張鈺聆，張立春

1四川大學(xué)分析測(cè)試中心，成都 610064

2四川大學(xué)化學(xué)學(xué)院，成都 610064

自古以來(lái)人類對(duì)于美食的探索就充滿激情。

從人類能駕馭危險(xiǎn)的火焰以來(lái)，就誕出了各種各樣的美食，因此認(rèn)為美食的探索也是可以促進(jìn)人類的技術(shù)進(jìn)步。從“第一個(gè)吃螃蟹的人”就能看出，人類對(duì)于吃的欲望能極大地促進(jìn)社會(huì)的發(fā)展、技術(shù)的進(jìn)步。不管危險(xiǎn)與否，只要能食用，就會(huì)有人不顧危險(xiǎn)。

人類在克服“吃”上面的危險(xiǎn)時(shí)，無(wú)意間就解決了很多的問題。我們將通過對(duì)于河豚毒素的介紹，揭開人類對(duì)于“吃”的應(yīng)用。

1 河豚文化

縱觀我國(guó)的飲食文化史，河豚早就登臺(tái)亮相，因其豐腴鮮美的口感受到無(wú)數(shù)人追捧，文人雅士在對(duì)河豚的描述中留下了精彩絕倫的詩(shī)詞歌賦，美食和詩(shī)歌的相互交融，沉淀出獨(dú)具特色的河豚文化。

“春洲生荻芽，春岸飛楊花。河豚當(dāng)是時(shí)，貴不數(shù)魚蝦”，描述河豚最著名的詩(shī)詞當(dāng)屬宋代詩(shī)人梅堯臣的《范饒州坐中客語(yǔ)食河豚魚》，既體現(xiàn)了河豚在當(dāng)時(shí)作為春季珍饈的珍貴，也反映了宋朝崇尚食用河豚風(fēng)氣的盛行；大文豪蘇軾也對(duì)河豚肉格外鐘情。“先生洗盞酌桂醑，冰盤薦此赪虬珠。似聞江鰩斫玉柱，更洗河豚烹腹腴”，蘇軾在《四月十一日初食荔枝》中將河豚腹與當(dāng)時(shí)物資稀缺時(shí)的荔枝相媲美，可見對(duì)河豚的狂熱喜愛。雖早在4000多年前的《山海經(jīng)·北海經(jīng)》中就記載了大禹時(shí)代出現(xiàn)過食用河豚后中毒的現(xiàn)象，南宋詞人舒岳祥也提及“美味河豚虐”，這些仍難以撼動(dòng)河豚在我國(guó)美食史上舉足輕重的地位。

口感的鮮美、時(shí)令的珍貴、毒素的危險(xiǎn)，反而如美人“猶抱琵琶半遮面”，引得無(wú)數(shù)人無(wú)限遐想，對(duì)河豚情有獨(dú)鐘。日本也擁有歷史悠久的“食魚文化”，他們對(duì)河豚的喜愛可以說(shuō)達(dá)到了癡迷的程度。文學(xué)家魯迅先生當(dāng)年在日本留學(xué)時(shí)，就品嘗過其中的美味，“故鄉(xiāng)黯黯鎖玄云，遙夜迢迢隔上春。歲暮何堪再惆悵，且持卮酒食河豚”。在當(dāng)時(shí)政局黑暗，故鄉(xiāng)難歸的時(shí)刻，借著河豚和酒進(jìn)行自我勸慰，排解思鄉(xiāng)之苦。

2 河豚毒素的結(jié)構(gòu)解析

一方面河豚鮮美的滋味讓人無(wú)法自拔，一方面食用河豚面臨的危險(xiǎn)又讓人提心吊膽，食用河豚中毒的罪魁禍?zhǔn)渍莵?lái)源于它的毒素——河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)。

在科技日新月異的今天，化合物未知結(jié)構(gòu)的解析可以借助一系列精密準(zhǔn)確的光譜分析技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，而在光譜數(shù)據(jù)欠缺的背景下，諸多研究者憑借對(duì)有機(jī)化學(xué)的精妙理解，在河豚毒素的結(jié)構(gòu)解析上展現(xiàn)了令人驚嘆的推理藝術(shù)。

河豚毒素的發(fā)現(xiàn)充滿曲折，這與它獨(dú)特的性質(zhì)密不可分。河豚毒素易溶于水，而在有機(jī)溶劑中溶解性較差，通常情況下應(yīng)用于生物堿的分離和提純技術(shù)在獲得TTX上完全失效。直到1950年日本化學(xué)家Yukoo才首次從河豚魚的肝臟和卵巢中分離得到純結(jié)晶態(tài)的TTX，后續(xù)拉開了TTX結(jié)構(gòu)解析的序幕[1]。河豚毒素為氨基全氫喹唑啉型化合物，分子式為C11H17N3O8，呈弱堿性，為無(wú)色晶體，熱穩(wěn)定性良好，當(dāng)時(shí)河豚毒素結(jié)構(gòu)的光譜數(shù)據(jù)還很模糊，為了確定河豚毒素的結(jié)構(gòu)式，Woodward[2]，Tsuda[3]和Goto[4,5]等課題組付出了巨大的努力。

最初對(duì)TTX結(jié)構(gòu)的解析是從分析其降解產(chǎn)物入手(圖1)[6]。為了分析其中N的存在形式，通過氧化降解得到胍2，從而排除結(jié)構(gòu)中存在N-O鍵的可能，確定了完整的胍基結(jié)構(gòu)單元。Woodward[2]通過乙?；磻?yīng)得到了4，并將其轉(zhuǎn)化為銅螯合物5以證實(shí)結(jié)構(gòu)。而通過強(qiáng)還原后分離得到了甲基喹唑啉6和8[2,3]，這表明喹唑啉可能是降解產(chǎn)物。后續(xù)發(fā)現(xiàn)在堿性和酸性介質(zhì)中獲得的產(chǎn)物3[3]和產(chǎn)物7[4]存在著羥基位置的差異，產(chǎn)物3后續(xù)通過其衍生物全合成[3]和氘代介質(zhì)中的堿性降解[2]得以證明，雖然無(wú)法解釋羥基位置存在的差異，但這些結(jié)果使得研究者們做出了大膽的推測(cè)：氫喹唑啉是TTX的結(jié)構(gòu)核心。

圖1 TTX降解示意圖[6]

在對(duì)TTX核心結(jié)構(gòu)的研究中，Goto[5]將注意力轉(zhuǎn)向了衍生物，圖2展示了TTX的衍生化研究，通過溫和水處理得到衍生物9，在9與HIO4反應(yīng)過程中，獲得了產(chǎn)物10和副產(chǎn)物甲醛，這表明TTX中存在β-OH。而通過10獲得了黃色針狀喹唑啉衍生物12，產(chǎn)物7出現(xiàn)的原因也得以說(shuō)明，即TTX的降解可能都是通過中間物10進(jìn)行的。這些清楚地表明氫喹唑啉是河豚毒素結(jié)構(gòu)核心。

圖2 Goto對(duì)TTX衍生化研究[5,6]

在獲得單晶[5,7]后，結(jié)合光譜表征數(shù)據(jù)，對(duì)河豚毒素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行推導(dǎo)。根據(jù)產(chǎn)物9判斷TTX為內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，但由于其紅外光譜中不存在內(nèi)酯特征帶(1690-2000 cm-1)，且TTX的弱堿性(pKa8.3)也與胍基存在并不相符，從而排除了TTX的內(nèi)酯結(jié)構(gòu)。Woodward[2]發(fā)現(xiàn)TTX (1658，1603 cm-1)處的紅外吸收與代表質(zhì)子化胍基(1656，1603 cm-1)的吸收相吻合，這為結(jié)構(gòu)的推斷提供了關(guān)鍵性的證據(jù)：TTX結(jié)構(gòu)中含有質(zhì)子化胍基，這決定了TTX必須是兩性的，唯一的可能是將其中一個(gè)羥基添加到內(nèi)酯官能團(tuán)中以創(chuàng)建新的半內(nèi)酯系統(tǒng)，對(duì)TTX的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)C-5羥基正好位于與內(nèi)酯部分相互作用的空間中，整個(gè)骨架的剛性是與半縮醛形式建立起平衡的重要因素。TTX在羥基內(nèi)酯和半內(nèi)酯結(jié)構(gòu)間平衡轉(zhuǎn)化(圖3)[6]。

圖3 TTX羥基內(nèi)酯/半內(nèi)酯結(jié)構(gòu)平衡轉(zhuǎn)化[6]

生物檢測(cè)法最早被應(yīng)用于河豚毒素及其類似物的研究，如小鼠生物實(shí)驗(yàn)(mouse bioassay,MBA)[8]、組織培養(yǎng)生物測(cè)定[9]、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)[10]等，但生物測(cè)定法只能用于評(píng)估毒性，無(wú)法對(duì)單一毒素作用做出判斷。20世紀(jì)70年代以后隨著儀器分析發(fā)展，TTX的分析檢測(cè)也得到了迅速的發(fā)展。色譜分離與不同檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用成為分析河豚毒素的有力手段。質(zhì)譜作為高靈敏度的檢測(cè)器，在河豚毒素檢測(cè)上得到良好應(yīng)用，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometer, GC-MS)成功用于河豚毒素的分析，但由于TTX的非揮發(fā)性，需要進(jìn)行衍生化處理[11]；采用液相色譜避免了衍生化處理過程，在電噴霧電離(electrospray-ionisation，ESI)正離子模式下，河豚毒素及其類似物都可以得到質(zhì)荷比(m/z)為320的離子，通過液相色譜-電噴霧質(zhì)譜法 (liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry, LC-ESI-MS)可以得到良好的檢測(cè)效果[12]。

3 河豚毒素的作用機(jī)制

TTX作為一種毒性極強(qiáng)的非蛋白質(zhì)神經(jīng)毒素，人體攝入后被腸道快速吸收，進(jìn)入血液后經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)全身，引起嘔吐腹瀉、血壓下降、腦神經(jīng)功能障礙、四肢神經(jīng)麻痹，喪失運(yùn)動(dòng)能力，更嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)呼吸衰竭和心血管衰竭[13]。當(dāng)TTX的化學(xué)結(jié)構(gòu)被確定后，藥理學(xué)以及毒理學(xué)專家對(duì)TTX表現(xiàn)出的獨(dú)特生物活性產(chǎn)生濃厚興趣，并逐漸揭開了TTX的中毒機(jī)制。

河豚毒素的生物學(xué)效應(yīng)是由其與電壓門控鈉通道(voltage-gated sodium channel，VGSC)的相互作用介導(dǎo)的。VGSC是跨膜蛋白[14]，主要在肌肉和神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，結(jié)構(gòu)上由一個(gè)功能α-亞基和一個(gè)或多個(gè)參與電壓傳感的β-亞基組成，根據(jù)α-亞基的差異可以分為Nav1.1-Nav1.9和NavX等亞型，其中Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.6和Nav1.7對(duì)TTX敏感，其余對(duì)TTX抗性。VGSC在可興奮細(xì)胞(例如神經(jīng)元或肌細(xì)胞)表面表達(dá)，通過選擇性允許鈉離子的流入，在神經(jīng)元信號(hào)的啟動(dòng)和傳播中起作用(圖4)。

圖4 TTX在神經(jīng)元細(xì)胞電壓門控Na+通道中的作用機(jī)制[13]

通道的α-亞基決定了其與TTX作用的方式，當(dāng)激活時(shí)，通道選擇性地打開，鈉離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)環(huán)境?？缒る娢坏木植孔兓瘜?dǎo)致相鄰VGSC的打開，使得信號(hào)沿神經(jīng)元傳播，這構(gòu)成了神經(jīng)元和肌肉細(xì)胞中動(dòng)作電位啟動(dòng)和傳播的基礎(chǔ)。當(dāng)TTX與VGCS中相關(guān)位點(diǎn)結(jié)合時(shí)，阻止了鈉離子的流入，神經(jīng)元和相關(guān)肌肉將會(huì)無(wú)法運(yùn)作，因此河豚毒素主要是阻遏神經(jīng)和肌肉的傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致癱瘓。

4 河豚毒素在醫(yī)療上的應(yīng)用

VGCS存在于整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉中，在執(zhí)行許多基本生理功能中起到重要的作用，這使得TTX作為一種特異性鈉離子通道阻滯劑有望成為萬(wàn)能的治療藥劑。當(dāng)以遠(yuǎn)低于其LD50的水平給藥時(shí)，TTX表現(xiàn)出特殊的治療特性，目前已被證明在幾種不同的疼痛模型中起到鎮(zhèn)痛作用，包括神經(jīng)性疼痛、胃腸道和內(nèi)臟疼痛、癌癥相關(guān)慢性疼痛等[15]。

鈉離子通道在從傷害感受器到中樞神經(jīng)的疼痛傳導(dǎo)中占據(jù)著重要的作用，TTX展現(xiàn)出鎮(zhèn)痛活性主要是基于其對(duì)特性鈉離子通道的高度選擇性阻斷，通過抑制動(dòng)作電位的啟動(dòng)和傳導(dǎo)來(lái)阻斷神經(jīng)傳遞，因此在治療神經(jīng)性疼痛上具有廣泛的應(yīng)用前景。

神經(jīng)性疼痛是由軀體感覺系統(tǒng)的疾病或損傷引起的，包括周圍神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。在神經(jīng)受損后，傷害感受神經(jīng)元異常的自發(fā)放電造成了感受通路中的動(dòng)作電位和放電頻率異常，從而引起自發(fā)性疼痛。在嚙齒類動(dòng)物模型的研究中，TTX治療神經(jīng)性疼痛獲得了良好的前景。在對(duì)小鼠熱痛覺損傷的研究中，發(fā)現(xiàn)相比于其他阿片類藥物使用時(shí)造成的成癮、鎮(zhèn)靜和呼吸抑制等有害副作用，沒有出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)、運(yùn)動(dòng)缺陷、呼吸窘迫等現(xiàn)象[16]，后續(xù)有望進(jìn)一步在臨床上得到驗(yàn)證。

此外，對(duì)TTX減輕癌癥相關(guān)疼痛的能力進(jìn)行了研究。隨著癌癥后期的發(fā)展，癌癥本身、化療等治療方法以及相關(guān)并發(fā)癥都會(huì)造成疼痛加劇。TTX作為鎮(zhèn)痛劑已經(jīng)在癌癥患者身上得到具有臨床意義的驗(yàn)證，雖然會(huì)有如口腔感覺消退和異常的輕微副作用[17]，但相比于阿片類易造成成癮和具有遺傳毒性的藥物更適用于長(zhǎng)期緩解疼痛。此外，TTX對(duì)抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵略體現(xiàn)出了一定的作用，在對(duì)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系的體外研究中發(fā)現(xiàn)TTX對(duì)兩種癌細(xì)胞系都有著明顯的抑制作用[18]，TTX具有的抗癌活性可用于開發(fā)潛在的抗腫瘤藥物。

除了緩解疼痛，TTX還在治療海洛因和可卡因戒斷癥狀上顯示出令人欣慰的效果。

海洛因戒斷綜合征和復(fù)發(fā)是成功治療海洛因成癮的主要問題。即使在長(zhǎng)期戒斷之后，與毒品相關(guān)的環(huán)境因素或暴露于壓力源也會(huì)促使吸毒者在康復(fù)過程中復(fù)吸。因此，需要長(zhǎng)期防止毒癮復(fù)發(fā)。目前，阿片類藥物常在受控的方式下治療戒斷癥狀，但阿片類藥物的成癮性使其不能長(zhǎng)期使用。在2009年進(jìn)行了一項(xiàng)涉及45人的雙盲、安慰劑對(duì)照研究，發(fā)現(xiàn)單次肌肉注射10 μg TTX可顯著降低暗示性海洛因成癮者的焦慮和渴望，而對(duì)血壓或心率沒有顯著影響[19]。但目前對(duì)TTX緩解戒斷癥狀的機(jī)制尚不了解，其他潛在的副作用仍待進(jìn)一步研究。

5 結(jié)語(yǔ)

河豚毒素在蠑螈、青蛙和一些海洋動(dòng)物中都有發(fā)現(xiàn)，這些生物對(duì)自身體內(nèi)的TTX具有天然的“免疫力”，其神經(jīng)細(xì)胞的鈉離子通道無(wú)法被TTX阻滯。

如嗎啡、箭毒和肉毒桿菌毒素等神經(jīng)毒素，由令人談之色變的毒物搖身一變成為了藥物市場(chǎng)甚至是化妝品市場(chǎng)的寵兒，TTX作為一種神經(jīng)毒性藥物，因其低分子量、高穩(wěn)定性、非蛋白類等優(yōu)點(diǎn)也具有巨大的潛在醫(yī)藥開發(fā)價(jià)值。當(dāng)它以低劑量水平給藥時(shí)，在緩解神經(jīng)性疼痛、癌癥相關(guān)疼痛等方面展現(xiàn)出治療特性，對(duì)于毒品戒斷、腫瘤治療和腦損傷等疾病也有著潛在的治療應(yīng)用。雖然目前對(duì)于TTX的治療機(jī)制的研究仍在起步階段，其潛在的毒副作用也有待進(jìn)一步說(shuō)明，但河豚毒素的潛在應(yīng)用顯示出令人激動(dòng)的成效，通過進(jìn)一步研究測(cè)試TTX治療動(dòng)物模型以外的疾病的能力，確定這些治療對(duì)患者的安全性和有效性，并優(yōu)化給藥效果，相信河豚毒素一定會(huì)在醫(yī)療治療中獲得顯著的成效。