江 淦，楊于權(quán)，陳曜星，侯照遠(yuǎn)，高小玲，陳紅專，3#，賈 浩#

1.上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)與化學(xué)生物學(xué)系，上海高校轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 200025；2.上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子細(xì)胞生物學(xué)系，上海市腫瘤微環(huán)境與炎癥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200025；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)交叉科學(xué)研究院，上海 201203

嚴(yán)重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndromes，SARS）冠狀病毒和中東呼吸綜合征冠狀病毒均可誘導(dǎo)持續(xù)的巨胞飲作用，而抑制該作用可降低相關(guān)的病毒滴度［1］。值得注意的是，細(xì)胞因子、趨化因子和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）均可誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞的巨胞飲作用，提示合并感染或者炎癥因子風(fēng)暴會(huì)進(jìn)一步加強(qiáng)細(xì)胞的巨胞飲作用［2-3］。此前已有預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）的蛋白與人細(xì)胞蛋白之間存在蛋白-蛋白相互作用，且與細(xì)胞骨架和許多其他功能蛋白密切相關(guān)［2，4］。因此，探索SARS-COV-2 原始株蛋白對(duì)促進(jìn)細(xì)胞尤其是炎癥相關(guān)細(xì)胞的巨胞飲作用具有重要的價(jià)值和意義。

巨胞飲是一種高度保守的內(nèi)吞途徑，蛋白質(zhì)、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、病毒等胞外物質(zhì)通過(guò)刺激細(xì)胞膜形成褶皺，進(jìn)而形成可被內(nèi)化的巨胞飲囊泡。在細(xì)胞中，巨胞飲受多種與肌動(dòng)蛋白、微絲重構(gòu)、皺褶形成、囊泡形成等相關(guān)的基因的調(diào)控。正常狀態(tài)下，巨胞飲作用與細(xì)胞生長(zhǎng)、抗原提呈、凋亡細(xì)胞清除等有關(guān)［5-7］。而在病理狀態(tài)（如腫瘤、炎癥等）下，巨胞飲作用將會(huì)被上調(diào)［8-9］，尤其是在囊膜病毒（如冠狀病毒、流感病毒、HIV病毒、埃博拉病毒等）中。這些病毒可利用巨胞飲途徑進(jìn)入細(xì)胞，在病毒感染后4 h即可啟動(dòng)復(fù)制，而在病毒衣殼蛋白、核苷酸物質(zhì)完全進(jìn)入細(xì)胞后更加顯著，并在病毒復(fù)制、細(xì)胞間傳播中起到重要作用，該過(guò)程與囊膜表面的糖蛋白、病毒表面蛋白促進(jìn)宿主細(xì)胞的巨胞飲作用均有關(guān)聯(lián)［10-13］。因此，SARS-COV-2原始株表面及其入侵相關(guān)的病毒蛋白是否能夠促進(jìn)細(xì)胞的巨胞飲作用需要進(jìn)一步的探索。

基于此，本研究通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)、高內(nèi)涵篩選、共聚焦顯微成像、流式細(xì)胞術(shù)等分析原始株SARS-CoV-2 的表面蛋白——刺突蛋白受體結(jié)合域（spike protein receptor-binding domain，S-RBD）、核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N）和SARS-CoV-2的入侵相關(guān)蛋白——非結(jié)構(gòu)蛋白7（non-structural protein-7，NSP7）等病毒蛋白與細(xì)胞內(nèi)蛋白的相互作用，及與多種細(xì)胞模型的巨胞飲水平的關(guān)系。同時(shí)，在本課題組的前期研究［14-15］中，我們已建立了可遞送干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA）的脂蛋白納米藥物載體平臺(tái)，該系統(tǒng)可通過(guò)巨胞飲作用被靶細(xì)胞內(nèi)化。因此，本研究再利用5-（N-乙基-N-異丙基）阿米洛利（EIPA，一種巨胞飲的內(nèi)吞作用抑制劑）、載帶Rab5siRNA 的磷酸鈣-重組高密度脂蛋白（CaP-rHDL）納米藥物載體共2 種方式干擾巨胞飲水平，以分析細(xì)胞對(duì)病毒蛋白的攝取情況，從而為可能的抑制巨胞飲作用的潛在先導(dǎo)藥物研究提供篩選通路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞及質(zhì)粒 人胚腎細(xì)胞HEK-293T、小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3 均購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心，人支氣管上皮細(xì)胞Beas-2b 由上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院沈瑛課題組惠贈(zèng)。表達(dá)質(zhì)粒His-SARS-CoV-2 SRBD、His-SARS-CoV-2 N 和His-SARS-CoV-2 NSP7均由上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院陶生策教授惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 His（sc-8036）抗體、Rab5（sc-46692）抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司，快速銀染試劑盒（P0017S）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，1，2-油?；字幔―OPA）、1，2-二肉豆蔻酰-SN-甘油-3-磷酰膽堿（DMPC）均購(gòu)自美國(guó)Avanti Polar Lipids 公司，重組人載脂蛋白E3（apoliprotein E3，ApoE3）購(gòu)自美國(guó)派普泰克公司，質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Axygene公司，RNA提取試劑、BCA 蛋白定量試劑盒和探針?lè)晒舛縋CR 試劑盒（qPCR Mix）均購(gòu)自翌圣生物科技（上海）股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 納米藥物載體的制備 采用反相微乳法制備載有Rab5siRNA 的磷酸鈣藥物核心，并進(jìn)一步與4 mg DMPC 混合。37 ℃下，將該混合物于旋蒸儀（德國(guó)，Büchi）上（100 r/min）旋蒸1 h 以去除氯仿，并形成含磷酸鈣藥物的磷脂薄膜。將獲得的脂質(zhì)膜用4 mL 雙蒸水進(jìn)行水化，并行短暫的超聲處理。而后，將上述脂質(zhì)體與ApoE3于37 ℃下孵育36 h（ApoE3與DMPC的質(zhì)量比為1∶8），以獲得載帶Rab5siRNA 的磷酸鈣-重組高密度脂蛋白（CaP-rHDL）納米藥物載體。

1.2.2 重組蛋白的表達(dá)與純化 將表達(dá)質(zhì)粒His-SARS-CoV-2 S-RBD、His-SARS-CoV-2 N 原 始 株 和His-SARS-CoV-2 NSP7 分別轉(zhuǎn)入大腸埃希菌E.coliBL21 感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)倒置培養(yǎng)后將獲得的陽(yáng)性克隆接種于5 mL LB 液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL 羧芐青霉素），并于37 ℃、180 r/min 下震蕩3 h。當(dāng)細(xì)菌培養(yǎng)液D（600 nm）達(dá)到0.6～0.8 時(shí)，分別向其中加入0.2 μmmol/L IPTG，并于150 r/min搖床上16 ℃過(guò)夜。經(jīng)離心后，將細(xì)菌沉淀重懸于裂解緩沖液［含50 μmol/L Tris-HCl （pH 8.0）、500 μmol/L NaCl 和20 μmol/L咪唑（pH 8.0）］中。將裂解后的上述3種菌體上清液分別經(jīng)鎳柱瓊脂糖珠純化后，再用裂解緩沖液進(jìn)行洗滌，最后用1 mL 緩沖液［含50 μmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、500 μmol/L NaCl 和300 μmol/L咪唑（pH 8.0）］洗脫后凍存。

1.2.3 質(zhì)譜法鑒定SARS-CoV-2 原始株的S-RBD、N、NSP7病毒蛋白的互作蛋白 將SARS-CoV-2原始株的S-RBD、N、NSP7病毒蛋白分別與HEK-293T細(xì)胞 共 孵 育 后 ， 采 用 免 疫 共 沉 淀 （coimmunoprecipitation） 和蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）分析與病毒蛋白相互作用的胞內(nèi)蛋白；其中，前者分別使用His抗體和Rab5抗體進(jìn)行富集，后者采用8%的分離膠進(jìn)行蛋白純化，具體步驟見前期研究［16］。隨后，用質(zhì)譜法（Mass Spectrometry，MS）檢測(cè)與原始株病毒蛋白發(fā)生相互作用的蛋白。本實(shí)驗(yàn)所用蛋白組學(xué)檢測(cè)及分析均委托上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)公共技術(shù)平臺(tái)——蛋白組學(xué)平臺(tái)完成。

1.2.4 SARS-CoV-2 原始株的病毒蛋白的細(xì)胞攝取和巨胞飲水平分析

（1）高內(nèi)涵篩選：分別將HEK-293T、bEnd.3 和Beas-2b 細(xì)胞（正常細(xì)胞模型）接種至96 孔板中，并于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜。將上述3 種細(xì)胞分別與SARS-CoV-2 原始株的病毒蛋白（S-RBD、N和Nsp7）或DMEM 培養(yǎng)基在37 ℃下孵育1.5 h 或8.5 h， 再分別向其中添加異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的70 kDa 葡聚糖（FITC-70 kDa-葡聚糖，即巨胞飲特異性標(biāo)志物）后共培養(yǎng)1.5 h。將上述細(xì)胞進(jìn)行洗滌、4%甲醛固定后，于高內(nèi)涵篩選進(jìn)行分析。

（2）共聚焦顯微成像及流式細(xì)胞儀分析：將HEK-293T細(xì)胞（正常細(xì)胞模型）分別接種至96孔板或12 孔板中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜。取1 μg/mL LPS 與HEK-293T 細(xì) 胞 共 孵 育24 h，獲 得LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞模型。將上述正常細(xì)胞、炎癥細(xì)胞分別與75 μmol/L EIPA 或DMEM 培養(yǎng)基預(yù)孵育0.5 h，再分別與SARS-CoV-2 原始株的病毒蛋白（SRBD、N 和Nsp7）于37 ℃下孵育1.5 h，而后分別向其中添加FITC-70 kDa-葡聚糖，共培養(yǎng)1.5 h。經(jīng)固定后，將上述細(xì)胞分別與His 抗體共孵育過(guò)夜，再行熒光二抗孵育，于共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光水平，再利用Image J軟件對(duì)共聚焦圖像中的熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析；或通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)上述細(xì)胞的熒光水平，以反映細(xì)胞的巨胞飲水平及病毒蛋白入胞的變化。

1.2.5 經(jīng)納米藥物載體處理后細(xì)胞的巨胞飲水平分析 將載帶Rab5siRNA 的磷酸鈣-重組高密度脂蛋白（CaP-rHDL）納米藥物載體與HEK-293T 細(xì)胞孵育12 h 后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative realtime PCR，qPCR）和Western blotting 分析Rab5的表達(dá)，以驗(yàn)證其敲低水平。而后，以Rab5被抑制的HEK-293T細(xì)胞為對(duì)象，將其分別與3個(gè)SARS-CoV-2原始株的病毒蛋白于37 ℃下孵育1.5 h，添加FITC-70 kDa-葡聚糖后共培養(yǎng)1.5 h，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)上述細(xì)胞的熒光水平變化。Rab5siRNA 由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，序列如表1。

表1 Rab5 siRNA序列Tab 1 Sequences of Rab5 siRNA

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用皮爾森相關(guān)系數(shù)對(duì)細(xì)胞的共聚焦圖像進(jìn)行分析，表征His 標(biāo)簽的病毒蛋白與巨胞飲囊泡（FITC-70 kDa-葡聚糖）的共定位水平。采用單因素方差分析（oneway ANOVA）、雙因素方差分析（two-way ANOVA）對(duì)細(xì)胞熒光水平進(jìn)行比較，并采用Bonferroni 進(jìn)行檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SARS-CoV-2原始株的S-RBD、N和NSP-7入胞后與Rab家族蛋白結(jié)合

本研究用表達(dá)質(zhì)粒His-SARS-CoV-2 S-RBD、His-SARS-CoV-2 N 和His-SARS-CoV-2 NSP7原始株模擬病毒蛋白感染的過(guò)程，分析病毒蛋白在HEK-293T原始株細(xì)胞中的表達(dá)。Western blotting檢測(cè)結(jié)果（圖1）顯示，經(jīng)純化和表達(dá)的His-S-RBD、His-N和His-NSP7蛋白具有良好的特異性，與之前的報(bào)道［17］相一致。

圖1 Western blotting 檢測(cè)His-S-RBD、His-N 和His-NSP7 蛋白的純化表達(dá)Fig 1 Detection of purified expressions of His-S-RBD, His-N and His-NSP7 proteins by Western blotting

隨后，在HEK-293T 細(xì)胞中利用免疫共沉淀技術(shù)分析與S-RBD、N 和NSP7 病毒蛋白的互作蛋白，經(jīng)純化、分離、銀染后我們發(fā)現(xiàn)互作蛋白存在不同的條帶（圖2A）；繼而表明，SARS-CoV-2 原始株的3 個(gè)病毒蛋白可與細(xì)胞內(nèi)多種蛋白發(fā)生相互作用。通過(guò)MS 對(duì)上述條帶進(jìn)行分析，我們鑒定得到了大量的互作蛋白，其中Rab小GTPase超家族分別與3個(gè)病毒蛋白的結(jié)合數(shù)量均較多，即與S-RBD 蛋白結(jié)合了101 個(gè)、與N 蛋白結(jié)合了97 個(gè)、與NSP7 蛋白結(jié)合了111個(gè)（圖2B）。進(jìn)一步我們發(fā)現(xiàn)，在與NSP7結(jié)合的Rab 小GTPase 超家族中，Rab5 的表達(dá)量最高（圖2C），且先前研究［18］提示Rab5 參與了巨胞飲的調(diào)控過(guò)程，故本研究提示病毒蛋白入胞后可能參與調(diào)控巨胞飲通路。此觀點(diǎn)有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

隨后，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中我們利用His 抗體進(jìn)行富集，再采用Western blotting 對(duì)富集結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖2D）顯示SARS-CoV-2 原始株的病毒蛋白（S-RBD、N 和NSP7）在HEK-293T 細(xì)胞中均可與內(nèi)源性Rab5 蛋白相互作用；且與S-RBD、N 蛋白相比，SARS-CoV-2原始株的NSP7蛋白與Rab5的結(jié)合更強(qiáng)。與此同時(shí)，我們利用Rab5 抗體進(jìn)行富集后再行Western blotting 檢測(cè)，結(jié)果（圖2E）顯示，內(nèi)源性Rab5 蛋白也能與SARS-CoV-2 原始株蛋白（S-RBD、N和NSP7）相結(jié)合。

圖2 SARS-COV-2原始株的S-RBD、N和NSP7蛋白與Rab5小GTPase家族蛋白的相互作用Fig 2 Interaction between S-RBD,N and NSP7 proteins of SARS-COV-2 and Rab5 small GTPase family proteins

2.2 SARS-CoV-2原始株的S-RBD、N和NSP-7蛋白可以增強(qiáng)HEK-293T/bEnd.3/Beas-2b 細(xì)胞的巨胞飲水平

于體外檢測(cè)SARS-CoV-2 原始株的關(guān)鍵蛋白（SRBD、N 和NSP7）能否刺激3 種正常細(xì)胞模型產(chǎn)生巨胞飲作用。本研究利用高內(nèi)涵篩選分析細(xì)胞模型內(nèi)化FITC-70 kDa-葡聚糖后的熒光水平。在HEK-293T細(xì)胞模型中，共聚焦顯微成像顯示，分別與S-RBD、N 和NSP7 病毒蛋白孵育3 h 后的細(xì)胞內(nèi)化FITC-70 kDa-葡聚糖的能力均高于DMEM 組（均P＜0.05，圖3A、3B）；且S-RBD、N 和NSP7 病毒蛋白被攝取入胞后，均可與FITC-70 kDa-葡聚糖共定位（圖3C、3D）。流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果（圖3E）同樣顯示，在分別與3 個(gè)病毒蛋白孵育3 h 后，細(xì)胞的巨胞飲作用均有所增強(qiáng)。綜合上述結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，SARS-COV-2 原始株的S-RBD、N 和NSP7 病毒蛋白可刺激HEK-293T細(xì)胞的巨胞飲作用。

圖3 SARS-COV-2原始株的S-RBD、N和NSP7蛋白刺激HEK-293T細(xì)胞的巨胞飲作用Fig 3 S-RBD,N and NSP7 proteins of SARS-COV-2 stimulated the macropinocytosis in HEK-293T cells

同時(shí)，在bEnd.3細(xì)胞模型、Beas-2b細(xì)胞模型中，共聚焦顯微鏡結(jié)果（圖4A～4D） 顯示，分別與SARS-COV-2 原始株的S-RBD、N 和NSP7 病毒蛋白孵育后，上述2 種細(xì)胞的胞內(nèi)FITC-70 kDa-葡聚糖水平也有顯著上調(diào)。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果（圖4E、4F）亦顯示，分別與3個(gè)病毒蛋白孵育3 h后，該2種細(xì)胞的巨胞飲水平均有所增強(qiáng)。

圖4 SARS-COV-2原始株的S-RBD、N和NSP7蛋白刺激bEnd.3和Beas-2b細(xì)胞的巨胞飲作用Fig 4 S-RBD,N and NSP7 proteins of SARS-COV-2 stimulated the macropinocytosis in bEnd.3 and Beas-2b cells

2.3 SARS-CoV-2原始株的S-RBD、N和NSP-7蛋白可以增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞的巨胞飲水平

本研究進(jìn)一步分析相關(guān)病毒蛋白對(duì)炎癥細(xì)胞的巨胞飲作用。共聚焦顯微成像結(jié)果（圖5A、5B）顯示，分別與原始株S-RBD、N 和NSP7 病毒蛋白孵育后，LPS 誘導(dǎo)的HEK-293T 細(xì)胞的巨胞飲作用均有明顯上升；且S-RBD、NSP7 病毒蛋白與FITC-70 kDa-葡聚糖有明顯的共定位，而N 病毒蛋白共定位的系數(shù)較低。流式細(xì)胞術(shù)分析的結(jié)果（圖5C）顯示，LPS 誘導(dǎo)的HEK-293T 細(xì)胞在分別與S-RBD 原始株、N 和NSP7 病毒蛋白孵育后，其攝取的FITC-70 kDa-葡聚糖的水平較未經(jīng)LPS 誘導(dǎo)的HEK-293T 細(xì)胞有顯著升高。這些結(jié)果均提示，SARS-CoV-2 原始株的病毒蛋白可誘導(dǎo)多種細(xì)胞特別是炎癥細(xì)胞的巨胞飲作用，且在合并炎癥的情況下可能會(huì)進(jìn)一步加強(qiáng)細(xì)胞對(duì)病毒蛋白的攝取能力。

圖5 SARS-CoV-2原始株的S-RBD、N和NSP-7蛋白刺激LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞的巨胞飲作用Fig 5 S-RBD,N and NSP7 proteins of SARS-COV-2 stimulated the macropinocytosis in LPS-induced inflammatory cells

2.4 EIPA 可以抑制由SARS-CoV-2 原始株的SRBD、N 和NSP-7 蛋白刺激的正常及炎癥細(xì)胞的巨胞飲水平

采用共聚焦顯微成像和流式細(xì)胞術(shù)就巨胞飲抑制劑——EIPA 對(duì)病毒蛋白刺激的巨胞飲水平的抑制作用及對(duì)His 標(biāo)記的病毒蛋白進(jìn)入細(xì)胞模型的抑制作用進(jìn)行分析。在EIPA 的預(yù)處理下，無(wú)論是正常細(xì)胞還是LPS 誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞，由S-RBD、N 和NSP7 原始株病毒蛋白刺激的巨胞飲水平都受到了顯著抑制（圖6A、6B）。這一結(jié)果表明，EIPA 可以通過(guò)抑制細(xì)胞巨胞飲水平來(lái)抑制病毒蛋白的入胞。

圖6 EIPA抑制正常細(xì)胞、LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞的巨胞飲水平，以及His標(biāo)記的SARS-CoV-2原始株病毒蛋白的攝入Fig 6 EIPA could inhibit the macropinocytosis level in normal cells and LPS-induced inflammatory cells, and the uptake of His-labeled SARS-CoV-2 proteins

2.5 Rab5 siRNA 納米載體可以抑制由SARS-CoV-2原始株的S-RBD、N 和NSP-7蛋白刺激的巨胞飲水平

將載帶Rab5siRNA的納米藥物載體與HEK-293T細(xì)胞共孵育后，分別采用qPCR 和Western blotting 進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖7A、7B）發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中的Rab5的mRNA及蛋白表達(dá)均被有效抑制。隨后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)被抑制Rab5表達(dá)的細(xì)胞分別與3 個(gè)病毒蛋白孵育后的巨胞飲水平變化，結(jié)果（圖7C）顯示，在100 nmol/L siRab5-1濃度孵育12 h后，Rab5siRNA納米藥物載體可有效抑制由該3 個(gè)病毒蛋白引起的細(xì)胞巨胞飲作用。因此，綜合上述結(jié)果我們推測(cè)，Rab5可能是抑制由SARS-CoV-2原始株的病毒蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞巨胞飲上調(diào)的潛在靶點(diǎn)。

圖7 Rab5 siRNA納米藥物載體抑制由SARS-COV-2原始株的病毒蛋白上調(diào)的細(xì)胞巨胞飲作用Fig 7 Lipoprotein nano-drug carriers loaded with Rab5 siRNA could inhibit the macropinocytosis level up-regulated by SARS-COV-2 viral proteins

3 討論

本研究表明，SARS-CoV-2原始株相關(guān)病毒蛋白可上調(diào)多種正常細(xì)胞和LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞中的巨胞飲水平，在有囊膜病毒入胞后，病毒蛋白與細(xì)胞內(nèi)的正常蛋白可相互作用。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)利用巨胞飲抑制劑——EIPA和之前建立的Rab5siRNA脂蛋白納米藥物載體均可有效減少相關(guān)病毒蛋白上調(diào)的巨胞飲過(guò)程。

巨胞飲途徑在多種細(xì)胞的病理生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，并受到多種胞外物質(zhì)的調(diào)控［19］。目前，SARS-CoV-2原始株已被證明能夠通過(guò)巨胞飲作用的方式形成病毒復(fù)制復(fù)合物以修飾細(xì)胞質(zhì)膜［1，20］。且相關(guān)研究［21］顯示，包括SARS-CoV-2在內(nèi)的多種病毒均可利用巨胞飲途徑進(jìn)入細(xì)胞，這種入侵方式可適應(yīng)其顆粒的大小并實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。我們推測(cè)，SARS-CoV-2原始株可能存在同樣的細(xì)胞侵入方式。但由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，本研究只能探索SARS-CoV-2 原始株的關(guān)鍵幾種病毒蛋白與模型細(xì)胞孵育后的相互作用，結(jié)果顯示在有囊膜病毒入胞后確實(shí)存在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用。有研究［4］已發(fā)現(xiàn)Rab家族可能參與了這種相互作用，將SARS-CoV-2 原始株病毒攜帶至細(xì)胞器；繼而提示，該家族可能是一種關(guān)鍵的下游蛋白，能夠進(jìn)一步刺激細(xì)胞產(chǎn)生巨胞飲。

除此之外，新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）重癥患者的細(xì)胞因子風(fēng)暴程度遠(yuǎn)高于輕癥患者，且細(xì)胞因子風(fēng)暴與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)［22］。與正常細(xì)胞相比，炎癥細(xì)胞具有更高水平的巨胞飲作用，小G蛋白超家族小分子鳥苷三磷酸酶在LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞模型中更為豐富和活躍。因此，SARS-CoV-2 原始株的病毒蛋白是否會(huì)導(dǎo)致炎癥細(xì)胞內(nèi)的巨胞飲水平顯著上升，使得在感染后期病毒進(jìn)入細(xì)胞的數(shù)量增加，導(dǎo)致進(jìn)一步的感染從而形成惡性循環(huán)，值得我們繼續(xù)探索。

在腫瘤細(xì)胞中，該類細(xì)胞可利用顯著增加的巨胞飲途徑大量攝取入胞的藥物制劑，使得正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞間存在攝取差異，從而實(shí)現(xiàn)靶向腫瘤的給藥。而在炎癥細(xì)胞中，同樣存在被上調(diào)的巨胞飲機(jī)制，因此同樣可以利用炎癥細(xì)胞主動(dòng)攝取通過(guò)巨胞飲途徑入胞的藥物制劑，提高對(duì)炎癥細(xì)胞的主動(dòng)靶向給藥效率。由于SARSCoV-2原始株的病毒蛋白確實(shí)可以刺激炎癥細(xì)胞更高水平的巨胞飲囊泡形成，因此，我們采用定制的脂蛋白納米藥物載體作為工具，利用其巨胞飲這一主要攝取途徑，將siRab5輸送到這些模型細(xì)胞中，抑制Rab5的水平從而抑制蛋白-蛋白的相互作用。此外，EIPA是一種臨床批準(zhǔn)的利尿劑，同樣也可以抑制細(xì)胞的巨胞飲水平，從而抑制病毒的入胞，然而該藥物在肺部和靶細(xì)胞的富集尚不如納米藥物載體的靶向富集效果。由于條件受限，本研究尚無(wú)法進(jìn)一步完成假病毒實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)的驗(yàn)證，且近期有報(bào)道提示EIPA僅在較高濃度時(shí)（80 μmol/L）可對(duì)Spike的假病毒模型入侵293T細(xì)胞有抑制效果，但在體內(nèi)、合并炎癥感染或重癥炎癥因子風(fēng)暴產(chǎn)生時(shí)是否有更明顯的差異，還需進(jìn)一步的探索?？傊?，本研究提示了巨胞飲機(jī)制在SARS-CoV-2原始株感染中的作用以及抑制該機(jī)制的潛在靶點(diǎn)，或?qū)橛嗅槍?duì)性的先導(dǎo)藥物篩選提供參考。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。All authors disclose no relevant conflict of interests.

作者貢獻(xiàn)/Authors'Contributions

江淦、賈浩參與了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和論文寫作；楊于權(quán)、陳曜星協(xié)助完成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；侯照遠(yuǎn)、高小玲、陳紅專、賈浩和江淦參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed and verified by JIANG Gan and JIA Hao.The manuscript was written by JIANG Gan and JIA Hao. The experiments were carried out by YANG Yuquan and CHEN Yaoxing. The manuscript was drafted and revised by HOU Zhaoyuan，GAO Xiaoling，CHEN Hongzhuan，JIA Hao and JIANG Gan. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-03-16

檢測(cè)工作貫穿于瀝青混凝土路面施工的全過(guò)程，碾壓成型后的路面必須滿足設(shè)計(jì)及規(guī)范的要求。檢測(cè)內(nèi)容包括：平整度、厚度、寬度、高程等。鉆芯取樣的試件送到試驗(yàn)室后，要做馬歇爾試驗(yàn)及其他試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，準(zhǔn)確評(píng)價(jià)瀝青混凝土路面的物理力學(xué)性能。檢測(cè)項(xiàng)目主要包括：壓實(shí)度、空隙率、容重、穩(wěn)定度、流值等。

·Accepted：2022-05-18

·Published online：2022-06-29

參·考·文·獻(xiàn)

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