龐 菲，王彎彎，郝瑞瑞，周甜雨，陳世忠*，靳洪濤, 4, 5*

香丹注射液中致類過敏反應成分篩選及機制初探

龐 菲1，王彎彎2，郝瑞瑞1，周甜雨3，陳世忠2*，靳洪濤1, 4, 5*

1. 中國醫(yī)學科學院，北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所，新藥安全評價研究中心，北京 100050 2. 北京大學藥學院，北京 100191 3. 陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046 4. NMPA創(chuàng)新藥物安全性研究與評價重點實驗室，北京 102206 5. 北京協(xié)和建昊醫(yī)藥技術開發(fā)有限責任公司，北京 100176

篩選香丹注射液中可能存在的致類過敏成分并探討其作用機制。使用Auto Dock Tools Vina軟件，以人類Mas相關G蛋白偶聯(lián)受體X2（Mas-related G protein-coupled receptor X2，MRGPRX2）和小鼠MRGPRb2為目標蛋白，對香丹注射液中的水溶性酚酸類物質進行分子對接，并將香丹注射液及與MRGPRX2和MRGPRb2有較高結合（≤?25.10 kJ/mol）的組成成分丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、迷迭香酸、紫草酸與小鼠肥大細胞瘤P815細胞孵育1 h，檢測組胺（histamine，His）和β-氨基己糖苷酶（β-hexosaminidase，β-Hex）釋放率，篩選出致類過敏成分，進一步觀察丹酚酸B及紫草酸刺激P815細胞胞內Ca2+動員及細胞脫顆粒情況，最后進行小鼠后爪外滲實驗驗證。P815細胞分別給予香丹注射液（1∶25、1∶250）及丹酚酸B（100 μg/mL）和紫草酸（100 μg/mL）刺激后，His、β-Hex釋放均顯著升高（＜0.01）。P815細胞分別給予丹酚酸B（100 μg/mL）和紫草酸（100 μg/mL）刺激后，胞內Ca2+濃度均顯著升高（＜0.05），并有脫顆?，F(xiàn)象。丹酚酸B（43.5、21.7 μg/kg）和紫草酸（43.5 μg/kg）均能顯著提高小鼠后爪伊文思藍滲出程度（＜0.05、0.01）。香丹注射液誘導的類過敏反應可能與丹酚酸B和紫草酸有關，且丹酚酸B和紫草酸誘導的類過敏反應可能與動員Ca2+內流相關。

香丹注射液；類過敏反應；分子對接；丹酚酸B；紫草酸；P815細胞

中藥注射劑（traditional Chinese medicine injections，TCMIs）是由中醫(yī)藥理論指導，采用現(xiàn)代科學技術與方法，從中草藥、天然藥物中提取有效成分制成可供注入體內（包括肌內、穴位、皮內、皮下、靜脈以及其他組織或器官）的無菌溶液以及供臨床前配制溶液的無菌粉末或濃縮液[1]。近年來，中藥制劑種類越來越多，且在病毒感染性疾病、心腦血管疾病等疾病中療效顯著，隨其應用范圍逐漸擴大，其用藥安全性也備受重視。中藥是在藥物過敏反應中常見的觸發(fā)因素，TCMIs復方復雜多樣，幾乎所有（95.7%）與中藥有關的過敏性病例均來自TCMIs[2]。在2014—2019年湖北省基于自發(fā)報告系統(tǒng)的TCMIs安全性研究中發(fā)現(xiàn)類過敏反應（14.39%）是最常見的不良反應[3]，對TCMIs中的潛在致類過敏反應物質進行篩選，對提高臨床應用的安全性至關重要。

香丹注射液屬于活血化瘀類藥物，在臨床中廣泛應用于心腦血管疾病的治療，脂溶性的二萜醌類及水溶性的酚酸類物質是該制劑的主要活性物質[4]，丹參和降香是香丹注射液的主要組成，Cao等[5]和陳影等[6]測定出香丹注射液中水溶性酚酸類成分包括丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、紫草酸和迷迭香酸等生物活性成分。香丹注射液療效顯著確切，隨著臨床對其應用的認知加深，其不良反應也受到廣泛重視。藥品不良反應信息通報（第45期）指出要警惕香丹注射液的嚴重不良反應[7]，理血劑中活血化瘀藥（24.5%）在2021年藥品不良反應/事件報告涉及的中藥中排第1位[8]，在2013年TCMIs嚴重不良反應/事件報告中香丹注射液排第5位[9]。香丹注射液的不良反應累及皮膚、呼吸等多個組織器官，主要體現(xiàn)在超敏反應上，且集中于給藥后30 min內，臨床表現(xiàn)復雜多樣，嚴重時出現(xiàn)休克死亡[10]?；加行难芗膊?、有過敏史及過敏體質患者更易發(fā)生不良反應，當香丹注射液與其他藥物聯(lián)用時，會加重不良反應，增加嚴重不良反應的發(fā)生率[11-12]。對香丹注射液進行致類過敏物質篩選，有利于提高制劑的安全性。本研究利用已建立的成熟致敏物質篩選平臺[13-14]，尋找香丹注射液引起類過敏反應發(fā)生的原因，為提高其臨床應用的安全性并為制劑進行質量控制以及工藝優(yōu)化提供參考。

1 材料

1.1 細胞

小鼠肥大細胞瘤P815細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 動物

SPF級雄性ICR小鼠，4～5周齡，體質量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號SCXK（京）2016-0006。動物于中國醫(yī)學科學院藥物研究所實驗動物中心適應性飼養(yǎng)7 d，溫度20～23 ℃，相對濕度40%～70%，12 h晝夜交替循環(huán)，動物自由進食飲水。動物實驗經(jīng)中國醫(yī)學科學院動物福利與倫理委員會批準（批準號0000262）。

1.3 藥品與試劑

香丹注射液（批號110401）購自河南同源制藥有限公司；對照品丹酚酸A（批號DST201109-008）、丹酚酸B（批號DSTDD000901）、丹酚酸C（批號DST200302-010）、迷迭香酸（批號DSTDM002701）、紫草酸（批號DST201209-028）購自成都德斯特生物技術有限公司，質量分數(shù)均≥98%；C48/80（批號088M4120V）、對硝基苯基--乙?；?β--葡糖酰胺（批號1002575112）購自美國Sigma公司；Triton X-100（批號EZ1609D315）購自BioFroxx公司；CCK-8（批號PN558）購自日本株式會社會同仁化學研究所；RPMI 1640培養(yǎng)基（批號AF29546226）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，批號DD19099560）購自Hyclone公司；胰酶（批號2114092）、鹽酸（批號20140703）購自北京利維寧生物科技有限公司；PBS（批號2126176）購自BI公司；改良臺式液（批號20211019）、0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（批號20200728）購自北京索萊寶科技有限公司；Na2CO3（批號20160616）、NaHCO3（批號20170216）均購自北京化工廠；NaOH（批號20200701）購自天津市大茂化學試劑廠；鄰苯二甲醛（批號K2024111）購自上海阿拉丁生化科技有限公司；甲醇（批號100296）購自Honeywell公司；Fluo-8 AM新型鈣離子熒光探針檢測試劑盒（批號2021A0JC0012）購自北京普利萊基因技術有限公司。

1.4 儀器

LB942S型多功能微孔板檢測系統(tǒng)（Berthold公司）；SW-CJ-2D型細胞操作超凈臺（蘇州凈化設備有限公司）；3111型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；DHP-9052型電熱37 ℃恒溫培養(yǎng)箱[中儀國科（北京）科技有限公司]；XMTD-6000型三用電熱恒溫水箱（北京長風儀器儀表公司）；3K18型小型臺式冷凍離心機（美國Sigma公司）；ASV-3023型滅菌蒸氣高壓鍋（Sakura公司）；Scepter型手持細胞計數(shù)儀、ScepterTMSensors-60 μm細胞計數(shù)芯片（美國Millipore公司）；Axio Vert A I型半自動倒置研究級顯微鏡（CARL ZEISS公司）。

2 方法

2.1 分子對接

在Uniport數(shù)據(jù)庫中（https://www.uniprot.org/）下載蛋白質PDB結構。利用ChemDraw 20.0和Chem3D 20.0軟件繪制化合物結構并將結構扭轉得到化合物mol2結構。利用Auto Dock軟件對分子進行去水、加氫后進行分子對接，通過Auto Dock Tools Vina進行分子對接評價靶蛋白和化合物之間的相互作用，并利用Ligplot進行可視化處理。

2.2 細胞毒性實驗

P815細胞用含1%青霉素-鏈霉素、10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的細胞，以4×104個/孔接種到96孔板中，于培養(yǎng)箱中孵育過夜，另設調零組不接種細胞。香丹注射液臨床使用需將原液稀釋25倍，以該質量濃度為最高質量濃度，將最高質量濃度以10倍梯度稀釋，共稀釋8個質量濃度；各給藥組分別加入200 μL 8個稀釋倍數(shù)的香丹注射液以及100、50、12.5、3.125、0.781 25 μg/mL的丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、迷迭香酸、紫草酸，對照組加入200 μL含1%青霉素-鏈霉素、10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，孵育1 h。孵育結束后，棄去藥物，每孔加入110 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h，采用酶標儀測定490 nm處的吸光度（）值，并計算抑制率。

抑制率＝1－(給藥－調零)/(對照－調零)

2.3 組胺（histamine，His）釋放試驗

取處于對數(shù)生長期的細胞，以4×104個/孔接種到黑色不透光96孔板中，孵育過夜，另設調零組不接種細胞。設置對照組、C48/80組和各給藥組，調零組和對照組每孔加入200 μL改良臺式液，C48/80組加入200 μL C48/80（30 μg/mL），各給藥組分別加入200 μL高、低劑量（1∶25、1∶250）的香丹注射液稀釋液及高、低劑量（50、5 μg/mL）的丹酚酸A和高、低劑量（100、10 μg/mL）的丹酚酸B、丹酚酸C、迷迭香酸、紫草酸，孵育1 h。裂解組加入200 μL 1% Triton X-100，每孔取100 μL放入黑色不透光96孔板中，每孔加入20 μL 1 mol/L NaOH，再加入20 μL 1%鄰苯二甲醛底物，37 ℃孵育15 min，加入20 μL 1 mol/L鹽酸終止反應，立即采用酶標儀m/x＝350/460測定各組值，并計算His釋放率。

His釋放率＝(樣品上清－調零)/(裂解－調零)

2.4 β-氨基己糖苷酶（β-hexosaminidase，β-Hex）釋放試驗

按“2.3”項下方法進行分組和給藥，孵育1 h，裂解組加入200 μL 1% Triton X-100，取上清液50 μL加到1個新的96孔板，每孔加入50 μL對硝基苯基--乙?；?β--葡糖酰胺顯色底物制劑（1.70 mg/mL），37 ℃孵育1.5 h，每孔加入150 μL Na2CO3/NaHCO3終止液，采用酶標儀測定405 nm處的各組值，并計算β-Hex釋放率。

β-Hex釋放率＝(樣品上清－調零)/(裂解－調零)

2.5 小鼠后爪外滲實驗驗證

丹酚酸B及紫草酸高質量濃度下均可顯著刺激P815細胞釋放His和β-Hex，因此進行小鼠局部類過敏反應進行驗證。雄性ICR小鼠56只隨機分為C48/80（13.0 μg/kg）組及丹酚酸B高、中、低劑量（43.5、21.7、10.9 μg/kg）組和紫草酸高、中、低劑量（43.5、21.7、10.9 μg/kg）組，每組8只。小鼠iv 0.4%伊文思藍鹽水（10 mL/kg），5 min后將10 μL生理鹽水注射到左爪中作為對照，將10 μL含各質量濃度待測藥物的生理鹽水注射到右爪中。15 min后，收集爪組織，37 ℃干燥24 h后稱定質量，剪碎，置于800 μL丙酮-生理鹽水（7∶3）溶液中。65 ℃孵育12 h，5000 r/min離心取上清液，取200 μL移至96孔板中，于620 nm處測定值。

2.6 甲苯胺藍染色觀察細胞形態(tài)變化

將細胞爬片放入6孔板中，P815細胞以1.8×106個/孔接種到爬片上，孵育過夜。對照組每孔加入600 μL改良臺式液，C48/80組加入30 μg/mL C48/80，丹酚酸B高、中、低劑量（100、50、10 μg/mL）組和紫草酸高、中、低劑量（100、50、10 μg/mL）組每孔加入200 μL待測藥物，孵育1 h。取出爬片，于4%多聚甲醛溶液中固定，滴加甲苯胺藍進行染色，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.7 細胞內Ca2+動員實驗

取處于對數(shù)生長期的細胞，以4×104個/孔接種到黑色不透光96孔板中，孵育過夜，另設調零組不接種細胞。設置對照組、C48/80組和各給藥組，調零組和對照組每孔加入200 μL鈣離子熒光探針試劑盒內稀釋緩沖液，C48/80組加入200 μL C48/80（30 μg/mL），各給藥組分別加入200 μL高、中、低劑量（100、25、6.25 μg/mL）的丹酚酸B、紫草酸，孵育1 h。棄去上清液，每孔加入100 μL Fluo-8 AM工作液，37 ℃孵育40 min，用稀釋緩沖液洗滌細胞2次，每孔加入200 μL稀釋緩沖液，立即采用酶標儀m/x＝490/514測定各組值。

2.8 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 分子對接

配體與受體結合能量越低，配體與受體結合構象越穩(wěn)定，結合活性越強。當結合能＜?29.29 kJ/mol可推測其有強烈的結合活性[15-16]。迷迭香酸與人類Mas相關G蛋白偶聯(lián)受體X2（Mas-related G protein-coupled receptor X2，MRGPRX2）結合能接近該標準，且與小鼠MRGPRb2結合能＜?29.29 kJ/mol，本研究以?25.10 kJ/mol為后續(xù)實驗篩選標準[17]。如表1所示，丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、紫草酸和迷迭香酸與MRGPRX2和MRGPRb2結合位點的結合能均≤?25.10 kJ/mol。丹酚酸B、紫草酸與MRGPRX2/MRGPRb2分子對接見圖1、2。

3.2 細胞毒性實驗

如圖3所示，丹酚酸A在100 μg/mL對P815 細胞生長抑制率為42.99%，其余藥物及組分對P815細胞無明顯毒性作用。為確保篩選實驗的準確性，減少細胞毒性作用對后續(xù)實驗的影響，藥物對P815細胞的生長抑制率≤20%，故以香丹注射液原液稀釋25倍為最高質量濃度（1∶25），丹酚酸A以50 μg/mL為最高質量濃度，丹酚酸B、丹酚酸C、紫草酸、迷迭香酸以100 μg/mL為最高質量濃度。

表1 核心成分與MRGPRX2/MRGPRb2的分子對接

Table 1 Molecular docking of core components with MRGPRX2/MRGPRb2

蛋白化合物結合能/(kJ·mol?1) MRGPRX2丹酚酸B?35.98 紫草酸?35.12 丹酚酸C?32.64 丹酚酸A?29.71 迷迭香酸?28.03 原兒茶醛?23.85 丹參素?22.59 咖啡酸?20.92 原兒茶酸?20.08 MRGPRb2丹酚酸C?35.15 紫草酸?32.64 丹酚酸B?31.80 丹酚酸A?30.54 迷迭香酸?30.12 丹參素?24.27 咖啡酸?23.01 原兒茶酸?20.50 原兒茶醛?20.08

圖1 丹酚酸B與MRGPRX2/MRGPRb2分子對接可視化

圖2 紫草酸與MRGPRX2/MRGPRb2分子對接可視化

圖3 香丹注射液及其各組分對P815細胞毒性測定

3.3 His及β-Hex釋放實驗

如圖4所示，香丹注射液高、低劑量組及丹酚酸B高劑量組和紫草酸高劑量組均能顯著刺激P815細胞釋放His（＜0.01），且呈劑量相關性；而丹酚酸A高、低劑量組能夠顯著抑制P815細胞釋放His（＜0.01）。

如圖5所示，香丹注射液、丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸的高、低劑量組和丹酚酸C高劑量組均能顯著刺激P815細胞釋放β-Hex（＜0.05、0.01），且呈劑量相關性；丹酚酸A高劑量組顯著刺激P815細胞釋放β-Hex（＜0.01），而丹酚酸A低劑量組抑制P815細胞釋放β-Hex（＜0.01）。根據(jù)His釋放率及β-Hex釋放率增加倍數(shù)對其致敏可疑程度進行排序（表2），丹酚酸B及紫草酸可能是香丹注射液中潛在的致類過敏組分。

與對照組比較：**P＜0.01

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

3.4 小鼠后爪外滲試驗驗證及細胞形態(tài)變化

如圖6所示，觀察小鼠后右爪注射C48/80以誘導局部類過敏反應，伊文思藍滲出增加，右爪相較僅注射生理鹽水的左爪藍色更深，丹酚酸B高、中劑量組和紫草酸高劑量組均能顯著提高小鼠后爪伊文思藍滲出程度（＜0.05、0.01）。

如圖7所示，對照組細胞完整，邊緣光滑，結構致密；C48/80組細胞邊緣不整，背景中出現(xiàn)大量的藍色顆粒樣物質；丹酚酸B組和紫草酸組誘導P815細胞脫顆粒呈劑量相關性減弱，表明丹酚酸B和紫草酸可能是致類過敏物質。

表2 致類過敏可疑程度

Table 2 Suspicious degree of induction of anaphylactic reaction

組別劑量刺激His釋放刺激β-Hex釋放 香丹注射液1∶25＋＋＋ 1∶250＋－ 丹酚酸A50 μg·mL?1－－ 5 μg·mL?1－－ 丹酚酸B100 μg·mL?1＋＋＋ 10 μg·mL?1－＋ 丹酚酸C100 μg·mL?1－＋ 10 μg·mL?1－－ 紫草酸100 μg·mL?1＋＋＋ 10 μg·mL?1－－ 迷迭香酸100 μg·mL?1－－ 10 μg·mL?1－－

－：與對照組比較，His釋放率增長倍數(shù)（）≤2，β-Hex釋放率增長倍數(shù)（）≤5；＋：2＜≤5，5＜≤20；＋＋：＞5，＞20

－: His release rate increased multiple ()≤ 2control group,β-Hex release rate increased multiple () ≤ 5control group; ＋: 2<≤ 5, 5<≤ 20;＋＋:>5,>20

3.5 細胞內Ca2+動員試驗結果

如圖8所示，丹酚酸B高劑量組和紫草酸高劑量組刺激P815細胞后胞內Ca2+濃度顯著升高（＜0.05），表明丹酚酸B和紫草酸誘導的類過敏反應可能與動員Ca2＋內流相關。

4 討論

類過敏反應與I型超敏反應臨床表癥相似，但不會引起抗原特異性免疫反應。類過敏反應可以通過直接刺激或激活補體系統(tǒng)間接刺激肥大細胞和嗜堿性粒細胞釋放活性介質而被誘導，還可通過激活Ca2+相關信號通路釋放活性介質而被誘導[18-19]。MRGPRX2/MRGPRb2是一種在肥大細胞上表達的A類G蛋白偶聯(lián)受體，可以活化非IgE介導的肥大細胞，研究已證明羅庫溴銨等幾種FDA批準的陽離子藥物的類過敏反應與其相關，MRGPRX2/ MRGPRb2是類過敏反應的關鍵靶標，并可在體外通過MRGPRX2對體內假過敏反應的發(fā)生進行預測[20-23]。將酚酸類物質與MRGPRX2/MRGPRb2進行分子對接評估，發(fā)現(xiàn)丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、紫草酸和迷迭香酸與MRGPRX2/MRGPRb2結合位點的結合力較高，其中丹酚酸B、紫草酸和丹酚酸C的結合排于前3，故選擇丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、紫草酸和迷迭香酸這5個單體進行類過敏反應物質篩選。

本研究使用P815細胞，因其表面沒有高親和性的IgE Fc段受體，更適合作為類過敏反應肥大細胞脫顆粒檢測模型[24]。C48/80是常用的誘導細胞脫顆粒的藥物，能夠通過MRGPRX2誘導肥大細胞活化。MRGPRX2可以通過激活磷脂酶C信號通路誘導Ca2+動員，激活G蛋白，促使肥大細胞胞吐，合成磷脂酰肌醇3-激酶，并形成花生四烯酸代謝物，激活Ca2+通道和蛋白激酶C，胞內Ca2+水平升高，發(fā)生脫顆?，F(xiàn)象并釋放介質，此外補體系統(tǒng)激活產(chǎn)生C3a和C5a，C3a和C5a在動員Ca2+方面具有高活性[25]。本研究結果顯示，香丹注射液在一定劑量下可以誘導P815細胞釋放His、β-Hex介質，且在香丹注射液中篩選出其單體成分丹酚酸B及紫草酸可以誘導P815細胞脫顆粒，并釋放His、β-Hex介質。本研究中丹酚酸A低劑量組可顯著抑制P815細胞釋放His和β-Hex，Jeon等[26]發(fā)現(xiàn)丹酚酸A可以降低二硝基氯苯誘導的BALB/c小鼠血清中IgE水平，可能具有抗過敏作用，本研究結果與文獻報道較一致。在小鼠后爪外滲驗證實驗中，當小鼠發(fā)生類過敏反應時，其皮膚血管壁通透性升高，伊文思藍可與血漿蛋白結合，滲出血管外，表現(xiàn)出組織藍染，丹酚酸B高、中劑量組和紫草酸高劑量組均可導致小鼠后爪血管通透性增加，類過敏反應發(fā)生，這一結果與分子對接結果相互對應。Ca2+內流對His釋放和肥大細胞脫顆粒有顯著影響[27]，丹酚酸B和紫草酸高劑量組刺激P815細胞后，胞內Ca2+濃度顯著升高，香丹注射液誘導的類過敏反應可能與丹酚酸B和紫草酸有關。

圖B為圖A紅色框內各組局部放大圖，與左足比較：*P＜0.05 **P＜0.01

圖7 丹酚酸B及紫草酸刺激P815細胞脫顆粒變化

與對照組比較：*P＜0.05

紫草酸是一種具有神經(jīng)保護、肝保護、心臟保護等多種生物活性的天然產(chǎn)物[28]。丹酚酸B是丹參中丹酚酸類里含量最豐富、最具生物活性的成分之一，富含丹酚酸B的相關藥物廣泛用于各種心血管疾病的臨床治療，丹酚酸B還可通過抑制過敏誘導的氣道黏蛋白MUC5AC過表達來改善氣道高反應性[29-30]。在丹參水提液中，丹參酚酸類成分不穩(wěn)定，易發(fā)生降解和相互轉化。丹酚酸B是水溶性酚酸中含量最高的成分，在不同溫度（80～210 ℃）下，其呋喃環(huán)相連酯鍵發(fā)生水解反應，生成紫草酸和丹參素，且隨溫度升高水解反應程度增加[31]。在高溫高壓處理丹酚酸B水溶液時，紫草酸含量會先升高再降低，可能與丹酚酸B和紫草酸之間存在可逆反應有關，且紫草酸也會發(fā)生降解反應，形成丹參素、丹酚酸A、原兒茶醛[31-32]。目前尚無有關丹酚酸B和紫草酸單體致超敏反應的報道，其具體機制仍需進一步研究，同時本研究發(fā)現(xiàn)丹酚酸A具有一定的抗類過敏作用，當?shù)し铀酈、紫草酸與丹酚酸A同時存在的致敏作用或者抗過敏作用也值得進一步深入探索。

隨著香丹注射液廣泛應用，其不良反應備受臨床重視。香丹注射液致敏反應受多種因素影響[33-34]：①鞣質是結構復雜的多元酚類化合物，含有大量的酚羥基或羧基，因其結構與香丹注射液中活性成分相似，不易完全分離，生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的鞣質可作為半抗原在體內與大分子蛋白結合形成復合物引起過敏反應，或者通過共激活激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)、凝血、補體途徑誘導類過敏反應；②輔料聚山梨酯80可誘導類過敏反應；③選擇生理鹽水作為溶媒可能會產(chǎn)生不溶性顆粒；④聯(lián)合用藥可誘導超敏反應發(fā)生率增加；⑤其活性成分可能作為半抗原誘導過敏反應或直接誘導類過敏反應。在衛(wèi)生部頒藥品標準中藥成方制劑（WS3-B-3289-98）中僅要求對香丹注射液中原兒茶醛含量進行定量分析[35]。丹酚酸B和紫草酸誘導的P815細胞脫顆粒釋放介質具有劑量相關性，為提高香丹注射液臨床使用的安全性，在確保制劑有效性的前提下有必要對其潛在的致敏物質進行限量標準研究，重視各酚酸類的相互轉化，改善制劑工藝，以進一步提高香丹注射液的安全性。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Screening and preliminary mechanism of inducer of anaphylactic reaction in Xiangdan Injection

PANG Fei1, WANG Wan-wan2, HAO Rui-rui1, ZHOU Tian-yu3, CHEN Shi-zhong2, JING Hong-tao1, 4, 5

1. New Drug Safety Evaluation Center, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China 2. School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Beijing 100191, China 3. Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China 4. NMPA Key Laboratory for Safety Research and Evaluation of Innovative Drug, Beijing 102206, China 5. Beijing Union-Genius Pharmaceutical Technology Development Co., Ltd., Beijing 100176, China

To screen the components induced the anaphylactic reaction in Xiangdan Injection (香丹注射液) and explore the mechanism.With human Mas-related G protein-coupled receptor X2 (MRGPRX2) and mouse MRGPRb2 as target proteins, water-soluble phenolic acids in Xiangdan Injection were docked with target protein by Auto Dock Tools Vina. P815 cells were incubated with Xiangdan Injection and its constituents of salvianolic acid A, salvianolic acid B, salvianolic acid C, rosmarinic acid and lithospermic acid for 1 h, which had high binding energy (≤ ?25.10 kJ/mol) to MRGPRX2 and MRGPRb2. According to histamine (His) and β-hexosaminidase (β-Hex) release rate, possible components that may induce the anaphylactic reaction were screened out. The intracellular Ca2+mobilization and cell degranulation stimulated by salvianolic acid B and lithospermic acid were further observed. Finally, the mouse hind paw extravasation experiment was observed for verification.After P815 cells were stimulated with Xiangdan Injection (1∶25, 1∶250), salvianolic acid B (100 μg/mL) and lithospermic acid (100 μg/mL), the release of His and β-Hex were significantly increased (< 0.01). After P815 cells were stimulated with salvianolic acid B (100 μg/mL) and lithospermic acid (100 μg/mL), the intracellular Ca2+concentration was significantly increased (< 0.05), and degranulation was observed. Salvianolic acid B (43.5, 21.7 μg/kg) and lithospermic acid (43.5 μg/kg) could significantly increase the degree of Evans blue exudation in hind paw of mice (< 0.05, 0.01).The anaphylactoid reaction induced by Xiangdan Injection may be related to salvianolic acid B and lithospermic acid, and the anaphylactoid reaction induced by salvianolic acid B and shikonic acid may be related to the mobilization of Ca2+influx.

Xiangdan Injection; anaphylactic reaction; molecular docking; salvianolic acid B; lithospermic acid; P815 cells

R285.5

A

0253 - 2670(2022)20 - 6500 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.20.022

2022-06-30

國家自然科學基金資助項目（81773996）；中國毒理學會臨床毒理專項資助課題（CST2021CT101）

龐 菲，碩士研究生，研究方向為藥物免疫毒理學。E-mail: pangfei@imm.ac.cn

靳洪濤，博士生導師，從事藥物毒理學研究。E-mail: jinhongtao@imm.ac.cn

陳世忠，博士生導師，主要從事天然藥物化學研究。E-mail: chenshizhong66@163.com

[責任編輯 李亞楠]