王 宇，趙予晗，焦安惠，王玉琪，高青山

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉 133000；2.東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心，延吉 133000;3.吉林省延邊黃牛種質(zhì)資源保護(hù)工程研究中心，延吉 133000)

乙草胺(acetochlor)又稱(chēng)禾耐斯，化學(xué)式C14H20ClNO2，屬于酰胺類(lèi)除草劑[1]，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中可用于清除一年生禾本科和闊葉雜草，如常被用于黃豆、玉米、棉花、花生等農(nóng)作物的除草。因其毒性小而且除草效果非常好，因而被廣泛使用。但隨著乙草胺的大量使用，土壤、河流、地表水中均可檢測(cè)出乙草胺的殘留[2]。長(zhǎng)江流域、黑龍江流域、松花江流域等均檢出了乙草胺[3]，中國(guó)31個(gè)省會(huì)城市和25個(gè)二級(jí)城市水源水及出廠水中也有不同濃度的乙草胺被檢出[4]。同時(shí)大量研究表明，乙草胺具有細(xì)胞遺傳毒性、生殖發(fā)育毒性、消化系統(tǒng)毒性等。如劉陽(yáng)等[5]研究表明，經(jīng)乙草胺處理后花背蟾蜍的蝌蚪期肝臟內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)的表達(dá)量均降低，表明乙草胺對(duì)肝臟細(xì)胞具有氧化損傷作用。Song等[6]研究表明，乙草胺可能通過(guò)生殖細(xì)胞氧化應(yīng)激，促使發(fā)生ERK-p53-Bcl-2級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)小鼠精原細(xì)胞(GC-1)凋亡。Zhang等[7]研究表明,低劑量乙草胺可誘導(dǎo)斑馬魚(yú)卵巢卵黃原蛋白(Vtg)合成，促進(jìn)卵巢發(fā)育，而高劑量乙草胺則降低卵巢抵抗氧化應(yīng)激能力，破壞卵巢發(fā)育。

雖然已有研究證實(shí)乙草胺會(huì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體造成急性毒性、生殖發(fā)育毒性等，但國(guó)內(nèi)外關(guān)于乙草胺對(duì)生殖系統(tǒng)的研究?jī)H局限于雄性哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)，對(duì)雌性哺乳類(lèi)動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟相關(guān)方面尚不清楚。本試驗(yàn)通過(guò)在體外培養(yǎng)液中添加不同濃度乙草胺，以期探究其對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外成熟的影響，為判定乙草胺的毒性及對(duì)動(dòng)物和人類(lèi)健康的危害提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 雌性昆明小鼠60只，5～6周齡，體重20～24 g，健康狀況良好，購(gòu)自延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。試驗(yàn)前將小鼠置于延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心鼠房飼養(yǎng)1周，適應(yīng)環(huán)境。飼養(yǎng)在20～23 ℃環(huán)境中，光照條件為12 h光照、12 h黑暗，自由飲食。

1.1.2 主要試劑及儀器 透明質(zhì)酸酶(Hy)、牛血清白蛋白(BSA)、礦物油、卵母細(xì)胞體外清洗液(M2)、M16、KSOM培養(yǎng)液均購(gòu)自南京愛(ài)貝生物科技有限公司；活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自ThermoFisher公司；孕馬血清促性腺激素(PMSG)購(gòu)自寧波第二激素廠；乙草胺標(biāo)準(zhǔn)溶液購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；JC-1、RNA提取試劑盒均購(gòu)自Invirtrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自KAPA公司。體視顯微鏡(SZ61)購(gòu)自O(shè)lympus公司；熒光顯微鏡(Ti-S)購(gòu)自NIKON公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heracell 150i)購(gòu)自ThermoFisher公司；恒溫板(TP-UNI)購(gòu)自TOKAI HIT公司；PCR儀(9902)購(gòu)自Veriti公司。

1.2 方法

1.2.1 卵母細(xì)胞采集與培養(yǎng) 將小鼠腹腔注射10 IU PMSG，48 h后使用脫臼處死法處死，分離卵巢并置于M2液中。隨后在體視顯微鏡下，用1 mL注射器針頭刺破卵泡收集卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，用M2液清洗COCs 3遍后，將COCs分別轉(zhuǎn)移至含有0(對(duì)照組)、10、50、100、130、200 μmol/L乙草胺的M16液中體外成熟培養(yǎng)14 h。

1.2.2 第一極體排出率統(tǒng)計(jì) 將培養(yǎng)14 h后的COCs用0.1%透明質(zhì)酸酶去除卵丘，1% BSA-PBS清洗4次后，在體視顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)排出第一極體的卵母細(xì)胞數(shù)量。

1.2.3 卵母細(xì)胞體外受精與培養(yǎng) 將雄鼠使用頸椎脫臼法處死，采用無(wú)菌操作法摘取附睪尾采集精子，并放入裝有精子獲能液(TYH)的培養(yǎng)皿中，放于培養(yǎng)箱進(jìn)行獲能。將體外培養(yǎng)14 h后的各組COCs取出，精子用體外受精液(HTF)清洗3次，放入已提前平衡的培養(yǎng)小滴(20 μL)，加入20 μL密度為106/mL已獲能的精子。6 h后將受精卵取出，加入少量0.1%透明質(zhì)酸酶進(jìn)行吹打，用KSOM培養(yǎng)液清洗3次后用KSOM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h，統(tǒng)計(jì)各組囊胚率。通過(guò)第一極體排出率及囊胚率，篩選出適宜濃度的乙草胺用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 囊胚細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞凋亡率測(cè)定 將培養(yǎng)96 h的囊胚用1% BSA-PBS清洗3次后放入3.7%多聚甲醛中室溫固定15 min，用1% BSA-PBS清洗4次后放入0.1% Triton X-100中37 ℃透膜15 min，用1% BSA-PBS清洗4次放入熒光素復(fù)合劑(Fluorescein-dUTP)避光孵育1 h，用1% BSA-PBS清洗3次放入Hoechst 33342染色劑37 ℃避光孵育35 min，用1% BSA-PBS清洗3次，放于載玻片，封片進(jìn)行拍照，ImageJ 1.48軟件統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 卵母細(xì)胞ROS、GSH、MMP水平的檢測(cè) 將在對(duì)照組及篩選出的適宜乙草胺濃度組培養(yǎng)液中培養(yǎng)14 h的COCs用0.1%透明質(zhì)酸酶去除卵丘，用1% BSA-PBS清洗3次，隨后分別放入DCFH-DA、CMF2HC、JC-1染色液中，37 ℃避光孵育25 min，用1% BSA-PBS清洗4次后，分別放在熒光顯微鏡下拍照并用ImageJ 1.48軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。

1.2.6 卵母細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)量的檢測(cè) 將在對(duì)照組及篩選出的適宜乙草胺濃度組培養(yǎng)液中培養(yǎng)14 h的COCs用0.1%透明質(zhì)酸酶去除卵丘，用1% BSA-PBS清洗3次，用RNA提取試劑盒提取各組卵母細(xì)胞的總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GenBank中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)、B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、B細(xì)胞淋巴瘤-xl(Bcl-xl)基因的序列，用Primer Premier 3.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，引物信息見(jiàn)表1。引物均由深圳華大基因股份有限公司合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系20 μL：cDNA(80 ng/μL)2 μL，上、下游引物各0.5 μL，SYBR Green 10 μL，KSF ROX High 0.2 μL，KSF ROX LOW 0.2 μL，ddH2O 6.6 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 20 s；95 ℃ 3 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 1 s，共40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 每個(gè)試驗(yàn)至少重復(fù)3次。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用LSD法進(jìn)行組間多重比較。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 乙草胺對(duì)小鼠卵母細(xì)胞第一極體排出率的影響

與對(duì)照組相比，10、50 μmol/L乙草胺組卵母細(xì)胞第一極體排出率無(wú)顯著差異(P>0.05)；100、130、200 μmol/L乙草胺組卵母細(xì)胞第一極體排出率顯著降低(P<0.05)(圖1)。

2.2 乙草胺對(duì)小鼠早期胚胎發(fā)育能力的影響

由圖2可知，與對(duì)照組相比，10、50 μmol/L乙草胺組囊胚率無(wú)顯著差異(P>0.05)，100、130 μmol/L乙草胺組囊胚率顯著降低(P<0.05)，200 μmol/L乙草胺組體外受精胚胎未發(fā)育到囊胚期。由于100、130 μmol/L乙草胺不僅可以使卵母細(xì)胞第一極體排出率顯著降低，而且卵母細(xì)胞受精后可發(fā)育為囊胚，因此用于后續(xù)研究。

數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同 Values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05)；While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).The same as below圖1 各組小鼠卵母細(xì)胞第一極體排出率Fig.1 The first polar body excretion rates of mice in each group

2.3 乙草胺對(duì)小鼠卵母細(xì)胞ROS水平的影響

與對(duì)照組相比，100、130 μmol/L乙草胺組ROS水平顯著升高(P<0.05)，100與130 μmol/L乙草胺組間無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖3)。

A～C，分別代表對(duì)照組、100和130 μmol/L乙草胺組ROS水平染色圖片(100×)；D，各組ROS水平 A-C,The ROS staining pictures of the control group,100 and 130 μmol/L acetochlor groups,respectively (100×);D,ROS levels in each group圖3 各組小鼠卵母細(xì)胞ROS水平Fig.3 ROS levels of mouse oocytes in each group

2.4 乙草胺對(duì)小鼠卵母細(xì)胞GSH水平的影響

與對(duì)照組相比，100、130 μmol/L乙草胺組GSH水平顯著降低(P<0.05)，100與130 μmol/L乙草胺組間無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖4)。

A～C，分別代表對(duì)照組、100和130 μmol/L乙草胺組GSH水平染色圖片(100×)；D，各組GSH水平 A-C,Represent the GSH staining pictures of the control group,100 μmol/L and 130 μmol/L acetochlor groups,respectively (100×);D,GSH levels in each group圖4 各組小鼠卵母細(xì)胞GSH水平Fig.4 GSH levels of mouse oocytes in each group

2.5 乙草胺對(duì)小鼠卵母細(xì)胞MMP水平的影響

與對(duì)照組相比，100、130 μmol/L乙草胺組MMP水平顯著降低(P<0.05)，且130 μmol/L乙草胺組卵母細(xì)胞MMP水平顯著低于100 μmol/L乙草胺組(P<0.05)(圖5)。

A，對(duì)照組、100和130 μmol/L乙草胺組MMP水平染色圖片(200×)；B，各組MMP水平 A,The staining pictures of MMP levels in control group,100 and 130 μmol/L acetochlor groups (200×);B,MMP levels in each group圖5 各組小鼠卵母細(xì)胞MMP水平Fig.5 MMP levels of mouse oocytes in each group

2.6 乙草胺對(duì)小鼠卵母細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，100、130 μmol/L乙草胺組卵母細(xì)胞Caspase-9基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；100、130 μmol/L乙草胺組卵母細(xì)胞Bcl-2、Bcl-xl基因相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(圖6)。

2.7 乙草胺對(duì)小鼠早期胚胎發(fā)育質(zhì)量的影響

與對(duì)照組相比，100、130 μmol/L乙草胺組囊胚細(xì)胞總數(shù)顯著降低(P<0.05)，且130 μmol/L 乙草胺組囊胚細(xì)胞總數(shù)顯著低于100 μmol/L乙草胺組(P<0.05)；100、130 μmol/L乙草胺組囊胚內(nèi)細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，且130 μmol/L 乙草胺組囊胚內(nèi)細(xì)胞凋亡率顯著高于100 μmol/L乙草胺組(P<0.05)(圖7)。

圖6 各組小鼠卵母細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expression of apoptosis-related genes in mouse oocytes in each group

①A，對(duì)照組、100和130 μmol/L乙草胺組囊胚Hoechst 33342和Tunnel染色(400×)；B，各組囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)；C，各組細(xì)胞凋亡率。②箭頭代表凋亡細(xì)胞 ①A,Blastocyst Hoechst 33342 and Tunnel staining were performed in control group and 100 and 130 μmol/L acetochlor groups (400×);B,The number of cells in the blastocyst inner cell mass in each group;C,The apoptosis rate in each group.②Arrows represent apoptotic cells圖7 各組小鼠囊胚細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞凋亡率Fig.7 The total number of blastocyst cells and the apoptosis rate of mouse blastocysts in each group

3 討 論

輔助生殖技術(shù)在當(dāng)今社會(huì)迅速發(fā)展，卵母細(xì)胞排出第一極體作為判斷卵母細(xì)胞是否成熟的重要標(biāo)準(zhǔn)[8]，是后期胚胎形成的關(guān)鍵前提[9-10]。本試驗(yàn)首先研究了不同濃度乙草胺對(duì)小鼠卵母細(xì)胞成熟的情況，結(jié)果表明，100、130、200 μmol/L乙草胺組卵母細(xì)胞第一極體排出率顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明乙草胺可能阻滯了卵母細(xì)胞成熟的進(jìn)程。進(jìn)一步將卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精，發(fā)現(xiàn)100、130 μmol/L乙草胺組囊胚率顯著低于對(duì)照組，200 μmol/L乙草胺組未發(fā)育到囊胚期，這可能是由于乙草胺對(duì)卵母細(xì)胞的毒性作用導(dǎo)致的。將囊胚進(jìn)行dUTP和Hoechst 33342染色，結(jié)果顯示，100、130 μmol/L乙草胺組囊胚細(xì)胞總數(shù)比對(duì)照組顯著降低，100、130 μmol/L乙草胺組囊胚內(nèi)細(xì)胞凋亡率比對(duì)照組顯著升高，說(shuō)明乙草胺對(duì)小鼠卵母細(xì)胞的成熟具有毒性作用，并且這種毒性作用將持續(xù)影響卵母細(xì)胞受精后的發(fā)育潛力。楊曉梅等[11]研究表明，不同濃度乙草胺對(duì)中華大蟾蜍不同時(shí)期的早期胚胎均具有明顯致死作用，與本試驗(yàn)結(jié)果相符。因此，在體外培養(yǎng)過(guò)程中添加100 μmol/L乙草胺即可降低卵母細(xì)胞成熟和后期胚胎發(fā)育潛能。

氧化應(yīng)激是影響卵母細(xì)胞成熟的主要因素之一，絕大多數(shù)農(nóng)藥的殘留會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激[12-14]。ROS的形成是生命機(jī)體基礎(chǔ)代謝所產(chǎn)生的正?，F(xiàn)象，但是過(guò)量ROS會(huì)破壞機(jī)體氧化還原平衡，線粒體功能損傷和細(xì)胞凋亡[15]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，100、130 μmol/L乙草胺組卵母細(xì)胞ROS水平顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明乙草胺可以誘導(dǎo)小鼠卵母細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激。GSH在細(xì)胞氧化還原平衡維持中發(fā)揮重要作用，參與清除機(jī)體內(nèi)過(guò)量ROS，具有天然的抗氧化功能[16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，100、130 μmol/L乙草胺組GSH水平顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明乙草胺破壞了小鼠卵母細(xì)胞的氧化平衡狀態(tài)。蔣青桃等[17]研究表明，乙草胺對(duì)小鼠氧化應(yīng)激促進(jìn)精原細(xì)胞的死亡；李龍雪等[18]研究表明，乙草胺通過(guò)引起大鼠肝臟細(xì)胞的氧化應(yīng)激，促進(jìn)肝臟損傷。這些研究結(jié)果與本試驗(yàn)研究結(jié)果相符，說(shuō)明乙草胺可以改變細(xì)胞氧化-還原穩(wěn)態(tài)的作用，也揭示了乙草胺導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)育阻滯的內(nèi)在原因。當(dāng)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞中的線粒體功能會(huì)受到損傷。線粒體是完成細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)換的重要場(chǎng)所，參與細(xì)胞內(nèi)氧化-還原平衡及信號(hào)傳導(dǎo)[19-20]。MMP水平的高低會(huì)影響細(xì)胞的生存能力[21]。Torner等[22]研究表明，在卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中存在著活躍線粒體分布變化，并且線粒體在胞質(zhì)中的分布狀態(tài)與卵母細(xì)胞質(zhì)量直接相關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，100、130 μmol/L乙草胺組卵母細(xì)胞MMP水平顯著降低，表明100 μmol/L乙草胺即可引起的線粒體膜電位障礙，從而干擾卵母細(xì)胞成熟。

細(xì)胞凋亡是基因控制下的細(xì)胞程序性死亡，用于選擇清除衰老或變異的細(xì)胞[23]。據(jù)報(bào)道，接觸乙草胺會(huì)促使小鼠睪丸細(xì)胞產(chǎn)生凋亡[24]。本研究結(jié)果顯示，100、130 μmol/L乙草胺組小鼠卵母細(xì)胞促凋亡基因Caspase-9的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，抗凋亡基因Bcl-xl及Bcl-2轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。這表明100 μmol/L乙草胺即可通過(guò)影響凋亡相關(guān)因子mRNA的轉(zhuǎn)錄水平降低卵母細(xì)胞的質(zhì)量。

4 結(jié) 論

在卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中添加100 μmol/L乙草胺即可降低卵母細(xì)胞第一極體排出率，產(chǎn)生高水平的ROS、造成線粒體功能損傷及細(xì)胞凋亡，推測(cè)這是乙草胺暴露導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)育阻滯的潛在機(jī)制，結(jié)果可為研究體內(nèi)乙草胺對(duì)卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響提供參考。