楊貞忞,袁通穗 (.貴陽(yáng)市口腔醫(yī)院口腔頜面外科,貴州 貴陽(yáng) 55000;貴陽(yáng)市口腔醫(yī)院牙周科，貴州 貴陽(yáng) 55000)

慢性牙周炎是指發(fā)生在牙齦、牙骨質(zhì)等牙齒支持組織的疾病[1]，其病理過(guò)程主要是由牙菌斑形成的齦上牙石或齦下牙石對(duì)牙周組織產(chǎn)生的漸進(jìn)并持續(xù)的炎性破壞[2]。有研究指出，在我國(guó)牙周炎是成人失牙的主要原因，并且患病率高于齲病，這極大降低了患者的生活質(zhì)量并增加了社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。由于目前臨床上缺乏有效的治療手段，臨床上更加重視如何預(yù)防慢性牙周炎的發(fā)生及其發(fā)展[4]。但慢性牙周炎的診斷方法敏感率較低，故有大量研究通過(guò)對(duì)慢性牙周炎患者齦溝液中的一些炎癥因子或者相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)，以期提高該病診斷陽(yáng)性率和判斷其嚴(yán)重程度[5-6]。而齦溝液存在不易采集以及容易受到污染等因素，而導(dǎo)致該方法存在一定局限性，單鏈非編碼微小RNA(miRNA)已經(jīng)在大量研究中證實(shí)在診斷、預(yù)測(cè)疾病的預(yù)后具有一定的優(yōu)勢(shì)[7-8]。本研究前期通過(guò)生物信息學(xué)方法，在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘在慢性牙周炎患者的唾液中表達(dá)明顯增高的miR-22-3p和miR-378a-3p，后期通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，擬為慢性牙周炎患者的早期診斷提供一定依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取2019年1月～2021年6月于貴陽(yáng)市口腔醫(yī)院牙周科就診的患者90例，其中牙周組織健康者22例為對(duì)照組，慢性牙周炎68例為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18周歲；②除第三磨牙外余留牙≥20顆，其中有4顆磨牙；③無(wú)糖尿病等系統(tǒng)性疾?。虎軣o(wú)正畸治療史；⑤6個(gè)月內(nèi)未接受牙周治療；⑥女性未妊娠，未服避孕藥，且不在哺乳期、月經(jīng)期。本研究經(jīng)貴陽(yáng)市口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。對(duì)照組中男13例，女8例；年齡18～50歲，平均32歲。觀察組又分為輕度慢性牙周炎組(23例，男13例，女10例；年齡18～52歲，平均35歲)、中度慢性牙周炎組(22例，男8例，女14例；年齡33～55歲，平均41歲)、重度慢性牙周炎組(23例，男13例，女10例；年齡39～60歲，平均49歲)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集：觀察組所有患者在治療前進(jìn)行唾液收集，對(duì)照組在體檢時(shí)進(jìn)行唾液收集，在研究對(duì)象晨起后用表面有2%枸櫞酸的棉簽擦拭口腔，收集唾液約1 ml，在4℃離心機(jī)中3 000 r/min離心15 min，取上清液放置在-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2檢測(cè)方法：唾液miR-22-3p、miR-378a-3p的含量均采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(RT-PCR)進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自上海百蕊生物科技有限公司，RT-PCR測(cè)量?jī)x購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，小型高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司。首先，提取唾液中總RNA，采用去除基因組反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將待測(cè)標(biāo)本反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用 RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)。本研究結(jié)果均采用2-ΔΔCt法換算miRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1觀察組和對(duì)照組miR-22-3p、miR-378a-3p水平比較:觀察組唾液中miR-22-3p、miR-378a-3p含量水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組miR-22-3p、miR-378a-3pp含量比較

2.2觀察組各亞組miR-22-3p、miR-378a-3p水平比較：重度慢性牙周炎組患者的唾液中miR-22-3p、miR-378a-3p水平高于輕度和中度慢性牙周炎組，中度慢性牙周炎組miR-22-3p、miR-378a-3p水平高于輕度慢性牙周炎組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 三組miR-22-3p、miR-378a-3pp含量比較

2.3觀察組miR-22-3p、miR-378a-3p含量相關(guān)性：相關(guān)性分析結(jié)果顯示，慢性牙周炎患者中，miR-22-3p與 miR-378a-3p水平呈正相關(guān)(r=0.467，P=0.019)。

2.4ROC曲線分析:采用ROC曲線評(píng)價(jià)血清 miR-22-3p與 miR-378a-3p及兩者聯(lián)合對(duì)慢性牙周炎的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示miR-22-3p與 miR-378a-3p聯(lián)合曲線價(jià)值要優(yōu)于兩者單獨(dú)診斷價(jià)值。見表3、圖1。

表3 miR-22-3p、miR-378a-3p及兩者聯(lián)合檢測(cè) ROC曲線下面積

圖1 miR-22-3p、miR-378a-3p及兩者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)慢性牙周炎診斷的 ROC曲線

3 討論

慢性牙周炎的病理生理特征為患者牙周組織存在持續(xù)的慢性炎癥反應(yīng)，這不僅損害牙齒支持組織，部分病情嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致牙齒脫落[9]。有研究甚至指出，隨著炎性介質(zhì)和齦下的細(xì)菌在口腔中擴(kuò)散，使得患者罹患部分癌癥的風(fēng)險(xiǎn)也隨之急劇增高[10]。因此，臨床上亟需通過(guò)敏感指標(biāo)對(duì)于慢性牙周炎進(jìn)行早期診斷和對(duì)其病情嚴(yán)重程度進(jìn)行早期預(yù)測(cè)，從而通過(guò)盡早干預(yù)，以期提高慢性牙周炎的治療效果和預(yù)后。目前臨床上已有不少相關(guān)研究證實(shí)，患者外周血清或齦溝液中的白細(xì)胞介素同慢性牙周炎的疾病嚴(yán)重程度存在一定關(guān)系[11-12]。但目前臨床中仍無(wú)慢性牙周炎的特異性唾液標(biāo)志物。miRNA是一類小分子非編碼RNA，其參與腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)和炎性疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展[13]。國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)大鼠牙周炎模型中外周血中miR-207、miR-495 表達(dá)上調(diào)[14]，提示miRNA同牙周炎存在一定的關(guān)系，miRNA 極有可能成為慢性牙周炎新的診斷標(biāo)志物，本研究擬通過(guò)檢測(cè)患者唾液中敏感miRNA含量來(lái)診斷慢性牙周炎或者判斷其嚴(yán)重程度。

miR-22-3p被發(fā)現(xiàn)在冠心病動(dòng)物模型中，通過(guò)靶向抑制Notch通路抑制炎性細(xì)胞因子的分泌[15]，提示miR-22-3p同炎性反應(yīng)關(guān)系密切。通過(guò)對(duì)68例慢性牙周炎患者的唾液標(biāo)本檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-22-3p含量較正常健康患者明顯升高，而且隨著慢性牙周炎病情的加劇其含量進(jìn)一步增高，說(shuō)明miR-22-3p同牙周炎中的炎性反應(yīng)存在一定的關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-378a-3p通過(guò)GSK-3β /β-catenin信號(hào)通路來(lái)調(diào)控口腔鱗狀細(xì)胞癌的增殖和凋亡[16]。本研究結(jié)果顯示慢性牙周炎患者的唾液中的miR-378a-3p含量升高，且同慢性牙周炎的病情呈正相關(guān)。此外，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)miR-22-3p和miR-378a-3p兩者含量呈正相關(guān)關(guān)系。上述結(jié)果表明miR-22-3p和miR-378a-3p可能顯著增加慢性牙周炎的患病風(fēng)險(xiǎn)，可能通過(guò)加劇炎性反應(yīng)從而加劇慢性牙周炎的發(fā)生和發(fā)展。ROC曲線結(jié)果進(jìn)一步顯示miR-22-3p和miR-378a-3p兩者聯(lián)合對(duì)于慢性牙周炎的診斷價(jià)值要優(yōu)于兩者分別單獨(dú)診斷，這為臨床上診斷慢性牙周炎以及判斷其病情嚴(yán)重程度提供一定的理論基礎(chǔ)，但miR-22-3p和miR-378a-3p同慢性牙周炎患者預(yù)后的關(guān)系以及具體作用機(jī)制應(yīng)進(jìn)一步研究。