劉小琳,楊 浩,任天鳳 (信宜市婦幼保健院,廣東 信宜 525300)
沙眼衣原體(CT)為性傳播疾病的主要病原體,目前我國CT感染呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì),其根本原因是CT感染后抗生素使用不合理所導(dǎo)致的,前列腺炎、附睪炎、尿道炎是男性CT感染后的主要癥狀,而子宮內(nèi)膜炎、宮頸炎、盆腔炎是女性CT感染后的主要癥狀,部分患者還會(huì)出現(xiàn)肛周炎、異位妊娠、不孕癥等并發(fā)癥,對(duì)患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重的影響[1],因此,及早、快速、準(zhǔn)確地診斷CT感染對(duì)于其治療和改善預(yù)后具有積極意義。傳統(tǒng)的病原微生物檢測(cè)方法有涂片、培養(yǎng)、免疫學(xué)等技術(shù),其檢出效果差,需要的時(shí)間長(zhǎng),增加了臨床診斷的難度[2]。近年來,隨著檢驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展,膠體金標(biāo)法和熒光定量PCR法已成為臨床上廣泛用于檢測(cè)CT感染的方法,但其靈敏度和特異度各不相同[3-4],本文旨在對(duì)比分析熒光定量PCR法和免疫膠體金技術(shù)對(duì)信宜地區(qū)沙眼衣原體的檢測(cè)效果,為今后臨床選擇合適的方法檢測(cè)CT感染提供理論依據(jù)。
1.1一般資料:選取2019年1月~2020年5月信宜地區(qū)180例疑似沙眼衣原體感染患者作為研究對(duì)象,納入標(biāo)準(zhǔn):信宜地區(qū)戶籍或在信宜地區(qū)常住3年以上的人群,簽署知情同意書,自愿參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn):嚴(yán)重肝腎功能異常,心腦血管異常,精神障礙,心理障礙,傳染病史,凝血功能障礙患者。其中男67例,女113例,年齡21~32歲,平均(28.34±5.21)歲,細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)結(jié)果顯示:陽性170例,陰性10例。本研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。
1.2標(biāo)本采集:設(shè)備:上海宏石提供的 SLAN-96S 熒光定量 PCR儀。
樣本采集:男性:對(duì)尿道局部皮膚全面消毒,反轉(zhuǎn)包皮,使用專用的拭子采集標(biāo)本,若取樣尿液則首先清洗包皮后留取樣本;女性:局部皮膚全面消毒,將棉拭子插入患者尿道約2 cm深度,若是外陰病灶則使用棉拭子提取周圍分泌物,陰道分泌物也采用相同的方法留取。每位患者留取3份樣本,分別用于細(xì)菌培養(yǎng)、熒光定量PCR檢測(cè)、免疫膠體金標(biāo)法檢測(cè)。
檢測(cè)試劑:沙眼衣原體抗原檢測(cè)試劑[生產(chǎn)廠家:艾康生物技術(shù)(杭州)有限公司,批準(zhǔn)文號(hào):國食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2010第3400386號(hào)],沙眼衣原體核酸檢測(cè)試劑(生產(chǎn)廠家:廣州凱普醫(yī)藥科技有限公司,批準(zhǔn)文號(hào):國械注準(zhǔn)20143401937)。
熒光定量PCR法:EP管中加入無菌生理鹽水1 ml并搖勻,伸入采集管底部吸取臨床樣本0.8 ml加入1.5 ml離心管中;13 000 r/min離心90 s,棄上清(可保留殘液約20 μl)。加入0.5 ml細(xì)胞保存液振蕩重懸細(xì)胞,13 000 r/min離心90 s,盡量去盡全部上清。每樣本加入50 μl細(xì)胞裂解液,充分振蕩重懸細(xì)胞,煮沸10 min。13 000 r/min離心10 min,取上清(上清為釋放的DNA)2 μl作為PCR擴(kuò)增模板,加入反應(yīng)試管(含PCR反應(yīng)液)中,設(shè)定陰性對(duì)照和陽性對(duì)照各一管,設(shè)定PCR反應(yīng)體系,擴(kuò)增結(jié)束分析軟件自動(dòng)分析,陽性:CT值>37。
膠體金法:根據(jù)沙眼衣原體抗原檢測(cè)試劑[生產(chǎn)廠家:艾康生物技術(shù)(杭州)有限公司,批準(zhǔn)文號(hào):國食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2010第3400386號(hào)]說明書實(shí)施檢測(cè),裂解樣本獲取沙眼衣原體抗原,將裂解后含有抗原的溶液滴入加樣孔內(nèi),20 min后讀取結(jié)果,陽性:測(cè)試區(qū)和質(zhì)控區(qū)均出現(xiàn)紫紅色條帶。
培養(yǎng)法:以細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn),培養(yǎng)方法如下:采用McCoy 細(xì)胞作為宿主細(xì)胞,從-80℃的冰箱中取出標(biāo)本,并將其放置在37℃水浴箱中,取0.2 ml接種在McCoy 細(xì)胞上,離心60 min后取出放置在培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中2 h將上清液去除,重新加入1 ml衣原體生長(zhǎng)培養(yǎng)基并放置在培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中培養(yǎng)48 h,將培養(yǎng)板取出,烘干后加入甲醇固定15 min,碘染色后將其倒置在顯微鏡下觀察McCoy 細(xì)胞胞漿內(nèi)形成的衣原體包涵體,陽性:≥2個(gè)包涵體/孔。
1.3觀察指標(biāo):以細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算熒光定量PCR法、膠體金標(biāo)法檢測(cè)沙眼支原體的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、準(zhǔn)確度及Kappa值,并進(jìn)行比較。
1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)與χ2檢驗(yàn)。
以細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn),熒光定量PCR法診斷CT感染的靈敏度、陰性預(yù)測(cè)值、準(zhǔn)確度、Kappa值顯著高于免疫膠體金法,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);兩種方法檢測(cè)CT感染特異度、陽性預(yù)測(cè)值比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、表2。
表1 兩種方法檢測(cè)沙眼衣原體效果比較(%)
表2 兩種方法檢測(cè)沙眼衣原體效果比較[n(%),n=180]
近年來沙眼衣原體(CT)感染的患者逐年上升,受到全球的廣泛重視,截至2020年全球新發(fā)感染CT患者達(dá)到3億,生殖道沙眼衣原體感染逐漸升高[5]。無癥狀CT感染患者中男性與女性比例為3∶7,若不能及時(shí)診斷和治療極易發(fā)生逆行感染,男性出現(xiàn)前列腺炎、附睪炎、不育癥,而女性極易發(fā)生輸卵管炎、盆腔炎,妊娠期婦女容易流產(chǎn)、死胎,因此,對(duì)于CT感染應(yīng)及早診斷并給予有效的治療[6]。沙眼衣原體是臨床上常見的泌尿生殖道感染的病原體,免疫膠體金法、涂片法、細(xì)菌培養(yǎng)法是目前臨床上常用的檢測(cè)方法,其中細(xì)菌培養(yǎng)法是臨床上公認(rèn)的檢測(cè)CT感染的金標(biāo)準(zhǔn),但是該方法時(shí)間長(zhǎng),而常用的方法敏感性差、可靠性差也不能為臨床上治療提供重要的依據(jù),限制了其在臨床上應(yīng)用[7]。
熒光定量PCR法可對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增,雜交特異分子,其結(jié)合了化學(xué)熒光發(fā)光法,在封閉的環(huán)境中進(jìn)行,可通過計(jì)算機(jī)的調(diào)控實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)和自動(dòng)化檢測(cè),提高檢測(cè)的靈敏度及準(zhǔn)確度,還能縮短檢測(cè)的時(shí)間[8],隨著熒光定量PCR技術(shù)的不斷發(fā)展,其被廣泛應(yīng)用在基因檢測(cè)中,并且在增加基因產(chǎn)物后該方法的熒光信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng),因此,每次循環(huán)后需要進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集,從而獲取熒光擴(kuò)增曲線,進(jìn)而提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度[9]。本研究顯示,熒光定量PCR法檢測(cè)CT感染的靈敏度、陰性預(yù)測(cè)值、準(zhǔn)確度、Kappa值顯著高于膠體金標(biāo)法,說明熒光定量PCR法檢測(cè)CT感染的準(zhǔn)確性更高,當(dāng)標(biāo)本中衣原體抗原含量較低的情況下,此時(shí)采用免疫膠體金技術(shù)檢測(cè)可能會(huì)呈現(xiàn)假陰性,靈敏度較低,而熒光定量PCR法檢測(cè)的效果則不受抗原含量的影響,樣品中即使存在極低含量的病原體基因,熒光定量PCR法也可以通過擴(kuò)增檢測(cè)到。免疫膠體金技術(shù)檢測(cè)CT感染反映的是機(jī)體對(duì)于CT的免疫反應(yīng)狀態(tài),不能判定是既往感染還是當(dāng)前感染,而熒光定量PCR法則能夠真實(shí)的反映CT的存在和目前的繁殖程度,可有效判斷目前CT是既往感染還是現(xiàn)癥感染,為臨床治療方案的制訂提供依據(jù)[10]。熒光定量PCR法和免疫膠體金技術(shù)對(duì)于CT感染的檢測(cè)各自存在優(yōu)缺點(diǎn),但是熒光定量PCR技術(shù)操作時(shí)間短及檢測(cè)時(shí)間更短,靈敏度、準(zhǔn)確度更高,并且熒光定量PCR法可對(duì)病原體進(jìn)行定量檢測(cè),不但能夠提高診斷的價(jià)值,還可用于流行病學(xué)的監(jiān)測(cè)與調(diào)查[11]。
綜上所述,與免疫膠體金法相比,熒光定量PCR法檢測(cè)CT感染的效果更優(yōu),不但縮短時(shí)間,便于操作,還可提高檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確度,為臨床診治提供有效依據(jù)。