王浩宇，劉威，鄭瞾鈺，杜金雪，張鳳祥，閆永慶

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

大苞萱草(Hemerocallis middendorfiiTrautv.et Mey.)系阿?；?Asphodelaceae)萱草屬(HemerocallisL.)多年生宿根花卉，在我國(guó)東北三省分布較廣。大苞萱草春季萌發(fā)早，開(kāi)花早，花大色艷，具芳香氣味[1]，耐寒性強(qiáng)；其根系比較發(fā)達(dá)，對(duì)土壤的要求不嚴(yán)格，具較強(qiáng)的耐旱和耐鹽堿能力，在寒地城市園林綠化中具有很好的應(yīng)用前景。

氮被稱作是植物的“生命元素”，植物體內(nèi)的氮形態(tài)和氮代謝相關(guān)酶活性能夠直接反映氮代謝情況。鹽脅迫下不同種植物由于生理特征存在較大差異，氮代謝途徑和效率也存在差異。研究顯示，黃瓜和番茄在鹽脅迫下的氮素吸收能力、氮代謝能力以及對(duì)硝酸鹽的吸收能力均會(huì)受到不同程度的抑制[2，3]。NaCl脅迫能夠抑制番茄幼苗的硝酸還原酶(nitrate reductase，NR)、氨同化過(guò)程中的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)以及谷氨酸合酶(glutamate synthase，GOGAT)活性，降低相關(guān)基因的表達(dá)水平[4]；但使桑樹(shù)幼苗中的GS與GOGAT活性顯著上升[5]，使鰻草(Zostera marina)的NR基因表達(dá)有所上調(diào)[6]。在鹽脅迫下，耐鹽蕎麥的NO3-含量、NR活性顯著高于鹽敏感品種[7]，不同品種抗性甜菜也具備這一特點(diǎn)[8]。這表明植物響應(yīng)鹽脅迫的氮代謝形式和機(jī)理非常復(fù)雜[9，10]。目前，關(guān)于鹽脅迫影響植物氮代謝的研究不斷增多，但有關(guān)鹽脅迫下大苞萱草氮代謝及相關(guān)基因表達(dá)變化的報(bào)道甚少。

鈣作為第二信使，在植物響應(yīng)各種非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用[11]。同時(shí)，植物能夠?qū)⑽盏拟}轉(zhuǎn)化為膜保護(hù)劑，提高細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度，穩(wěn)定膜結(jié)合蛋白質(zhì)量，平衡各種活性酶。研究證實(shí)，在植物遭受鹽脅迫時(shí)，在根部施加一定濃度的外源鈣，不僅能夠補(bǔ)充植物生長(zhǎng)發(fā)育所需的鈣、加強(qiáng)植物礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)均衡性，而且能夠提高質(zhì)膜穩(wěn)定性，使鈣信號(hào)系統(tǒng)正常運(yùn)行，維持細(xì)胞內(nèi)離子的平衡狀態(tài)[12]。魏翠果等[13]研究發(fā)現(xiàn)施加一定濃度的外源Ca2+可有效提高鹽脅迫下馬鈴薯的NR和GS活性。外源Ca(NO3)2在為植物提供Ca2+和NO3-的同時(shí)，NO3-還可以通過(guò)抑制植物在鹽脅迫下對(duì)Cl-的吸收而降低鹽害[2]。外源鈣緩解NaCl脅迫的機(jī)制研究在酸棗[14]、番茄幼苗[15]、甘薯幼苗[16]上已有報(bào)道，但在萱草上的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究以大苞萱草為試驗(yàn)材料，基于預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，在300 mmol·L-1NaCl脅迫下研究施加10 mmol·L-1Ca(NO3)2對(duì)葉片中NR、GS、GOGAT活性及氮代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響，探索大苞萱草耐鹽性與氮代謝之間的關(guān)系，為其耐鹽基因研究、耐鹽品種培育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2021年4月，將大苞萱草幼苗定植于口徑15 cm、深20 cm的塑料花盆中，以原土為培養(yǎng)基質(zhì)，置于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗(yàn)站智能溫室中，在25℃、光照12 h的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。2021年6月，待幼苗長(zhǎng)出6～8片真葉后，從中選擇生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)較好、長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗作為樣本，用凈水反復(fù)清洗根部泥土，之后在相同花盆中裝入純凈河沙作為基質(zhì)，按照每盆一株定植幼苗，并每2 d使用1/2劑量Hoagland全營(yíng)養(yǎng)液澆灌幼苗樣本。待20 d緩苗期后，施加NaCl和Ca(NO3)2進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)處理。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理方法

通過(guò)預(yù)試驗(yàn)，設(shè)計(jì)不同濃度(0、100、200、300、400 mmol·L-1)NaCl脅迫處理，篩選出300 mmol·L-1作為大苞萱草的重度鹽害濃度用于后續(xù)試驗(yàn)。在此基礎(chǔ)上，再設(shè)計(jì)施加不同濃度(0、10、15、20 mmol·L-1)Ca(NO3)處理，篩選出10 mmol·L-1為外施Ca(NO3)2緩解鹽脅迫對(duì)大苞萱草傷害的最適濃度。

基于預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)本試驗(yàn)處理:①CK，不進(jìn)行NaCl和Ca(NO3)2處理；②Ca，10 mmol·L-1Ca(NO3)2處理；③Na，300 mmol·L-1NaCl處理；④NCa，300 mmol·L-1NaCl+10 mmol·L-1Ca(NO3)2處理。每個(gè)處理5盆，每盆為一個(gè)重復(fù)。考慮到一次性加鹽所致短時(shí)間高濃度脅迫會(huì)嚴(yán)重傷害植株，本研究以100 mmol·L-1作為NaCl脅迫的起始濃度，然后每天遞增100 mmol·L-1，待達(dá)到預(yù)設(shè)濃度后再進(jìn)行試驗(yàn)處理，連續(xù)處理5 d。為維持處理期間NaCl濃度不變，按照細(xì)沙持水量的2倍作為單次澆灌的基準(zhǔn)量。處理結(jié)束后的第二天，采集大苞萱草葉片，用去離子水洗凈、吸水紙吸干表面水分后，用錫紙包裹，在液氮中速凍，并置于-80℃冰箱中貯存，用于各指標(biāo)測(cè)定。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量及硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶活性的測(cè)定均參考張以順等[17]的方法；谷氨酸合酶活性的測(cè)定參考王小純等[18]的方法。

氮代謝相關(guān)基因表達(dá)量:采用改良Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，然后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。qRT-PCR反應(yīng)體系:SYBR GREEN 10 μL，Primer-F 1 μL，Primer-R 1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL。所測(cè)氮代謝相關(guān)基因及所用引物見(jiàn)表1。

表1 基因定量表達(dá)引物序列

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和方差分析，利用GraphPad Prism 8軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源Ca(NO3)2對(duì)鹽脅迫下大苞萱草葉片中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量的影響

由圖1可知，與CK相比，外源Ca(NO3)2處理的大苞萱草葉片中NO3--N含量顯著升高，是CK的1.61倍(P＜0.05)；NaCl脅迫顯著降低了大苞萱草葉片中的NO3--N含量，為CK的72.7%(P＜0.05)；NaCl+Ca(NO3)2處理的NO3--N含量與CK相當(dāng)，顯著高于NaCl處理50%(P＜0.05)。說(shuō)明施加外源Ca(NO3)2可以提高大苞萱草葉片中的NO3--N含量，降低鹽脅迫對(duì)其NO3--N吸收的抑制作用，促進(jìn)硝酸鹽同化，從而緩解鹽脅迫對(duì)大苞萱草的傷害。

圖1 外源Ca(NO3)2對(duì)鹽脅迫下大苞萱草葉片中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量的影響

與CK相比，NaCl脅迫處理的大苞萱草葉片中NH4+-N含量顯著升高，是CK的1.21倍(P＜0.05)，而施加Ca(NO3)2可以顯著降低NH4+-N含量，Ca(NO3)2和NaCl+Ca(NO3)2處理的NH4+-N含量分別是CK的85.2%和90.4%(P＜0.05)。說(shuō)明外源Ca(NO3)2能夠促進(jìn)鹽脅迫下大苞萱草的NH4+-N代謝，減少NH4+-N積累，從而降低鹽脅迫的毒害作用，改善大苞萱草的氮代謝效率。

2.2 外源Ca(NO3)2對(duì)鹽脅迫下大苞萱草氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

由圖2可知，與CK相比，NaCl脅迫下大苞萱草葉片中的NR活性顯著下降，是CK的76.3%(P＜0.05)；而Ca(NO3)2處理、NaCl+Ca(NO3)2處理的NR活性則顯著升高，分別是CK的1.63倍和1.31倍(P＜0.05)。

圖2 外源Ca(NO3)2對(duì)鹽脅迫下大苞萱草NR、GS、GOGAT活性的影響

與CK相比，外源Ca(NO3)2處理的GS活性無(wú)顯著變化，而NaCl脅迫使其GS活性顯著下降，是CK的36.6%(P＜0.05)；NaCl脅迫下增施Ca(NO3)2顯著提高了GS活性，是NaCl脅迫的2.24倍(P＜0.05)，但仍顯著低于CK。說(shuō)明鹽脅迫對(duì)大苞萱草葉片中的GS活性抑制較強(qiáng)，降低了銨代謝速度，而外源Ca(NO3)2可有效減輕這種抑制，提高植株對(duì)鹽脅迫的抵抗能力。

與CK相比，外源Ca(NO3)2處理大苞萱草葉片中的GOGAT活性無(wú)顯著變化，而NaCl處理下GOGAT活性顯著下降57.1%(P＜0.05)；NaCl脅迫下增施Ca(NO3)2處理可顯著提高GOGAT活性，是NaCl處理的1.82倍(P＜0.05)，但仍顯著低于CK。說(shuō)明外源Ca(NO3)2可以提升NaCl脅迫下大苞萱草葉片的NH4+同化能力。

2.3 外源Ca(NO3)2對(duì)鹽脅迫下大苞萱草氮代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

AMT基因調(diào)控NH4+的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，NR基因調(diào)控NR含量，NRT基因調(diào)控硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白合成，F(xiàn)d-GOGAT基因調(diào)控GOGAT含量，SUT基因調(diào)控蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)。由圖3可見(jiàn)，NaCl脅迫下，大苞萱草中的AMT1；1、AMT1；2、Fd-GOGAT和SUT4表達(dá)量顯著增加，NR1表達(dá)量顯著降低，NRT1表達(dá)量與CK相當(dāng)。與CK相比，Ca(NO3)2處理除顯著降低NRT1的表達(dá)量外，均可誘導(dǎo)其他基因上調(diào)表達(dá)，尤其對(duì)NR1和SUT4表達(dá)的促進(jìn)效果顯著。與NaCl脅迫相比，增施Ca(NO3)2除略上調(diào)NR1的表達(dá)外，顯著下調(diào)了其他基因的表達(dá)。說(shuō)明NaCl脅迫下大苞萱草通過(guò)上調(diào)表達(dá)AMT1；1、AMT1；2、Fd-GOGAT、SUT4基因，加速銨態(tài)氮代謝，增強(qiáng)蔗糖代謝，提高氮同化效率，以應(yīng)對(duì)鹽脅迫；而施加外源Ca(NO3)2可使這些基因的表達(dá)量顯著降低，表明其能夠有效緩解鹽脅迫造成的傷害，改善氮代謝水平。

圖3 外源Ca(NO3)2對(duì)鹽脅迫下大苞萱草氮代謝相關(guān)基因表達(dá)量的影響

3 討論與結(jié)論

氮素是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的大量元素，對(duì)作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量形成起決定性作用，逆境條件下氮素缺乏會(huì)造成植物的生長(zhǎng)發(fā)育受到限制[19]。氮同化是植物吸收NO3-或NH4+合成氨基酸和蛋白質(zhì)等含氮有機(jī)物的過(guò)程，需要多種酶協(xié)同作用。GS和GOGAT不僅參與植物氮代謝，還能夠在多種生理代謝過(guò)程中發(fā)揮良性調(diào)節(jié)功能，有利于增強(qiáng)植株對(duì)多種有害物質(zhì)的代謝能力[20]。張毅等[21]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鹽堿脅迫能夠降低番茄幼苗的GS和GOGAT活性，阻滯幼苗生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。谷氨酸合酶是參與NH4+同化過(guò)程的關(guān)鍵酶，如果谷氨酸合酶的活性受到抑制，NH4+同化過(guò)程也將受到阻滯。鹽脅迫能夠影響氮同化過(guò)程，使植物對(duì)無(wú)機(jī)氮的吸收和利用受到抑制，降低蛋白質(zhì)和氨基酸的合成效率，進(jìn)而對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育造成危害。

研究表明，當(dāng)鹽濃度超過(guò)植物能夠承受的范圍后，可促使NO3--N含量下降，NH4+-N含量增加，對(duì)植株造成毒害作用[10，22，23]。本研究中，300 mmol·L-1NaCl脅迫使大苞萱草葉片中的NO3--N含量顯著降低，NH4+-N含量顯著升高，并顯著降低NR、GS、GOGAT活性，對(duì)其造成明顯的脅迫傷害；而施用10 mmol·L-1外源Ca(NO3)2后，NO3--N含量顯著回升，NH4+-N含量顯著下降，NR、GS、GOGAT活性顯著上升，表明施加外源Ca(NO3)2能通過(guò)激活GS、NR、GOGAT等氮代謝相關(guān)酶的作用增強(qiáng)其NO3-還原與NH4+同化能力，促進(jìn)GS/GOGAT循環(huán)，維持其正常的氮代謝過(guò)程，從而有效緩解鹽脅迫對(duì)大苞萱草的傷害。

但外源Ca(NO3)2對(duì)鹽脅迫下植物體內(nèi)氮代謝影響的分子機(jī)制尚不明確。AMT1；1和AMT1；2基因的主要功能是促進(jìn)NH4+轉(zhuǎn)運(yùn)[24]。蔗糖是糖在植物中的主要轉(zhuǎn)運(yùn)形式，而糖作為碳的主要存在形式，與氮同化密切相關(guān)，控制蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)的基因SUT4表達(dá)上調(diào)可能為生長(zhǎng)發(fā)育提供更多能量物質(zhì)[25]。Fd-GOGAT基因表達(dá)與GS和GOGAT兩種氮代謝關(guān)鍵酶的活性有關(guān)，植物為應(yīng)對(duì)鹽脅迫，可通過(guò)上調(diào)該基因的表達(dá)來(lái)提升這兩種酶的活性，從而維持氮代謝水平。本研究結(jié)果顯示，在300 mmol·L-1NaCl脅迫下，上述4個(gè)基因在大苞萱草體內(nèi)均顯著上調(diào)表達(dá)，而施加外源Ca(NO3)2均能有效抑制其上調(diào)表達(dá)；同時(shí)，施加外源Ca(NO3)2能上調(diào)鹽脅迫下大苞萱草體內(nèi)NR1基因的表達(dá)，下調(diào)NRT1基因的表達(dá)。表明300 mmol·L-1NaCl脅迫下施加10 mmol·L-1外源Ca(NO3)2有助于維持大苞萱草體內(nèi)的氮代謝水平，有效降低鹽脅迫傷害。

綜上所述，在鹽脅迫下，外源Ca(NO3)2可通過(guò)提高氮代謝相關(guān)酶活性及調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，維持大苞萱草體內(nèi)氮代謝水平，從而提高其對(duì)鹽脅迫的抗性。