萬平平，高遠(yuǎn)菲，張文婕，王金花，王軍，朱魯生

(1.濟南市城鄉(xiāng)建設(shè)發(fā)展服務(wù)中心，山東 濟南 250014；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院/山東省高校農(nóng)業(yè)環(huán)境重點實驗室，山東 泰安 271018)

自工業(yè)革命以來，全球碳排放總量不斷升高，對生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重威脅[1]。土壤中的含碳量在地球陸地生態(tài)系統(tǒng)中居首位，更是世界碳循環(huán)過程中不可或缺的重要部分。影響土壤碳固定的因素有許多，其中植被類型通過控制進入土壤中的植物殘體量和植被根系生物量來影響土壤有機碳的分布[2-5]，植被不僅能夠通過光合作用固定空氣中的CO2，其根系土壤中具有固碳作用的微生物同樣促進土壤中的碳固定[6，7]。微生物在土壤碳元素的循環(huán)作用中發(fā)揮著重要作用，它們憑借高豐度、代謝多樣性，參入碳循環(huán)的多個環(huán)節(jié)。碳源利用相關(guān)的微生物群落結(jié)構(gòu)、碳源轉(zhuǎn)化相關(guān)酶活性及關(guān)鍵基因的豐度都能夠影響土壤微生物的固碳能力。

作為天然碳匯體的園林植物，在調(diào)節(jié)碳循環(huán)方面起著至關(guān)重要的作用。目前我國對園林植物固碳能力的研究多集中于整體碳匯的計算和對單株固碳能力的測定上，而對于和植物密切相關(guān)的土壤以及根際微生物發(fā)揮固碳作用的研究較少。因此，本試驗選取5種典型的北方園林綠化林木:山桃(Amygdalus davidiana)、玉蘭(Yulania denudata)、側(cè)柏(Platycladus orientalis)、白蠟(Fraxinus chinensis)、大葉女貞(Ligustrum compactum)為對象，通過碳源利用能力、土壤蔗糖酶和淀粉酶活性的測定以及3種碳循環(huán)基因的定量分析，研究不同植物類型根際微生物的土壤碳源利用和轉(zhuǎn)化能力及其關(guān)鍵驅(qū)動因子，為選擇具有高碳源利用和轉(zhuǎn)化能力的園林植物提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗用土樣于2021年12月份采自濟南市植物園，一部分進行Biolog-ECO微平板的測定和碳循環(huán)基因的定量檢測(可放-20℃冰箱保存)，一部分陰涼處風(fēng)干后過1 mm篩，用于土壤酶活性測定。

1.2 試驗方法

1.2.1 Biolog-ECO微平板試驗 將5種不同土樣制成土壤懸濁液，然后稀釋至濃度為10-3g/mL，無菌條件下接種到Biolog-ECO微平板中進行連續(xù)培養(yǎng)，期間測定4、24、48、72、96、120、144 h和168 h各微孔的吸光度值。計算平均顏色變化率AWCD值:

式中:Ci表示第i孔的OD值；R表示對照孔的OD值；n為供試碳源的種類數(shù)，其值為31。

1.2.2 土壤酶活性測定 土壤酶活性采用3，5-二硝基水楊酸法比色法測定[8]，用5 g風(fēng)干土在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h生成的葡萄糖量表征土壤淀粉酶和蔗糖酶活性。

1.2.3 碳循環(huán)基因的定量檢測 采用實時熒光定量PCR(qPCR)檢測方法。稱取1.00 g土樣用試劑盒提取總DNA，選擇3種碳循環(huán)標(biāo)記基因cbbM、cbbLR、cbbLG進行PCR檢測，確定反應(yīng)體系與程序。用試劑盒純化擴增后的目的基因片段，將片段連接在pMDTM19-T Vector，后導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將處理得到的菌株培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。本試驗測定各基因的相對定量值，因此每個樣品同時進行16s rRNA的qPCR試驗。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel處理數(shù)據(jù)及作圖，用Origin 2022軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物根際土壤微生物碳源利用的動力學(xué)特征

5種園林植物根際土壤微生物對碳源的利用程度隨著培養(yǎng)時間的延長均呈現(xiàn)先增加后逐漸變緩的趨勢(圖1A)。培養(yǎng)4～24 h期間AWCD值增加比較緩慢，24～96 h迅速增大，土壤微生物逐漸進入指數(shù)生長期，底物碳源被大量利用，土壤生物對碳源的利用能力也隨其活性的增大而增強，120 h之后進入穩(wěn)定期。

對比不同植物的根際土壤微生物96 h的AWCD值可以發(fā)現(xiàn)，山桃和玉蘭的數(shù)值明顯高于其他3種植物，其中山桃約是大葉女貞的2倍，表明山桃和玉蘭根際土壤微生物群落對碳源總的利用能力更強(圖1B)。

圖1 不同植物根際土壤微生物AWCD值隨培養(yǎng)時間的變化(A)及96 h AWCD值(B)

2.2 不同植物根際土壤微生物的碳源利用分析

由圖2看出，不同植物根際土壤微生物對六類碳源的相對利用程度有明顯差異，其中山桃和側(cè)柏根際土壤微生物對六類碳源的利用均呈現(xiàn):糖類＞羧酸類＞氨基酸類＞多聚類＞酚類＞胺類。從總體上看，5種植物根際土壤微生物對糖類、羧酸類和多聚類這三類碳源總的利用程度都在65%以上，而對多聚類、酚類和胺類的利用程度較低?？傮w碳源利用能力最低的大葉女貞對于糖類的利用程度僅為24%，相比其他4種植物最低，但對胺類的利用程度最高，約占4%。

圖2 不同植物根際土壤微生物對六類碳源的相對利用程度

2.3 不同植物根際土壤蔗糖酶及淀粉酶活性分析

通過土壤中碳轉(zhuǎn)化相關(guān)的蔗糖酶和淀粉酶活性測定來判斷不同植物根際微生物碳源利用的差別，結(jié)果見圖3。由圖3A可見，5種植物根際土壤蔗糖酶活性存在顯著差異，其中山桃土壤蔗糖酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他4種植物，差異達(dá)顯著水平，玉蘭及側(cè)柏顯著高于大葉女貞，山桃土壤蔗糖酶活性較大葉女貞高出5倍。

從圖3B看出，5種植物土壤淀粉酶活性亦有顯著差異，其中山桃最高，顯著高于玉蘭、白蠟及大葉女貞，側(cè)柏與玉蘭差異不顯著但顯著高于其他兩種植物。

圖3 不同植物極際土壤蔗糖酶及淀粉酶活性

2.4 不同植物根際微生物的土壤碳循環(huán)基因相對豐度分析

5種不同植物根際土壤中3種碳循環(huán)基因的相對豐度如圖4所示。其中cbbLR基因在5種植物根際土壤中的相對含量顯著高于其他兩種基因，玉蘭和山桃的cbbLR基因相對含量較高，白蠟和側(cè)柏中cbbLG基因和cbbM基因的相對含量均略高于其他3種植物。

圖4 不同植物類型對土壤碳循環(huán)基因的影響

2.5 碳源利用和轉(zhuǎn)化指標(biāo)間的相關(guān)性

對AWCD、六類碳源、兩種土壤酶活性和3種碳循環(huán)基因進行相關(guān)性分析，結(jié)果見圖5。可以看出，AWCD值與cbbLR基因存在顯著正相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)，與土壤淀粉酶和蔗糖酶活性也有一定的相關(guān)性；土壤淀粉酶活性與cbbLR基因和土壤蔗糖酶活性存在正相關(guān)關(guān)系；cbbLG基因和cbbM基因的顯著性檢驗結(jié)果為P＜0.05。

圖5 碳循環(huán)指標(biāo)間的相關(guān)性

3 討論

AWCD值反映了微生物對碳源的利用能力[9，10]。通過對比5種植物96 h的AWCD值得出，其根際土壤微生物對碳源的利用能力依次為:山桃＞玉蘭＞白蠟＞側(cè)柏＞大葉女貞。研究表明，根系分泌物對根際微生物群落具有重要的調(diào)控作用，它能夠有選擇性地對根際微生物群落產(chǎn)生影響[11，12]。涂書新等[13]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)生存環(huán)境變差，一些植物的根系會產(chǎn)生適應(yīng)環(huán)境變化的分泌物進行自我保護，這些植物一般具有較強的抗逆性。山桃為5種植物中抗旱耐寒性能最好的，當(dāng)生長環(huán)境偶遇脅迫，其根系分泌物自然應(yīng)環(huán)境變化而改善[14]，從而能夠大大提高土壤微生物活性，提高土壤微生物對碳源的利用能力，由此我們推測山桃具有良好的固碳功能，是園林綠化較佳的選擇。

六類碳源利用的測定結(jié)果表明，5種植物土壤微生物群落具有特定的代謝特征，均對糖類、羧酸類和氨基酸類有很高的代謝活性，有可能是這5種植物的根系分泌了大量糖類、羧酸類和氨基酸等碳源物質(zhì)[15，16]，從而給相關(guān)類型微生物的繁殖與生長提供了良好條件。但5種植物對六類碳源的代謝沒有顯著差異，與糖類、羧酸類和氨基酸類碳源物質(zhì)相關(guān)的微生物可能不是土壤固碳的重要組分。

土壤酶是土壤組分中活躍的有機成分，也是生態(tài)系統(tǒng)中參與物質(zhì)循環(huán)和能量流動的重要組成部分[17]，其活性不僅與土壤肥力狀況有著顯著的相關(guān)性，而且還與土壤微生物活性密切相關(guān)，它與土壤微生物一起推動著物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。土壤酶活性的大小能夠影響生物化學(xué)過程的強度和方向[18]，在一定程度上能夠反映土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化動態(tài)，在土壤養(yǎng)分循環(huán)、能量轉(zhuǎn)化、協(xié)調(diào)生態(tài)系統(tǒng)的碳氮平衡等過程中起到重要作用。其中蔗糖酶常用來表征土壤中的微生物學(xué)活性，并且蔗糖酶還能夠增加土壤中碳的周轉(zhuǎn)[19-22]。本研究中山桃的土壤蔗糖酶活性顯著高于其他4種植物，表明其根際土壤微生物的活性最強。由此可知山桃根際土壤微生物的土壤碳源利用和轉(zhuǎn)化能力最強，同時印證了前面的推測。

有研究表明cbbL基因是卡爾文循環(huán)中參與編碼的關(guān)鍵因子[23]。為探究土壤中固碳微生物對碳源的利用和轉(zhuǎn)化，許多研究者將cbbL基因作為碳循環(huán)的標(biāo)記基因。對5種植物根際土壤中微生物碳循環(huán)基因的定量檢測可以發(fā)現(xiàn)，3種碳循環(huán)基因中，cbbLR基因在土壤中的相對含量最高，因此可以推測，cbbLR基因在土壤微生物的碳源利用中起重要作用。其中，山桃和玉蘭根際土壤中的cbbLR基因相對含量比其他3種植物高。由圖1已知，山桃和玉蘭的AWCD值較高，即對碳源的利用能力較強。相關(guān)性分析表明，AWCD值和cbbLR基因也呈高度相關(guān)性，更加印證了cbbLR基因是影響土壤微生物對碳源利用能力的一個關(guān)鍵因子。

4 結(jié)論

對5種不同植物根際土壤微生物碳源利用能力的測定結(jié)果顯示，山桃和玉蘭的AWCD值相對較高，表明這兩種植物根際土壤微生物對碳源的利用能力強。土壤蔗糖酶和淀粉酶活性的測定結(jié)果表明，山桃的土壤蔗糖酶活性顯著高于其他4種植物，從而增強其根際微生物活性，大大提高對碳源的利用和轉(zhuǎn)化能力。3種碳循環(huán)基因的定量檢測結(jié)果顯示，cbbLR基因在山桃和玉蘭根際土壤中的相對含量較高，表明cbbLR基因是影響土壤微生物對碳源利用與轉(zhuǎn)化的一個關(guān)鍵因子。