王艷珂，黎飛飛，陳二影，楊延兵，管延安，高文偉，秦嶺

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，山東 濟(jì)南 250100)

脫落酸(abscisic acid，ABA)是植物五大天然生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑之一，能參與植物響應(yīng)多種逆境脅迫如干旱、冷害、鹽害等的生理反應(yīng)和分子生物學(xué)效應(yīng)[1]，且能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生對(duì)不良環(huán)境的抗性(抗旱性、抗寒性、抗病性、耐鹽性等)，是植物的“抗逆誘導(dǎo)因子”[2，3]。植物體內(nèi)ABA的形成有直接和間接兩種途徑，現(xiàn)在越來(lái)越多的證據(jù)表明高等植物主要以間接途徑合成ABA[4]。9-順式-環(huán)氧類(lèi)胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)通過(guò)剪切9-順式新黃質(zhì)和9-順式紫黃質(zhì)促使ABA前體黃質(zhì)醛形成，是ABA生物合成途徑中的關(guān)鍵限速酶[5]。NCED基因不僅是啟動(dòng)ABA積累的直接因素，也是控制ABA合成、影響合成ABA信號(hào)強(qiáng)度的重要因素。

在玉米中鑒定到的VP14基因是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的NCED基因[6]，隨后在其它植物如煙草[7，8]、大豆[9]、柱花草[10]、馬鈴薯[11]、草莓[12]等中也克隆到了NCED基因。在擬南芥中最先完成了NCED基因家族的鑒定工作，目前已從中鑒定出9個(gè)NCED基因[13]，其中有5個(gè)與ABA合成相關(guān)(AtNCED2，AtNCED3，AtNCED5，AtNCED6，At-NCED9)。從水稻中鑒定到5個(gè)NCED基因家族成員(OsNCED1，OsNCED2，OsNCED3，OsNCED4，OsNCED5)，其中，OsNCED1與水稻的耐旱能力相關(guān)，OsNCED2的表達(dá)水平與延遲種子萌發(fā)有關(guān)，OsNCED3可調(diào)節(jié)水稻在干旱環(huán)境中的ABA水平和抗逆性，OsNCED4影響水稻的結(jié)實(shí)率與產(chǎn)量[14]。在其它植物中也發(fā)現(xiàn)NCED受逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，如ABA和低溫脅迫均能誘導(dǎo)茶樹(shù)的CsNCED1基因顯著上調(diào)表達(dá)[15]；高鹽、低溫、干旱、外源ABA、NAA處理均可不同程度地誘導(dǎo)GmNCED1在大豆葉片及根中表達(dá)[16]；干旱、高鹽、低溫和高溫4種非生物脅迫可不同程度地誘導(dǎo)GmNCED5的表達(dá)[17]；PmNCED1的表達(dá)量隨著糜子受PEG脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而升高[18]。但NCED基因的表達(dá)模式因物種和脅迫處理的不同而具有明顯差異。

長(zhǎng)期以來(lái)，模式植物擬南芥和水稻在引領(lǐng)重要科學(xué)發(fā)現(xiàn)和先進(jìn)研究技術(shù)方面扮演著十分重要的角色。然而，擬南芥和水稻都是C3植物，在作為C4禾谷類(lèi)作物的模式植物時(shí)有很大的局限性。谷子具有抗旱、耐瘠薄和高光效等突出優(yōu)勢(shì)[19]，恰恰彌補(bǔ)了擬南芥和水稻作為模式植物的不足，是極具發(fā)展?jié)摿Φ腃4禾谷類(lèi)模式植物[20]。但目前關(guān)于谷子NCED基因及其差異表達(dá)分析的研究報(bào)道甚少。本研究從谷子品種濟(jì)谷22中克隆獲得SiNCED3，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析其在谷子不同組織及不同脅迫處理下的表達(dá)差異，以期為深入探究SiNCED3的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料處理及樣品采集

供試谷子品種為山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所育成的濟(jì)谷22。

2021年4月于光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行谷子幼苗培養(yǎng)，設(shè)置溫度25℃、光照/黑暗16 h/8 h、光強(qiáng)8 000 lx，待幼苗長(zhǎng)至四葉期時(shí)，一部分取地上部分樣品，液氮速凍后放-80℃超低溫冰箱保存，用于SiNCED3的克??；一部分進(jìn)行逆境脅迫處理。

共設(shè)置3種逆境脅迫處理:干旱處理，于培養(yǎng)液中加入20%(w/v)PEG-6000模擬干旱；鹽脅迫處理，于營(yíng)養(yǎng)液中加入120 mmol/L NaCl；4℃低溫處理。以正常培養(yǎng)為對(duì)照。分別在處理0、3、6、12、24、48 h取地上部分樣品，做好標(biāo)記，液氮速凍后放-80℃超低溫冰箱保存，用于基因表達(dá)分析。以上試驗(yàn)均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

2021年6月在大田種植的濟(jì)谷22開(kāi)花期前，取根、莖、葉、葉鞘、穗，液氮速凍后放-80℃超低溫冰箱保存，用于SiNCED3在不同組織中的表達(dá)分析。

1.2 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

將-80℃保存的不同試驗(yàn)材料置于研缽中用液氮研磨成粉后，按照植物基因組總RNA提取試劑盒(SparkJade)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取，之后采用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于基因克隆及實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

1.3 SiNCED3基因全長(zhǎng)克隆

根據(jù)Phytozome(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)公布的谷子NCED基因序列(Seita.9G156500)設(shè)計(jì)引物(F:5′-ATGGCGATGCTTGTTCGGGGTCTCGCTCCGCCGCCCACCTCTGTTTCTT CCATACACC-3′；R:5′-CTACGAGTCCTCACGTGGAGGTAGGTGGGGAAC-3′)，由上海生工生物工程股份有限公司合成，然后以反轉(zhuǎn)錄的濟(jì)谷22 cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系總體積50 μL，包括2×PCR Buffer for KOD FX 25.0 μL，2 mmol/L dNTP 10.0 μL，Primer F、R各1.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 10.0 μL，KOD FX 1.0 μL。將各組分清彈混勻，短暫瞬時(shí)離心收集于離心管底，將離心管置于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)?94℃2 min；98℃10 s，56℃30 s，68℃2 min，35個(gè)循環(huán)；68℃5 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，以Marker 2000做比對(duì)，切下目的片段，按照膠回收試劑盒(SparkJade)回收目的片段。將目的片段克隆至pEasy-Blunt載體(TransGen Biotech)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂含有Amp的抗性LB培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，挑選單克隆搖菌，菌液送鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAMAN進(jìn)行比對(duì)。

1.4 生物信息學(xué)分析

使用在線軟件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預(yù)測(cè)基因啟動(dòng)子，并用Phytozome獲取基因序列上游2 000 bp的啟動(dòng)子序列，進(jìn)行順式元件分析。

使用在線軟件ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白的基本理化性質(zhì)，包括氨基酸數(shù)、分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)和平均親水系數(shù)等。

利用SignalP 4.1 Server(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-4.1)，輸入氨基酸序列，預(yù)測(cè)是否含有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。

利用WoLF PSORT Prediction(https://psort.hgc.jp/)輸入氨基酸序列，進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，選擇預(yù)測(cè)膜定位分析數(shù)量最高的作為亞細(xì)胞定位結(jié)果。

使用CDD數(shù)據(jù)庫(kù)在線網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，輸入氨基酸序列，進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索并下載擬南芥、水稻、玉米、煙草、狗尾草的NCED蛋白氨基酸序列，利用MEGA 11軟件中內(nèi)置的鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建它們與SiNCED3蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，其中Boot-strap重復(fù)次數(shù)默認(rèn)1 000。

使用PBIL的SOMPA在線網(wǎng)站(https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page＝npsa_sopma.html)，輸入氨基酸序列，Number of conformational states設(shè)置 選 擇4(Helix，Sheet，Turn，Coil)，Similarity threshold設(shè)置選擇8，進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。三級(jí)結(jié)構(gòu)利用Expasy的SWISSMODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)進(jìn)行預(yù)測(cè)，根據(jù)氨基酸排列規(guī)則，選擇整體質(zhì)量估計(jì)分?jǐn)?shù)高的構(gòu)建蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)艾科瑞(AG)生物工程有限公司的熒光定量染液SYBR Green試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)體系如下:2×SYBR Green ProTaqHS Premix 5.0 μL，引物各0.2 μL，ddH2O 3.6 μL，cDNA 1.0 μL，總體積10.0 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR程序設(shè)置如下:預(yù)變性95℃2 min；PCR反應(yīng)95℃5 s，60℃30 s，72℃30 s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線95℃5 s，60℃1 min，95℃持續(xù)；保溫50℃30 s。所 有 數(shù) 據(jù) 經(jīng) 擴(kuò) 增 谷 子Actin基 因(LOC101779009)進(jìn)行均一化處理，每個(gè)基因進(jìn)行3次重復(fù)，依據(jù)2-△△Ct方法[21]對(duì)SiNCED3的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 SiNCED3基因的克隆

經(jīng)PCR擴(kuò)增，獲得一條約2 000 bp的條帶(圖1)。切膠回收連接至pEasy-Blunt載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取陽(yáng)性單克隆進(jìn)行測(cè)序，DNAMAN比對(duì)和NCBI-Blast結(jié)果顯示，其CDNA全長(zhǎng)1 836 bp，與水稻OsNCED3(XM_015776052.1)相似性高達(dá)89.63%。并將序列上傳NCBI(OM674734)。

圖1 SiNCED3基因PCR擴(kuò)增圖譜

2.2 啟動(dòng)子元件分析

如表2、圖2所示，除含有較多基本元件Abox、TATA-box、CAAT-box外，SiNCED3基因還含有較多光響應(yīng)元件，占比達(dá)到21%，另外還含有2種激素響應(yīng)元件(ABRE、TGA-element)和2種脅迫響應(yīng)元件(GC-motif、MBS)。這些順式作用元件可能導(dǎo)致SiNCED3參與谷子對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答。

表2 啟動(dòng)子元件分析結(jié)果

圖2 SiNCED3啟動(dòng)子元件分布

2.3 SiNCED3蛋白基本理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 基本理化性質(zhì)SiNCED3編碼一個(gè)含有611個(gè)氨基酸的蛋白，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為66.36kD，等電點(diǎn)(pI)為6.15，脂肪族系數(shù)為79.08，不穩(wěn)定指數(shù)為39.90，親水指數(shù)平均為-0.212，推測(cè)SiNCED3蛋白是一個(gè)穩(wěn)定的疏水蛋白；信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示其無(wú)信號(hào)肽序列，屬于非分泌蛋白。亞細(xì)胞定位于葉綠體。

保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果(圖3)顯示，SiNCED3蛋白氨基酸序列的第12～611位特定匹配于NCED家族保守結(jié)構(gòu)域PLN02258，內(nèi)含一個(gè)NCED家族典型結(jié)構(gòu)域RPE65。

圖3 SiNCED3蛋白結(jié)構(gòu)域

2.3.2 二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 預(yù)測(cè)結(jié)果(圖4)表明，SiNCED3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈構(gòu)成，其平均占比分別為58.10%和21.77%；α螺旋和β轉(zhuǎn)角較少，其平均占比分別為15.06%和5.07%。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果(圖5)顯示，預(yù)測(cè)模板為3npe.1.A(9-順式-環(huán)氧類(lèi)胡蘿卜素雙加氧酶蛋白)，SiNCED3蛋白與3npe.1.A匹配度高達(dá)93.33%，兩個(gè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)圖極其相似，GMQE值為0.9，表明模型整體質(zhì)量較好，預(yù)測(cè)結(jié)果可用。

圖4 SiNCED3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖5 SiNCED3蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)

2.4 SiNCED3蛋白進(jìn)化分析

用NCBI中公布的擬南芥、水稻、玉米、煙草、狗尾草的NCED氨基酸序列與SiNCED3的氨基酸序列構(gòu)建蛋白進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果(圖6)顯示，可分為兩個(gè)分支，SiNCED3與同屬于單子葉C4作物的玉米NCED4親緣關(guān)系最近。

圖6 SiNCED3蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.5 SiNCED3基因表達(dá)模式分析

2.5.1 在谷子不同組織中的表達(dá) 結(jié)果(圖7)表明，SiNCED3在根、莖、葉、葉鞘、穗中均有表達(dá)。在根中的表達(dá)量最高，相對(duì)表達(dá)量顯著高于在其它組織中；在莖中的表達(dá)量次之，顯著高于在穗和葉中的表達(dá)量；在葉中的表達(dá)量最低。

圖7 SiNCED3在不同組織中的表達(dá)量

2.5.2 在不同逆境脅迫下的表達(dá) 結(jié)果(圖8)表明，3種脅迫處理均可不同程度誘導(dǎo)SiNCED3的表達(dá)。20% PEG-6000處理6 hSiNCED3表達(dá)量最高(8.87)，約為對(duì)照的8倍。鹽脅迫處理下，SiNCED3在處理0～12 h表達(dá)量較高，處理6 h達(dá)到最高(3.57)，24～48 h表達(dá)量極低。4℃低溫脅迫處理下，SiNCED3基因表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后下降再升高的趨勢(shì)，最高值出現(xiàn)在處理3 h，相對(duì)表達(dá)量為8.00，處理48 h出現(xiàn)第2個(gè)峰值，相對(duì)表達(dá)量為7.44。

圖8 SiNCED3在不同逆境脅迫下的表達(dá)量

3 討論與結(jié)論

ABA在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫耐受性過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。本研究從濟(jì)谷22中克隆獲得ABA合成的關(guān)鍵限速酶基因SiNCED3，該基因編碼611個(gè)氨基酸，其蛋白無(wú)信號(hào)肽序列，屬于非分泌蛋白，亞細(xì)胞定位于葉綠體中，與玉米的ZmNCED4親緣關(guān)系最近，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈構(gòu)成；該基因啟動(dòng)子序列中除含有基本元件(A-box、TATA-box、CAAT-box)外，還含有光響應(yīng)元件(sp1、G-box、GT1-motif、LAMPelement)、激素響應(yīng)元件(ABRE、TGA-element)和逆境脅迫響應(yīng)元件(GC-motif、MBS)，可能導(dǎo)致SiNCED3參與谷子對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答。

早期人們認(rèn)為，植物葉片是ABA合成的主要部位[22]。后來(lái)證實(shí)，離體的根系，特別是根尖(根毛區(qū)至根冠)，在緩慢脫水時(shí)能合成大量ABA；非離體根在脅迫下也能夠合成ABA。其它器官如花、果實(shí)和種子也能合成ABA。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，SiNCED3在谷子根、莖、葉、葉鞘、穗中均有表達(dá)，且在根中的表達(dá)量最高，在葉中的表達(dá)量最低。

ABA在植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中的一個(gè)重要功能是調(diào)節(jié)植株對(duì)干旱、鹽分、寒冷等逆境脅迫的反應(yīng)。王贊等[23]研究表明低溫脅迫能夠誘導(dǎo)茶樹(shù)中CsNCED2基因顯著上調(diào)表達(dá)；Huang等[24]研究表明高鹽和干旱脅迫都顯著誘導(dǎo)了水稻地上部和根部的OsNCED5表達(dá)。本研究結(jié)果也證實(shí)干旱、高鹽以及低溫脅迫誘導(dǎo)了谷子體內(nèi)SiNCED3基因的表達(dá)，其中，干旱脅迫3～6 h的表達(dá)量較高，鹽脅迫3～12 h的表達(dá)量較高，而4℃低溫處理3 h和24～48 h的相對(duì)表達(dá)量較高。初步表明SiNCED3能夠參與谷子對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)，可為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)。