiàn)圖1。

圖1 不同分組大鼠卵巢組織病理變化

2.3 滋陰溫陽(yáng)序貫方調(diào)節(jié)E2、AMH、FSH 和LH 的表達(dá)水平 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在西藥和中藥干預(yù)后，E2與AMH的濃度含量較模型組顯著升高（P＜0.05）。FSH和LH的濃度含量較模型組顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)表3。該數(shù)據(jù)表明，中藥和西藥可以參與調(diào)控E2、AMH、FSH 和LH 的表達(dá)在卵巢退變過(guò)程中發(fā)揮作用。

表3 藥物調(diào)節(jié) E2、AMH、FSH 和 LH 的表達(dá)水平（，n =8）

表3 藥物調(diào)節(jié) E2、AMH、FSH 和 LH 的表達(dá)水平（，n =8）

注：與對(duì)照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

2.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)IGF-1 和SCF 的表達(dá)變化 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，西藥和中藥干預(yù)后，IGF-1 表達(dá)量顯著高于模型組（P＜0.05），見(jiàn)圖2；IGF-1 免疫組織化學(xué)原始圖，見(jiàn)圖3。SCF 表達(dá)量顯著低于模型組（P＜0.05），見(jiàn)圖4。SCF 免疫組織化學(xué)原始圖，見(jiàn)圖5。該數(shù)據(jù)表明，中藥和西藥可以通過(guò)調(diào)控大鼠卵巢中IGF-1 和SCF 表達(dá)在疾病中發(fā)揮作用。

圖2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組大鼠卵巢組織中IGF-1 蛋白表達(dá)情況比較

圖3 IGF-1 免疫組織化學(xué)原始圖

圖4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組大鼠卵巢組織中SCF 蛋白表達(dá)情況比較

圖5 SCF 免疫組織化原始圖

2.5 Western blot 檢測(cè)IGF-1 和SCF 的表達(dá)變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同分組中IGF-1 在西藥和中藥干預(yù)后，IGF-1 蛋白表達(dá)量顯著高于模型組（P＜0.05），見(jiàn)圖6。SCF 蛋白表達(dá)量顯著低于模型組（P＜0.05），見(jiàn)圖7。該數(shù)據(jù)表明，中藥和西藥可以通過(guò)調(diào)控大鼠卵巢中IGF-1 和SCF 表達(dá)在疾病中發(fā)揮作用。

圖6 Western blot 檢測(cè)各組大鼠卵巢組織中IGF-1 表達(dá)變化的比較

圖7 Western blot 檢測(cè)各組大鼠卵巢組織中SCF 表達(dá)變化的比較

3 討論

卵巢功能減退主要表現(xiàn)為卵子數(shù)量和質(zhì)量降低，卵巢功能減退[12]。相關(guān)研究表明，卵巢功能減退的發(fā)生伴隨著激素異常分泌，主要以E2和AMH 的分泌水平降低，F(xiàn)SH 和LH 的分泌水平升高。這些激素的分泌水平可以有效地反映卵巢功能是否正常[13]。本次實(shí)驗(yàn)采用雷公藤多甙片造模，可以通過(guò)抑制卵泡顆粒細(xì)胞的活性來(lái)促使卵巢功能減退的發(fā)生。與對(duì)照組比較，模型組中E2、AMH 降低，F(xiàn)SH 和LH 升高，卵巢指數(shù)降低，卵泡細(xì)胞數(shù)量減少，顆粒細(xì)胞完整性破壞都證明了卵巢功能減退模型成功，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[11,14-15]。

關(guān)于卵巢功能減退的治療一直是臨床的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚無(wú)有效的提高卵巢功能的治療手段，而中醫(yī)的治療效果斐然，相關(guān)研究報(bào)道表明可以提高卵子的數(shù)量和質(zhì)量，改善卵巢功能減退的卵巢功能，但其作用機(jī)制尚不清楚[4,16]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎虛血瘀是導(dǎo)致卵巢功能減退發(fā)生發(fā)展的最主要原因。因此，將補(bǔ)腎活血作為卵巢功能減退的主要治療手段[17]。萬(wàn)凌屹等[18]研究表明補(bǔ)腎活血可以改善卵巢的血液循環(huán)、提高卵巢功能，從而改善卵巢功能減退的臨床癥狀。本次研究采用的滋陰溫陽(yáng)序貫方以補(bǔ)腎活血為主，通過(guò)對(duì)模型鼠的干預(yù)治療后發(fā)現(xiàn)，大鼠激素水平得到明顯改善，E2、AMH 升高，F(xiàn)SH 和LH 降低，卵巢指數(shù)升高，卵泡細(xì)胞數(shù)量增加，顆粒細(xì)胞層數(shù)較豐富，且與戊酸雌二醇片的治療效果相當(dāng)，表明了滋陰溫陽(yáng)序貫方能夠有效增加卵泡數(shù)量和質(zhì)量，改善激素分泌和卵巢功能。

SCF 是一類由卵巢分泌的細(xì)胞因子，對(duì)卵巢的發(fā)育發(fā)揮調(diào)控作用[19]。SCF 表達(dá)水平的異常升高會(huì)刺激誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞的增殖與分化，對(duì)卵泡的早期發(fā)育起到重要的調(diào)控作用[20]。有研究報(bào)道表明，SCF 的高表達(dá)促進(jìn)顆粒細(xì)胞的調(diào)控作用，引發(fā)卵巢功能減退[19]。IGF-1 是一類干細(xì)胞分泌因子，在卵巢中起到促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)的功能[21]。于佳等[22]研究表明，IGF-1 的高表達(dá)可以促進(jìn)原始卵泡發(fā)育，從而改善卵巢功能。本次研究結(jié)果顯示，模型組的SCF 表達(dá)量升高，IGF-1 表達(dá)量降低，與上述報(bào)道一致。在滋陰溫陽(yáng)序貫方干預(yù)治療后，SCF 的表達(dá)量降低，IGF-1 的表達(dá)量升高，且與戊酸雌二醇片的治療效果相當(dāng)，表明了滋陰溫陽(yáng)序貫方能夠有效調(diào)控卵巢分泌細(xì)胞因子的能力，改善卵巢功能。

本實(shí)驗(yàn)所運(yùn)用的“滋陰溫陽(yáng)序貫方”是以國(guó)醫(yī)大師夏桂成教授的“調(diào)周法”[23]為理論指導(dǎo)，根據(jù)月經(jīng)周期不同階段的陰陽(yáng)消長(zhǎng)轉(zhuǎn)化和氣血盈虧變化規(guī)律，把握現(xiàn)代助孕手段的中醫(yī)藥治療靶點(diǎn)及時(shí)機(jī)的不同，同時(shí)結(jié)合新疆“燥邪”偏盛地域特點(diǎn)創(chuàng)新提出的，以中醫(yī)“金水相生”“肝腎同源”的基礎(chǔ)理論為指導(dǎo)，簡(jiǎn)化用藥方案，肺、肝、腎三臟同治。本研究結(jié)果表明，滋陰溫陽(yáng)序貫方可以通過(guò)增加卵巢系數(shù)、卵泡數(shù)量和質(zhì)量，改善激素分泌和細(xì)胞因子表達(dá)，進(jìn)而改善卵巢功能。