宋志勇，穆亞敏 (湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 湘潭 411104)

阿爾茨海默病(AD)是常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，好發(fā)于老年人群，以認(rèn)知障礙、記憶障礙為主要臨床表現(xiàn)，對患者的生存質(zhì)量以及家庭和社會帶來嚴(yán)重影響。迄今為止，AD發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，仍然缺乏理想的治療手段和藥物[1-2]。隨著研究深入，免疫炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激學(xué)在AD發(fā)病機(jī)制的作用日益受到重視，對開發(fā)具有抗炎、抗氧化等多途徑作用特點(diǎn)的中藥復(fù)方，在防治AD方面將極具優(yōu)勢和前景[3-5]。遵循中醫(yī)辨證理念組成的地黃飲子具有補(bǔ)腎陽、滋腎陰及化痰開竅等作用，在多項研究中已取得較好的臨床療效[6-7]。但地黃飲子對氧化應(yīng)激及炎性因子的影響暫不清楚，鑒于此，本實驗旨在揭示地黃飲子對AD模型小鼠海馬組織氧化應(yīng)激及炎性因子表達(dá)的影響，為闡明地黃飲子的治療機(jī)制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1實驗材料：3個月月齡SPF級PP/PS1雙轉(zhuǎn)基因雄性小鼠作為AD模型動物50只，體重在30～40 g之間，地黃飲子(校附屬醫(yī)院藥劑科提供)，吡拉西坦(石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H13021787)。白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，超敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(北京北方生物科技有限公司)。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，谷胱甘肽過氧化物(GSH-Px)，過氧化氫酶(CAT)，丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。Morris水迷宮及視頻分析系統(tǒng)(眾實迪創(chuàng))，離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，酶標(biāo)儀(美國 BIO-RAD公司 ) 電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)及相關(guān)手術(shù)器械等。本次研究經(jīng)過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查同意。

1.2方法

1.2.1分組及給藥方法：將50只AD小鼠隨機(jī)分為安慰組(等體積的蒸餾水)、地黃飲子低劑量組(生藥量為0.8 g/kg)、地黃飲子中劑量組(生藥量為1.6 g/kg)、地黃飲子湯高劑量組(生藥量為3.2 g/kg)、腦復(fù)康(吡拉西坦)組(0.63 g/kg)。10只/組，1次/d，持續(xù)4 w。地黃飲子方劑組成：肉蓯蓉9g、巴戟天9 g、熟地黃10 g、山茱萸9 g、附子6 g、肉桂6 g、麥冬6 g、石斛9 g、五味子6 g、遠(yuǎn)志6 g、石菖蒲6 g、茯苓6 g、薄荷5 g、生姜9 g、大棗15 g。按照人和動物體表面積折算的等效劑量比率表換算高、中、低劑量。分別相當(dāng)于60 kg成人臨床用量等效量的23.3倍、5.8倍，醫(yī)院煎藥房按照要求煎煮成生藥含量為3.456 g/ml、1.728 g/ml。

1.2.2指標(biāo)檢測：①應(yīng)用Morris水迷宮試驗連續(xù)觀察各組AD小鼠在第1周、第2周、第3周、第4周的認(rèn)知功能變化，具體操作方法：練小鼠在一個直徑為80 cm的水池尋找到水下的隱藏平臺。實驗共4 d，小鼠分別從四個象限面朝池壁放入水池，60 s內(nèi)找到平臺的時間記錄為逃避潛伏期[8]。②炎性因子水平測定:小鼠行為學(xué)實驗結(jié)束后，禁食24 h，斷頭法處死，準(zhǔn)確稱取海馬組織后按照1∶9加入預(yù)冷至4℃的生理鹽水，勻漿后取上清，分裝、凍存。采用ELISA測定各組小鼠腦組織IL-1、IL-6、TNF-α以及hs-CRP含量。操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書方法。試劑盒加樣200 μl/孔，37℃水浴2 h，加入羊抗小鼠IgG HRP，37℃水浴1 h，加入TMB顯色液，避光震蕩孵育15 min顯色后加終止液，于490 nm處波長記錄讀數(shù)。③氧化應(yīng)激水平測定:另取小鼠海馬組織，制成勻漿，采用ELISA法測定SOD、GSH-Px、CAT以及MDA含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書方法進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較:與安慰組比較，地黃飲子低、中、高劑量各組及腦復(fù)康組逃避潛伏期時間在治療1 w、2 w、3 w、4 w后均逐漸縮短(P<0.05)，且地黃飲子低、中、高劑量組呈劑量效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)。地黃飲子組高劑量組逃避潛伏期時間明顯低于腦復(fù)康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較

2.2各組小鼠炎性因子水平比較:與安慰組相比，地黃飲子低、中、高劑量各組海馬組織IL-1、IL-6、TNF-α以及hs-CRP水平呈劑量效應(yīng)的下降(P<0.05)，且地黃飲子高劑量組明顯低于腦復(fù)康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠炎性因子水平比較

2.3各組小鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較:與安慰組相比，地黃飲子低、中、高劑量各組SOD、GSH-Px以及CAT水平呈劑量效應(yīng)的增加(P<0.05)，MDA呈現(xiàn)劑量效應(yīng)的降低(P<0.05)，且地黃飲子高劑量組與腦復(fù)康組呈顯著性差異(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

3 討論

AD是以認(rèn)知能力減退為主要特征的老年性癡呆，β-淀粉樣蛋白(Aβ)被認(rèn)為是AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，Aβ42聚集導(dǎo)致炎性反應(yīng)和氧化損傷，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡和癡呆[8]。迄今為止，尚缺乏有效的治療藥物和手段，AD屬于中醫(yī)“癡呆”范疇，既往有學(xué)者對中醫(yī)藥治療AD進(jìn)行了大量的研究[9]。基本病機(jī)為腎精虧虛，痰瘀阻絡(luò)，因此治療AD應(yīng)以補(bǔ)腎填精兼化瘀祛痰為治法。

地黃飲子原名地黃飲，始載于金元四大家之首劉完素的《黃帝素問宣明方》，在原方基礎(chǔ)上加薄荷，增加大棗、生姜調(diào)和營衛(wèi)的作用，進(jìn)而增強(qiáng)了滋陰腎、補(bǔ)腎陽及開竅化痰的功效。既往研究顯示地黃飲子在AD治療方面具有突出優(yōu)勢[10-11]。但在治療機(jī)制上尚有許多未解之謎。故本研究從炎性反應(yīng)和氧化損傷這兩類機(jī)制探討地黃飲子的藥理效應(yīng)。本研究首先應(yīng)用Morris水迷宮試驗評價了地黃飲子三種劑量對空間記憶能力的影響，并用腦復(fù)康作為參照藥物，結(jié)果顯示，隨著地黃飲子劑量增加，高劑量在第4周的潛伏期最短，且優(yōu)于腦復(fù)康組，表明高劑量地黃飲子可以明顯改善模型小鼠的空間記憶能力。接下來本文對各組炎性因子水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)地黃飲子低、中、高劑量各組海馬組織IL-1、IL-6、TNF-α以及hs-CRP水平呈劑量效應(yīng)下降，且高劑量地黃飲子下降效果最好。表明高劑量地黃飲子可以明顯改善模型小鼠海馬組織的炎性因子水平，減輕炎性反應(yīng)。IL-1、IL-6和TNF-α是重要的促炎細(xì)胞因子，可以介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)，可誘導(dǎo)急性相反應(yīng)蛋白在神經(jīng)炎性斑塊中聚集，也可激活補(bǔ)體損傷神經(jīng)細(xì)胞[12-13]。hs-CRP是一種敏感的非特異性炎性標(biāo)志物，但目前就其在AD中的含量變化尚未有定論[14]。提示抗炎是地黃飲子下改善模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用機(jī)制之一。氧化應(yīng)激發(fā)生于AD 疾病進(jìn)程的早期，氧化應(yīng)激學(xué)說在AD 的發(fā)生發(fā)展中起舉足輕重的作用。SOD、CAT和GSH-Px是天然存在的氧自由基清除劑，其活性的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。MDA是脂質(zhì)過氧化的主要降解產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性，其含量的多少間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[15]。本研究結(jié)果顯示高劑量組OD、CAT和GSH-Px含量增加最為明顯，MDA減少最為明顯，可見高劑量地黃飲子具有強(qiáng)大機(jī)體清除氧自由基的能力，通過改善氧化應(yīng)激實現(xiàn)改善學(xué)習(xí)記憶能力。

綜上所述，高劑量地黃飲子可改善AD 模型小鼠的空間記憶能力，其機(jī)制可能與降低腦組織氧化應(yīng)激水平及炎癥因子表達(dá)有關(guān)。