張邦喜，顧小鳳，張萌，魏全全，柳玲玲，芶久蘭

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，貴州 貴陽 550006)

貴州是我國第二大烤煙種植省份，煙葉生產(chǎn)在其經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有重要地位[1]。近年來由于貴州烤煙產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，導(dǎo)致烤煙連作現(xiàn)象突出。連作可使煙草生長發(fā)育受阻，生長勢變?nèi)?，煙株抵御病蟲能力、產(chǎn)量和品質(zhì)下降，并具有累加效應(yīng)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，連作導(dǎo)致烤煙有效葉片數(shù)、葉面積指數(shù)和產(chǎn)量等指標(biāo)呈下降趨勢[3]?？緹熭喿鞑粌H可以有效改善其農(nóng)藝性狀，提高植株根系活力，還具有增產(chǎn)作用，提升經(jīng)濟(jì)指標(biāo)和改善感官質(zhì)量[4，5]。王麗萍等[6]研究發(fā)現(xiàn)，皖南煙區(qū)采取煙稻的輪作模式，能夠有效降低煙葉田間發(fā)病率，提升煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量，增加煙農(nóng)種煙效益。研究證明，煙葉生長各時期，輪作模式下烤煙的農(nóng)藝性狀均優(yōu)于不輪作處理，同時對土傳病害黑脛病有明顯的抑制效果[7]。

土壤中真菌含量狀況是評價土壤肥力變化的重要指標(biāo)之一，對土壤養(yǎng)分含量和作物根系的活力具有較大影響，在保持土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡以及土壤質(zhì)量方面具有重要作用[8]。連作對根際土壤真菌群落有較大影響[9]:如蕨麻連作4年后的土壤真菌豐度很高[10]；連作導(dǎo)致土壤細(xì)菌與真菌數(shù)量的比值降低，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)由“細(xì)菌型”轉(zhuǎn)變?yōu)椤罢婢汀盵11]；連作后根際土壤中自毒物質(zhì)不斷積累，真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，鏈格孢霉、鐮刀菌等有害真菌富集[12]；大豆連作增加了潛在致病真菌尖孢鐮刀菌數(shù)量[13]。研究證明輪作影響植物殘體的數(shù)量和質(zhì)量，植物殘體是微生物的營養(yǎng)來源，可導(dǎo)致土壤微生物的功能發(fā)生變化[14]。輪作系統(tǒng)下土壤真菌OTU數(shù)、多樣性、均勻度指數(shù)等均高于連作系統(tǒng)[15-17]。如水稻-大豆輪作系統(tǒng)顯著提高了土壤中叢枝菌根真菌孢子的出現(xiàn)頻率[18]；引入豆科作物的輪作模式顯著改變了AM真菌多樣性及群落組成[19]；隨著蔬菜-牧草輪作系統(tǒng)中草地生長年限的增加，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變，且趨近于永久性草地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[20]；輪作后花生根表有益微生物比例明顯高于連作[21]；輪作煙田根際土壤中拮抗菌的相對豐度均高于連作煙田，而連作煙田根腐病病菌腐霉屬的豐度較高[22]。同時有研究發(fā)現(xiàn)，輪作與施用有機(jī)肥相結(jié)合，可以最大程度地降低真菌與細(xì)菌的比例[23]。

綠肥作為高效清潔的有機(jī)肥源，與主作物合理搭配，可有效降低主作物土傳病害的發(fā)生和危害。綠肥種植后翻壓或施加外源綠肥對土傳真菌病害具有良好的抑制作用。綠肥在種植過程中可活化土壤中的難吸收養(yǎng)分，且在腐解過程中釋放速效養(yǎng)分，保證了作物的養(yǎng)分供給，提高了作物的整體健康水平。綠肥部分化合物的水解產(chǎn)物具有直接滅殺或抑制土壤病原物的能力。翻壓或施加綠肥可顯著提高土壤微生物種群數(shù)量，與病原菌形成競爭或拮抗效應(yīng)[24]。大量研究發(fā)現(xiàn)，深耕或綠肥掩青條件下可增加烤煙株高、有效葉片數(shù)、莖圍和葉面積等農(nóng)藝性狀指標(biāo)，提高烤煙產(chǎn)量、產(chǎn)值和上等煙比例，改善烤煙化學(xué)成分的協(xié)調(diào)性，減輕根腐病和黑脛病的發(fā)生[25-27]。目前針對貴州烤煙輪作研究相對較少，因此，本研究通過大田試驗，定性分析輪作對烤煙農(nóng)藝、經(jīng)濟(jì)性狀及真菌群落結(jié)構(gòu)的影響，以期為貴州烤煙的合理高效種植提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況及材料

本試驗于2018年10月—2020年8月在貴州省畢節(jié)市黔西縣永燊彝族苗族鄉(xiāng)(106°11′41″E，27°7′34″N)進(jìn)行，平均海拔1 205 m。供試土壤為貴州典型石灰?guī)r發(fā)育的黃壤，基本理化性質(zhì)如下:pH值5.92，有機(jī)質(zhì)18.59 g/kg、全氮1.31 g/kg、有效磷16.60 mg/kg、速效鉀232.00 mg/kg。供試烤煙品種為畢納1號，由畢節(jié)市煙草公司黔西縣分公司提供。供試有機(jī)肥為酒糟有機(jī)肥(N+P2O5+K2O＝6.2%)，供試化肥為烤煙專用基肥(N∶P2O5∶K2O＝10∶15∶24)、烤煙提苗肥(N∶P2O5∶K2O＝15∶8∶7)和烤煙專用追肥(N∶P2O5∶K2O＝13∶0∶26)，均由畢節(jié)市煙草公司黔西縣分公司提供。綠肥為66-25箭筈豌豆，由畢節(jié)市黔西縣土肥站提供。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采取隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，共4個處理:烤煙連作(T)；白菜-烤煙輪作(C-T)；豌豆-烤煙輪作(P-T)；綠肥-烤煙輪作(GM-T)。小區(qū)面積為42 m2，小區(qū)間設(shè)置0.5 m隔離帶，每處理3次重復(fù)?？緹熜芯?.05 m，株距0.57 m，種植密度16 500株/hm2。各小區(qū)管理方式一致。在施肥過程中，根據(jù)等量養(yǎng)分原則，T和C-T處理施肥一致，因P-T處理直接將豌豆翻壓于土壤中，GM-T處理直接將綠肥翻壓于土壤中，故P-T和GM-T處理的專用基肥和追肥需減量。豌豆和綠肥的養(yǎng)分含量及水分含量如表1所示，計算后將P-T和GM-T處理的專用基肥和追肥分別減少80 kg/hm2和110 kg/hm2。各處理具體施肥量如表2所示。

表1 豌豆和綠肥的養(yǎng)分含量

表2 不同處理的肥料施用量

1.3 樣品的采集與測定

1.3.1 土壤樣品的采集 于2020年8月烤煙采收結(jié)束后，在每個小區(qū)采用“S”形取樣法設(shè)置15個采樣點，每個采樣點采集0～20 cm土壤樣品。剔除枯枝落葉、碎石等雜物后把土壤樣品混勻用錫箔紙包裹，迅速裝入離心管，液氮冷凍條件下運輸，之后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于土壤微生物高通量測序分析。

1.3.2 土壤DNA提取和16S rRNA基因高通量測序 每個樣品稱取0.5 g新鮮土壤，采用FastDNA?SPIN Kit for Soil(MPBiomedicals)試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取土壤微生物總DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品是否降解以及有無雜質(zhì)，使用Nanodrop 2000分光光度計[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]檢測樣品純度。經(jīng)DNA濃度和純度檢測后(DNA濃度≥20 ng/μL，總量≥500 ng，D260/280為1.8～2.0)，利用ABI GeneAmpR 9700型PCR儀[美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTAHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR反應(yīng)體系:5×TransStart FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mol/L dNTPs 2 μL，上下游引物(5μmol/L)各0.8 μL，TransStart FastPfuDNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O補足至20 μL。每個樣品3個重復(fù)，采用2%瓊脂凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增效果。利用Thermo Scientific公司的GeneJET膠回收試劑盒回收目標(biāo)條帶，測序服務(wù)委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3.3 植株樣品的采集 在烤煙收獲期，各小區(qū)選取有代表性植株6株，用尼龍袋裝好，于實驗室進(jìn)行農(nóng)藝性狀的測定。

1.3.4 根、莖、葉農(nóng)藝指標(biāo)的測定 分別測量6株煙株的葉長、葉寬、莖高、莖圍、根干重、莖干重、葉干重、有效葉片數(shù)。選取煙株自上而下第5、10、15片葉處測定莖圍，取平均值。選取煙株自上而下第10片葉測量葉長、葉寬，取平均值。將煙株進(jìn)行烘烤，測定根、莖、葉干重，取平均值。

1.3.5 產(chǎn)值的測算 各處理實采實收，分別計產(chǎn)。烤煙分期采收烘烤，各個時期實際采收烘烤量相加即為小區(qū)的實際產(chǎn)量。通過面積換算得到產(chǎn)值。

1.4 統(tǒng)計與分析

利用SPSS 20.0進(jìn)行方差分析(P＜0.05)，采用Origin 8.0軟件進(jìn)行作圖。圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 輪作對烤煙農(nóng)藝和經(jīng)濟(jì)性狀的影響

如表3所示，輪作后，烤煙的葉長、葉寬、莖高和莖圍受到一定影響，但差異不顯著。與T處理相比，輪作使葉長增加1.00～3.33 cm、葉寬增加1.00～1.66 cm、莖高增加6.67～14.17 cm、莖圍增加0.34～0.84 cm，均以GM-T處理增加幅度最大。

表3 種植模式對烤煙農(nóng)藝性狀的影響 (cm)

如表4所示，輪作對烤煙的根干重、莖干重、葉干重、有效葉片數(shù)、產(chǎn)值等指標(biāo)產(chǎn)生一定的影響。與T處理相比，輪作使根干重、莖干重、葉干重分別增長21.10%～53.99%、11.66%～16.42%、27.54%～36.36%，其中GM-T處理與T處理間上述指標(biāo)均達(dá)到差異顯著水平。與T處理相比，輪作使烤煙有效葉片數(shù)增加7.75%～11.65%，GM-T處理增幅最大。輪作后，烤煙的產(chǎn)值有所提升，其中C-T處理增加2 960.14元/hm2、P-T處理增加6 902.36元/hm2、GM-T處 理 增 加6 104.46元/hm2，P-T和GM-T處理與T處理間達(dá)到差異顯著水平。

表4 種植模式對烤煙經(jīng)濟(jì)性狀的影響

2.2 輪作對土壤真菌OTU數(shù)的影響

由圖1可知，共得到1 840個OTU，其中T、C-T、P-T、GM-T處理OTU數(shù)分別為628、694、653、790個。4個處理的共同OTU數(shù)為142個，分別占T、C-T、P-T、GM-T處理總OTU數(shù)的22.61%、20.46%、21.75%和17.97%。T、C-T、PT、GM-T處理各自特有的OTU數(shù)分別為293、331、293、405，占相應(yīng)處理總OTU數(shù)的46.66%、47.69%、44.87%和51.27%。由此可見，輪作增加了土壤中真菌的OTU數(shù)，其中GM-T處理增加幅度最大，為25.80%，且GM-T處理特有的OTU數(shù)最多。

圖1 種植模式對土壤真菌OTU數(shù)的影響

2.3 輪作對土壤真菌群落豐度和多樣性的影響

2.3.1 輪作對土壤真菌門水平群落結(jié)構(gòu)的影響通過對不同處理下土壤真菌門水平群落組成分析發(fā)現(xiàn)，在門水平上共檢測出13個真菌種類和未確定類群，T、C-T、P-T、GM-T處理分別有10、12、11、12個門。其中，子囊菌門(Ascomycota)、球囊菌門(Mortierellomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)的相對豐度較高，分別為60.64%～72.65%、4.65%～21.12%、3.75%～7.57%(圖2)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，烤煙輪作模式并未改變土壤中真菌的種類，但改變了優(yōu)勢菌的豐度。輪作使得前6種優(yōu)勢菌的豐度之和下降，說明烤煙輪作在一定程度上改變了土壤中的真菌群落多樣性。其中，PT和GM-T處理的子囊菌門(Ascomycota)豐度較T處理下降了3.15%和15.98%，子囊菌易引起根腐、莖腐、果(穗)腐和枝枯等，說明輪作可以減少土壤中的病原菌，改善土壤微環(huán)境，從而減輕作物病蟲害。

圖2 種植模式對土壤真菌門水平群落結(jié)構(gòu)的影響

2.3.2 輪作對土壤真菌屬水平群落結(jié)構(gòu)的影響在屬水平上共檢測出290個真菌種類和未確定類群，T、C-T、P-T、GM-T處理分別有167、171、173、178個屬。其中，鐮刀菌屬(Fusarium)、被孢霉菌屬(Mortierella)、曲霉菌屬(Aspergillus)、青霉菌屬(Penicillium)、莖點霉屬(Setophoma)的相對豐度較高，分別為11.80%～24.23%、4.65%～21.12%、2.57%～21.18%、1.58%～11.45%、2.79%～6.13%(圖3)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，烤煙輪作并未改變土壤中真菌屬的種類，但改變了其優(yōu)勢菌屬的豐度，輪作后土壤中的前11種優(yōu)勢菌屬的豐度之和下降。輪作降低了土壤中的曲霉菌屬(Aspergillus)和青霉菌屬(Penicillium)的豐度，其中，在GM-T處理中，曲霉菌屬(Aspergillus)的豐度下降幅度最大，為87.87%；P-T處理的青霉菌屬(Penicillium)下降幅度最大，為86.20%。此外，與T處理相比，GM-T處理的鐮刀菌屬(Fusarium)豐度顯著增加94.62%，被孢霉菌屬(Mortierella)豐度顯著增加354.19%。

圖3 種植模式對土壤真菌屬水平群落結(jié)構(gòu)的影響

2.3.3 輪作對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)影響的LefSe分析 通過對不同種植模式下的土壤微生物群落進(jìn)行LefSe分析(圖4)發(fā)現(xiàn)，在C-T和GM-T處理間存在對土壤有重要作用的真菌種類。C-T處理有Coniochaetales、Coniochaetaceae、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、被毛枝葡萄孢屬(Botryotrichum)、毛殼菌科(Chaetomiaceae)；GM-T處理有毛殼屬(Chaetomium)。

圖4 種植模式對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)影響的LefSe分析

3 討論

3.1 輪作對烤煙農(nóng)藝及經(jīng)濟(jì)性狀的影響

不同種植模式對煙葉的產(chǎn)量和產(chǎn)值均有影響?？緹熯B續(xù)單作，自毒物質(zhì)富集，病原微生物增加，進(jìn)而引起連作障礙，導(dǎo)致煙草產(chǎn)量降低，品質(zhì)變劣。隨著連作年限的增加，煙草長勢變?nèi)酰緹煹漠a(chǎn)量和產(chǎn)值均有所下降[28，29]。輪作是克服煙草連作障礙的有效措施之一，是提高煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量、降低病蟲害的有效途徑[30]。陽顯斌等[31]發(fā)現(xiàn)煙蒜輪作后煙葉產(chǎn)量較單作提高了35.04%。在烤煙輪作中，翻壓豆科綠肥能改善烤煙農(nóng)藝性狀，提高烤煙產(chǎn)量，增加產(chǎn)值。特別是翻壓箭舌豌豆，不僅能增加株高、莖圍、節(jié)距、最大葉長和葉寬，還能提高烤煙根系覆蓋范圍和增加主、側(cè)根重量[32]。在本試驗中，輪作后，烤煙的葉長、葉寬、莖高和莖圍均較連作增加；根干重、莖干重、葉干重也較連作處理增加，且GM-T處理與T處理間差異顯著；同時輪作還提高了烤煙的產(chǎn)值，P-T和GM-T處理與T處理間差異顯著。研究結(jié)果與前人一致，這是因為烤煙輪作的種植方式具有較強的物質(zhì)生產(chǎn)能力，可以提高烤煙產(chǎn)量[33]。本試驗中GM-T處理提升烤煙農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量效果最佳，這是因為綠肥生長發(fā)育過程中的根系穿插、根系分泌和根毛細(xì)胞脫落可增強土壤微生物活性，起到調(diào)節(jié)土壤養(yǎng)分平衡、降低土壤容重、消除土壤不良成分的功效。同時綠肥還能促進(jìn)植煙土壤難溶性養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，有利煙草吸收利用。翻壓綠肥后，可大量增加植煙土壤中有機(jī)質(zhì)、氮、磷、鉀和各種微量元素含量，能協(xié)調(diào)植煙土壤碳和氮的平衡從而調(diào)節(jié)土壤生物活性和養(yǎng)分循環(huán)[34]。同時，翻壓綠肥能提高烤煙根系覆蓋范圍和增加主、側(cè)根重量，從而提高烤煙產(chǎn)量[32]。

3.2 輪作對烤煙真菌群落多樣性的影響

土壤真菌參與關(guān)鍵的生態(tài)過程，包含大量土傳病害的致病因子及拮抗因子。細(xì)菌性土壤是土壤質(zhì)量良好的一個重要指標(biāo)，而真菌性土壤則代表著土壤貧瘠，病蟲害加重[35]。長期連作會導(dǎo)致土壤真菌菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，對土壤真菌群落的功能多樣性有影響，致病菌增多，且隨著連作年限的增加影響越大[9]。輪作改善了土壤生態(tài)環(huán)境，使之適合多種真菌的繁殖生長，多種真菌共同存在，互相制約，可防止某些病原真菌過度繁殖，抑制作物病害的發(fā)生[36]。在輪作土壤中，真菌種群豐富；在連作土壤中，真菌優(yōu)勢種群突出，20種優(yōu)勢菌株的豐度之和顯著超過輪作[13，36]。本試驗中輪作使得真菌門水平上前6種優(yōu)勢菌種和屬水平上前11種優(yōu)勢菌屬的豐度之和較T處理均下降。說明煙草輪作在一定程度上減緩了土壤微生物結(jié)構(gòu)從細(xì)菌型向真菌型的轉(zhuǎn)化。這是因為輪作(尤其是綠肥輪作)能夠使根瘤固氮，增加了土壤中的氮素，為細(xì)菌型微生物的生長提供了足夠的碳源和氮源；同時，綠肥腐解過程需要大量微生物的參與，從而促進(jìn)了土壤微生物的繁殖，使土壤微生物活性增強和數(shù)量増加。

子囊菌可引起根腐、莖腐、果(穗)腐和枝枯等病害[37]。輪作后，P-T和GM-T處理的子囊菌門(Ascomycota)相對豐度較T處理下降了3.15%和15.98%。曲霉(Aspergillus)在土壤中比較常見，一般不侵染煙草[38]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，曲霉(Aspergillus)和青霉(Penicillium)屬真菌會導(dǎo)致煙葉霉變[39，40]。本試驗輪作處理土壤中的曲霉菌屬和青霉菌屬的豐度較T處理降低，可能因為輪作改善烤煙生長環(huán)境，使病原菌減少，從而改善了煙葉品質(zhì)。被孢霉科是土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分含量豐富的標(biāo)志，其能分解土壤中的糖類和簡單多糖物質(zhì)。被孢霉屬是被孢霉科中的一個大屬，具有溶解土壤中的磷、分解纖維素、半纖維素及木質(zhì)素能力，能利用土壤中的糖類物質(zhì)進(jìn)行生長代謝，增加土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分含量[41]。被孢霉屬真菌能分解有機(jī)物質(zhì)，促進(jìn)植物根系吸收礦質(zhì)元素，此外它還具有潛在分泌抗菌素的能力，抑制病原菌[42，43]。在本試驗中，輪作處理的被孢霉菌屬的豐度有所提高，其中GM-T處理的提升幅度最大，P-T處理次之。這是因為綠肥在翻壓腐解過程中，改善了烤煙根際土壤養(yǎng)分，有利于被孢霉生長繁殖。一部分研究認(rèn)為鐮刀菌屬真菌是一種常見的煙草病原微生物，某些鐮刀屬真菌傷害煙草的根系和維管束組織，從而引發(fā)煙草根腐[44]。但吳元華等[45]在生防鐮刀菌(Fusariumsp.)對煙草列當(dāng)?shù)姆佬а芯恐邪l(fā)現(xiàn)，鐮刀菌屬(Fusarium)對煙株的抗病能力有較明顯作用，在穴施生防鐮刀菌后，煙田其他病害的發(fā)病率和病情指數(shù)有所降低，煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)提高。本試驗中，輪作土壤中的鐮刀菌屬(Fusarium)豐度較T處理有所提高，這可能是因為輪作后，烤煙土壤環(huán)境改變，導(dǎo)致了土壤中鐮刀菌屬的繁殖。但此種鐮刀菌屬對烤煙生長影響如何，仍需進(jìn)一步試驗研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，烤煙輪作提升了烤煙農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量。輪作后，真菌門水平和屬水平上的優(yōu)勢菌屬的豐度之和較連作均下降，在一定程度上減緩了土壤微生物結(jié)構(gòu)從細(xì)菌型向真菌型的轉(zhuǎn)化。輪作降低了病原型真菌(子囊菌、曲霉菌和青霉菌)的相對豐度，提高了有益真菌被孢霉菌的相對豐度，以GM-T處理效果最佳。因此，在貴州進(jìn)行烤煙輪作，特別是綠肥-烤煙輪作能增加烤煙收益，減少土壤中的病原菌，增加土壤有益微生物菌群，減緩連作障礙，為烤煙良好循環(huán)種植提供基礎(chǔ)。