趙亞平，董玉惠，周淑梅，陳昆，孫秀東

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山東 泰安 271018；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271018；4.商丘市農(nóng)林科學(xué)院，河南 商丘 476299)

大蒜(Allium sativumL.)是百合科蔥屬草本植物，具有較高營養(yǎng)價值和一定藥用價值[1，2]，是僅次于洋蔥的第二大蔥屬作物[3]，栽培歷史悠久。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)2020年統(tǒng)計(jì):全球大蒜種植面積約163萬公頃，年產(chǎn)量約2 805萬噸。中國是全球第一大蒜生產(chǎn)國，種植面積約83萬公頃，年產(chǎn)量約2 075萬噸，分別約占全球種植面積和總產(chǎn)量的53%和74%。大蒜在自然條件下需經(jīng)歷60～80 d休眠期，這會直接影響大蒜質(zhì)量和市場供應(yīng)期的時長，間接影響大蒜的適時、高質(zhì)量、高產(chǎn)栽培[4]。針對該問題，前人已進(jìn)行了較多相關(guān)研究，如:低溫和外源激素GA3、ETH聯(lián)合處理大蒜鱗芽，可使其休眠期縮短2個月[5]；低溫和外源GA3雙重作用下大蒜氣生鱗莖的休眠能夠有效地被解除[6]；大蒜在高溫環(huán)境下休眠期可以延長[4]；將休眠期的大蒜放在NO中熏蒸，可以促使大蒜萌發(fā)[7]；大蒜在適宜的CO氣體、溫度、濕度環(huán)境下，鱗莖可以提前萌發(fā)[8]。

WUSCHEL(WUS)相關(guān)的同源異型盒(WUSCHEL-related homeobox，WOX)轉(zhuǎn)錄因子家族為植物所特有[9]，以植物干細(xì)胞命運(yùn)的決定基因WUSCHEL來命名[10]。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，該家族可以分為3支——進(jìn)化支、中間支和古老支[11]，進(jìn)化支包括WUS和WOX1～WOX7，中間支包括WOX8、WOX9、WOX11和WOX12，古老支包括WOX10、WOX13和WOX14。研究發(fā)現(xiàn)，WOX1和WOX3基因共同調(diào)控葉等器官的發(fā)育[12]；WOX6基因調(diào)控擬南芥胚珠的發(fā)育，還具有抑制珠被細(xì)胞分化的功能[13]；WOX7基因在側(cè)根發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[14]；WOX8基因影響擬南芥的早期發(fā)育[15]，并調(diào)控胚胎早期子葉原基發(fā)育；WOX9基因可以促進(jìn)擬南芥、矮牽牛和挪威云杉的胚胎形成和細(xì)胞增殖[15-17]；WOX13和WOX14調(diào)控擬南芥花的發(fā)育[18]；WOX基因可能影響大蒜鱗莖中干細(xì)胞的分化過程[19]?？梢?，WOX家族基因在胚的形成、干細(xì)胞穩(wěn)定性和器官形成等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

現(xiàn)階段對大蒜休眠萌發(fā)的研究主要集中在外界環(huán)境條件和激素上[20]；雖已發(fā)現(xiàn)了多個與大蒜休眠萌發(fā)有關(guān)的基因如AsGA3ox、AsSAUR、As-BRI1、AsNF-YB3，但對大蒜休眠萌發(fā)的分子調(diào)控機(jī)制研究還不夠深入。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，WOX9基因在大蒜鱗芽休眠期和萌發(fā)期表達(dá)差異明顯，推測該基因可能在調(diào)控植物休眠上發(fā)揮一定作用。因此，本研究從大蒜葉片中克隆到AsWOX9，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析及在不同組織器官中的表達(dá)分析，以期為深入研究AsWOX9的功能及分子作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

選用大蒜栽培品種“二水早”，2019年10月1日種植于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田，2020年5月24日收獲。各部位樣品采集時間:2019年11月取根和葉，2020年3月取花，2020年4月取蒜薹，2020年5月取鱗莖。每個樣品3次重復(fù)，液氮速凍后-80℃保存。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

取相應(yīng)的組織材料，液氮中研磨，采用TransZOL Plant(TRANSGEN)試劑盒提取總RNA，采用Evo M-MLV RT Mix Kit with gDNA Clean試劑盒進(jìn)行cDNA合成。引物及其序列見表1，均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 試驗(yàn)所用引物

1.3 AsWOX9基因的克隆

根據(jù)前期RNA-seq結(jié)果(PRJNA778905)得到AsWOX9基因序列，用DNAclub設(shè)計(jì)引物(表1)，以大蒜葉片的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(40 μL):cDNA模板2 μL，2×PCR Mix 20 μL，引物各2 μL，ddH2O 14 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?94℃5 min；94℃30 s，53℃30 s，72℃1 min，35個循環(huán)；72℃5 min，4℃保存。產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，在紫外分析儀下確定擴(kuò)增片段合適后進(jìn)行切膠，利用ZOMANBIO膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收，回收基因與克隆載體pMD19-T連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，篩選陽性菌落交由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.4 AsWOX9基因的生物信息學(xué)分析

利用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對氨基酸序列組成和蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行分析；通過PSORT Prediction(http://psort1.hgc.jp/form.html)預(yù)測蛋白在細(xì)胞中可能存在的部位；利用SignalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線分析蛋白的信號肽序列；利用CDD(Conserved Domain Database)分析蛋白保守結(jié)構(gòu)域；利用在線軟件PRABI(http://www.prabifr/)預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)；利用TMHMM Server V.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)進(jìn)行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測；利用NCBI(https://wwwNcbi.nlmni-hgov/)在線Blast工具搜索蛋白的同源序列；利用DNAMAN 6.0進(jìn)行氨基酸多序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1.5 AsWOX9基因在大蒜不同組織中的表達(dá)分析

以Actin為內(nèi)參基因，以不同組織材料的cDNA為模板，參考Biosharp公司的SYBR Green qPCR Mix試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR分析，所用引物見表1，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，采用2-ΔΔCt計(jì)算基因的相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 AsWOX9基因的克隆

以大蒜品種“二水早”的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得570 bp條帶(圖1A)。將目的條帶回收，與克隆載體pMD19-T連接，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆后送樣測序，結(jié)果表明，該基因包含一個570 bp的完整ORF，編碼189個氨基酸(圖1B)，測序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，確認(rèn)擴(kuò)增到正確的AsWOX9基因。

圖1 AsWOX9基因PCR擴(kuò)增電泳圖譜(A)和氨基酸序列(B)

2.2 AsWOX9蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1 氨基酸序列分析及亞細(xì)胞定位 結(jié)果表明，AsWOX9蛋白化學(xué)分子式為C939H1488N276O296S12，相對分子質(zhì)量為21 764.54，等電點(diǎn)8.47，親水系數(shù)為-0.833，為親水性蛋白。該蛋白定位于細(xì)胞核中，且沒有信號肽和剪切位點(diǎn)(圖2)。

圖2 信號肽NN(A)和信號肽HMM結(jié)果圖(B)

2.2.2 蛋白結(jié)構(gòu)分析 結(jié)果表明，AsWOX9蛋白C端存在homeobox結(jié)構(gòu)域，屬于homeodomain型家族基因(圖3)；由44.38%的無規(guī)則卷曲、39.05%的α-螺旋、13.02%的延伸鏈和3.55%的β-轉(zhuǎn)角共同組成(圖4A)；沒有跨膜結(jié)構(gòu)，為非分泌蛋白(圖4B)。

圖3 AsWOX9的保守結(jié)構(gòu)域

圖4 AsWOX9的二級結(jié)構(gòu)(A)和跨膜結(jié)構(gòu)域(B)

2.2.3 AsWOX9進(jìn)化樹分析 經(jīng)BLAST發(fā)現(xiàn)，WUSCHEL-related homeobox 8(蘆筍)、假設(shè)蛋白CISIN_1g022516mg(橙子)、WUSCHEL-related homeobox 13 isoform X1(克萊門柚)、WUSCHEL-related homeobox 13 isoform X2(橙子)、unnamed protein product(沙生擬南芥)與AsWOX9同源性較高，平均同源相似率60.84%(圖5A)。為進(jìn)一步研究上述蛋白之間的親緣關(guān)系，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果(圖5B)顯示AsWOX9與蘆筍的WUSCHEL-related homeobox 8親緣關(guān)系最近。

圖5 AsWOX9蛋白的氨基酸序列比對結(jié)果(A)和進(jìn)化樹分析(B)

2.3 AsWOX9基因在大蒜不同器官中的表達(dá)分析

采用qRT-PCR對AsWOX9基因在大蒜不同器官中的表達(dá)進(jìn)行測定分析，結(jié)果(圖6)表明，該基因在大蒜不同組織器官中均有表達(dá)，表達(dá)量在葉中最高，根中次之，然后依次為蒜薹、花、鱗莖；根中的表達(dá)量分別是鱗莖、蒜薹表達(dá)量的14倍、2.4倍。

圖6 AsWOX9基因在大蒜不同器官中的表達(dá)

3 結(jié)論

WOX轉(zhuǎn)錄因子家族在植物的生長發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用[21-23]，通過本身特有的結(jié)構(gòu)域與相應(yīng)的順式元件相互作用來調(diào)控基因的表達(dá)[24]，如水稻的OsWOX11可以響應(yīng)生長素和細(xì)胞分裂素細(xì)胞信號，并且可以調(diào)控細(xì)胞分裂素應(yīng)答基因RR2來控制冠根發(fā)育過程中的細(xì)胞增殖[25]。但有關(guān)該家族基因在植物休眠調(diào)控中作用的研究報道還很少，作用機(jī)制尚不清楚。鄭佳[26]研究發(fā)現(xiàn)，WOX4基因在楊樹由生態(tài)休眠向內(nèi)休眠轉(zhuǎn)化、形成層恢復(fù)活動初期及形成層旺盛活動末期表達(dá)量明顯上調(diào)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)大蒜WOX基因有利于打破擬南芥種子休眠，促進(jìn)萌發(fā)。本研究從大蒜葉片中克隆了AsWOX9基因，經(jīng)生物信息學(xué)分析，其編碼的蛋白為親水性非分泌蛋白，無信號肽和剪切位點(diǎn)，具有典型的homeobox結(jié)構(gòu)域，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核，與蘆筍的WUSCHEL-related homeobox 8蛋白親緣關(guān)系最近；基因表達(dá)分析結(jié)果顯示，AsWOX9基因在大蒜的多個組織部位均有表達(dá)，以葉中表達(dá)量最高，根中次之，鱗莖中最低。本研究結(jié)果可為深入探究AsWOX9基因的功能及分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。