焦安惠，張笑夢，趙予晗，王 宇，高青山

(1.延邊大學農(nóng)學院，延吉 133000；2.東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心，延吉 133000；3.吉林省延邊黃牛種質(zhì)資源保護工程研究中心，延吉 133000)

哺乳動物卵母細胞成熟的質(zhì)量是影響受精和胚胎發(fā)育潛能的主要因素[1-2]。卵母細胞體外成熟(IVM)技術(shù)是目前研究中應用最廣泛的人工生殖技術(shù)之一[3]。在體外成熟過程中，由于脫離相對穩(wěn)定的母體低氧環(huán)境，卵母細胞內(nèi)維持氧化還原穩(wěn)態(tài)的抗氧化系統(tǒng)受損，導致活性氧(ROS)堆積，造成氧化應激[4]?？寡趸到y(tǒng)由多種抗氧化基因調(diào)控，包括內(nèi)源性抗氧化酶及抗氧化劑，如過氧化氫酶(CAT)、過氧化物還原酶-3(Prdx3)、谷胱甘肽過氧化物酶3(GPx3)及谷胱甘肽(GSH)等[5]。CAT在細胞中分布廣泛，主要存在于過氧化物酶體、胞質(zhì)和線粒體中，將過氧化氫(H2O2)分解為氧氣和水[6]。H2O2是豐度最高的ROS分子之一，通過芬頓效應可導致細胞DNA損傷和細胞凋亡[7]。Prdx3可以通過催化過氧化氫和烷基過氧化氫的還原來調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的活性氧水平，在卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育中起著重要作用[8]。GPx能催化GSH形成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，將氧化物還原為羥基化合物，是生物機體抗氧化指標之一。當ROS積累超過內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的清除能力會導致連鎖反應并最終導致細胞結(jié)構(gòu)的損傷[9]，破壞線粒體功能，促使細胞凋亡，從而降低卵母細胞的質(zhì)量，影響早期胚胎發(fā)育潛力。線粒體作為細胞中重要的能量供應來源，也是ROS的主要內(nèi)源性來源，有促進Ca2+穩(wěn)態(tài)以及參與細胞凋亡等功能[3]。由線粒體介導的半胱天冬酶級聯(lián)激活是體外培養(yǎng)卵母細胞發(fā)生凋亡的主要途徑之一。該途徑基本上由細胞色素C的傳遞和半胱天冬酶的激活控制。線粒體在這一凋亡途徑中起著不可替代的作用。B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)家族通過促凋亡和抗凋亡成員之間的平衡在調(diào)節(jié)細胞死亡中發(fā)揮關鍵作用[10]。B淋巴細胞瘤-xl(Bcl-xl)是Bcl-2家族成員，Bcl-xl和Bcl-2具有抑制凋亡的作用，Bcl-xl的高表達可以抑制細胞色素C的釋放，從而抑制細胞凋亡。半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)是細胞凋亡過程中最重要的末端剪接酶，具有不可替代的作用。激活的Caspase-3是細胞凋亡的關鍵執(zhí)行者[11]。

氧化應激是影響卵母細胞體外成熟與發(fā)育的主要因素[4]。近年來，大量研究表明，在體外成熟培養(yǎng)液中添加抗氧化劑可有效降低氧化應激損傷，從而提高體外受精胚胎的發(fā)育潛力[12]。如褪黑素[13]、白藜蘆醇[14]、槲皮素[15]和黃連素[16]等。檸檬苦素(Lim)又稱吳茱萸內(nèi)酯、黃柏內(nèi)酯，是一種從中藥和柑橘類水果中提取的天然高度氧化的四環(huán)三萜類化合物[17-18]。目前已知的檸檬苦素類化合物大約有300余種，按其結(jié)構(gòu)劃分為三類：檸檬苦素苷元、降解型檸檬苦素和糖苷型檸檬苦素。Lam等[19]發(fā)現(xiàn)，Lim類化合物可以通過GST(谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶)促進GSH與人體中具有較高親和力的致癌物相連接，減少其毒性和增加其可溶性。Murthy等[20]發(fā)現(xiàn)，Lim能夠誘導內(nèi)源性凋亡通路的活化，下調(diào)Bcl-2/Bax比率，促使細胞色素C從線粒體內(nèi)釋放，但不會對Caspase-8的表達產(chǎn)生影響。已有研究發(fā)現(xiàn)，Lim具有抑制腫瘤細胞增殖[21]、抗炎、抗氧化、抗菌、抗肺纖維化的藥理作用[22-24]。除上述作用外，Lim類化合物還具有鎮(zhèn)痛、降低膽固醇，保護肝臟損傷[25]、防止動脈粥樣硬化等作用[26]。

Lim能有效抑制ROS的產(chǎn)生，快速淬滅自由基[27]，其修復氧化損傷的功能已受到越來越多研究人員的關注，但在動物生殖領域特別雌性配子發(fā)育過程中的具體作用鮮有研究。為了緩解氧化應激損傷，改善卵母細胞質(zhì)量，從而提高體外受精胚胎的發(fā)育潛力，本試驗以小鼠為研究對象，在體外成熟培養(yǎng)液中添加Lim，探討Lim對小鼠卵母細胞及后續(xù)體外受精早期胚胎發(fā)育的影響，為優(yōu)化卵母細胞體外成熟體系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 6～7周齡雌性昆明小鼠，體重22～26 g，購自延邊大學動物中心。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度維持在23～26 ℃，人工光照(黑暗、光照各12 h)，飼喂普通繁殖飼料，自由采食和飲水。

1.1.2 主要試劑及儀器 檸檬苦素(Acmec公司)；M2操作液、M16體外成熟培養(yǎng)液、KSOM胚胎培養(yǎng)液、TYH精子獲能培養(yǎng)液、HTF受精培養(yǎng)液(南京愛貝生物技術(shù)有限公司)；細胞內(nèi)ROS檢測試劑(DCFH-DA，南京建成生物工程研究所有限公司)；細胞內(nèi)谷胱甘肽檢測試劑(CMF2HC，ThermoFisher公司)；線粒體膜電位檢測試劑(JC-1)、mRNA提取試劑盒(Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Qiagen公司)；實時熒光定量PCR試劑(KAPA公司)；福爾馬林(FA)、Triton X-100、Hoechst 33342 試劑(Sigma-Aldrich公司)；TUNEL試劑盒(Roche公司)。體視顯微鏡(Olympus公司)；免疫熒光顯微鏡(Nikon公司)；PCR儀(Veriti公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(ThermoFisher公司)；可調(diào)移液槍(RAININ公司)；恒溫板(TOKAI HIT公司)。

1.2 最適Lim濃度篩選

將6～7周齡雌性昆明小鼠腹腔注射10 IU孕馬血清促性腺激素(PMSG)進行超數(shù)排卵，48 h后采用頸椎脫臼法處死，摘取雙側(cè)卵巢，用M2操作液清洗2次，用1 mL注射器針頭在體視顯微鏡下刺破卵泡，釋放卵丘-卵母細胞復合體(COCs)。將包裹3層以上卵丘細胞的COCs用預平衡的M16培養(yǎng)液清洗5次，放入提前2 h預平衡的添加0(對照組)、10、20、50 μmol/L Lim的M16培養(yǎng)小滴中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h后，用0.1%透明質(zhì)酸酶(Hy)消化卵丘顆粒細胞，用1% BSA-PBS清洗4次，統(tǒng)計各組小鼠卵母細胞第一極體(PBI)排出率，以確定后續(xù)試驗的最適Lim濃度。

1.3 Lim對卵母細胞體外成熟的影響

1.3.1 Lim對卵母細胞內(nèi)ROS和GSH水平的影響 按照1.2的方法將COCs進行12 h 體外成熟培養(yǎng)后去除卵丘顆粒細胞，將卵母細胞分為對照組及最適Lim濃度組，分別用1% BSA-PBS按1∶1 000稀釋DCFH-DA、CMF2HC染色劑，將卵母細胞用1% BSA-PBS清洗4次后置于稀釋好的染色劑中，38 ℃避光孵育20 min，用 1% BSA-PBS清洗4次，置于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3.2 Lim對卵母細胞內(nèi)MMP水平的影響 按照1.2的方法將COCs進行12 h體外成熟培養(yǎng)后去除卵丘顆粒細胞，將卵母細胞分為對照組及最適Lim濃度組，分別用1% BSA-PBS按1∶1 000稀釋JC-1染色劑，將卵母細胞用1% BSA-PBS清洗4次后置于稀釋好的染色劑中，38 ℃避光孵育20 min，用 1% BSA-PBS清洗4次，置于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。紅色熒光代表線粒體高電位，綠色熒光代表線粒體低電位，以紅熒光強度/綠熒光強度表示MMP水平。

1.3.3 Lim對卵母細胞抗氧化及凋亡相關基因表達水平的影響 按照1.2的方法將COCs進行12 h體外成熟培養(yǎng)后去除卵丘顆粒細胞，將卵母細胞分為對照組及最適Lim濃度組，每組收集20個成熟卵母細胞，在1% BSA-PBS中清洗3次，將樣本放置于50 μL裂解液中裂解。使用DynaBeads mRNA Direct Kit試劑盒提取RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GenBank中GPx3、CAT、Prdx3、Bcl-2、Bcl-xl和Caspase-3基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物，引物信息見表1。引物均由華大基因科技有限公司合成。PCR反應體系20 μL：cDNA 2 μL，SYBR Mix 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，ROX Low 0.4 μL，ddH2O 6.8 μL。PCR反應程序：95 ℃ 3 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 1 s。用2-ΔΔCt法計算各基因的相對表達量。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.3.4 成熟液中添加Lim對早期胚胎發(fā)育能力的影響 按照1.2的方法將COCs進行體外成熟培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后將卵母細胞分為對照組及最適Lim濃度組。選取10周齡健康雄鼠采取頸椎脫臼法處死，取出雙側(cè)附睪尾，用1 mL注射器針頭刺破附睪尾釋放精子，將精子團引入平衡后的TYH培養(yǎng)小滴中獲能1～1.5 h。吸取獲能精子，放入HTF微滴中精卵共孵育6 h后，將受精卵移至預平衡的KSOM微滴中，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)的24、96 h統(tǒng)計卵裂率和囊胚率。將對照組和試驗組的囊胚分別在多聚甲醛溶液(濃度為3.7%)中室溫固定20 min后，用1% BSA-PBS清洗3次移至1% BSA-PBS中封閉1 h，用0.5% Triton X-100室溫透膜40 min，用1% BSA-PBS清洗3次后，用1% BSA-PBS封閉1 h，將Fluorescein-dUTP與脫氧核苷酸轉(zhuǎn)化酶18∶2混合均勻，38 ℃避光染色1 h；用1% BSA-PBS清洗3次，放入1% BSA-PBS中38 ℃封閉1 h；用Hoechst 33342在38 ℃下避光染色20 min；用1% BSA-PBS清洗3次進行封片，在熒光顯微鏡下觀察并統(tǒng)計囊胚總細胞數(shù)及凋亡細胞數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

各試驗進行4次以上重復。用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，組間差異用t檢驗進行比較。結(jié)果用平均值±標準差表示。用GraphPad Prism 5.0軟件作圖。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 添加不同濃度Lim對卵母細胞體外成熟的影響

由圖1可知，與對照組相比，20 μmol/L Lim組PBI排出率顯著升高(P<0.05)，而10、50 μmol/L Lim組PBI排出率均無顯著差異(P>0.05)。因此，后續(xù)試驗均在成熟培養(yǎng)液中添加20 μmol/L Lim。

2.2 添加Lim對卵母細胞內(nèi)ROS和GSH水平的影響

由圖2可知，20 μmol/L Lim組ROS熒光強度低于對照組，20 μmol/L Lim組GSH熒光強度高于對照組(圖2A)；與對照組相比，Lim組ROS水平顯著降低(P<0.05)(圖2B)，Lim組GSH水平顯著增加(P<0.05)(圖2C)。

肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同 Values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05);While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).The same as below圖1 各組小鼠卵母細胞PBI排出率Fig.1 PBI excretion rate of mouse oocytes in each group

A，ROS、GSH熒光染色(100×)；B，ROS相對水平；C，GSH相對水平 A,ROS and GSH fluorescence staining (100×);B,Relative level of ROS;C,Relative level of GSH圖2 各組小鼠卵母細胞的ROS和GSH水平Fig.2 ROS and GSH levels of mouse oocytes in each group

2.3 添加Lim對卵母細胞內(nèi)MMP水平的影響

由圖3可知，20 μmol/L Lim組MMP的高、低電位水平均高于對照組(圖3A)；與對照組相比，Lim組小鼠卵母細胞MMP水平顯著升高(P<0.05)(圖3B)。

2.4 添加Lim對卵母細胞抗氧化及凋亡相關基因表達水平的影響

由圖4可知，與對照組相比，20 μmol/L Lim組小鼠卵母細胞抗氧化相關基因GPx3、CAT和Prdx3及抗凋亡相關基因Bcl-2、Bcl-xl的表達水平均顯著上調(diào)(P<0.05)，促凋亡相關基因Caspase-3的表達水平顯著下調(diào)(P<0.05)。

A，MMP熒光染色(100×)；B，MMP相對熒光強度 A,MMP fluorescence staining(100×);B,MMP relative fluorescence intensity圖3 各組小鼠卵母細胞的MMP水平Fig.3 MMP levels of mouse oocytes in each group

圖4 各組小鼠卵母細胞抗氧化及凋亡相關基因相對表達量Fig.4 Relative expression of antioxidant and apoptosis-related genes of mouse oocytes in each group

2.5 在體外成熟期間添加Lim對體外受精早期胚胎發(fā)育的影響

由圖5可知，20 μmol/L Lim組囊胚內(nèi)細胞數(shù)多于對照組，凋亡細胞數(shù)低于對照組(圖5A)；與對照組相比，20 μmol/L Lim組卵裂率、囊胚率和囊胚總細胞數(shù)均顯著增加(P<0.05)(圖5B～5D)，凋亡率顯著降低(P<0.05)。

A，囊胚染色(200×)；B，卵裂率；C，囊胚率；D，囊胚總細胞數(shù)；E，囊胚內(nèi)凋亡細胞比率 A,Staining of blastocyst (200×);B,Cleavage rate;C,Blastocyst rate;D,Total cell number of blastocyst;E,Ratio of apoptotic cells in blastocyst圖5 各組體外受精胚胎體外發(fā)育情況Fig.5 In vitro development of in vitro fertilization embryos in each group

3 討 論

卵母細胞的成熟是胚胎發(fā)育的基石，體外成熟培養(yǎng)引起的氧化應激是卵母細胞成熟的關鍵問題之一。盡管科研人員為體外培養(yǎng)體系優(yōu)化做出巨大努力，但體外生產(chǎn)的囊胚數(shù)量和質(zhì)量仍落后于體內(nèi)生產(chǎn)的囊胚，其差異主要表現(xiàn)在形態(tài)、代謝、基因表達和低溫耐受性等方面，各個發(fā)育階段產(chǎn)生的負面影響都會對后續(xù)發(fā)育造成連鎖反應。本試驗結(jié)果表明，在體外成熟期間補充Lim對小鼠卵母細胞的成熟產(chǎn)生有利影響，增強了體外受精胚胎的卵裂率、囊胚率及囊胚內(nèi)細胞數(shù)。小鼠受精能力是胚胎發(fā)育關鍵步驟，在此時期細胞的發(fā)育容易受到氧化應激的干擾導致發(fā)育阻滯，氧化應激是二細胞胚胎中細胞周期停滯的主要原因之一[28]。本研究結(jié)果與使用其他抗氧化劑，如白藜蘆醇[14]、蝦青素[29]的研究結(jié)果一致。說明在體外成熟培養(yǎng)液中添加Lim可促進卵母細胞成熟，從而提高后續(xù)胚胎的發(fā)育潛力。

與體內(nèi)環(huán)境相比，體外培養(yǎng)過程中卵母細胞抗氧化能力降低，從而導致卵母細胞更易受到氧化應激的影響。卵母細胞中ROS水平升高會導致細胞膜損傷、DNA突變和斷裂，以及線粒體功能障礙，最終導致卵母細胞減數(shù)分裂停滯和胚胎發(fā)育受阻。GSH是一種直接抗氧化劑和幾種抗氧化酶的底物，因其本身含有巰基極易被氧化，所以具有清除自由基以及保護蛋白質(zhì)和酶等生物大分子巰基的功能。GSH水平的高低是卵母細胞胞質(zhì)成熟和影響卵母細胞還原能力的重要因素，間接反映了卵母細胞發(fā)育至囊胚階段的潛力[30]。本試驗中，Lim促進GSH生成，緩解了ROS過度積累，這與Li等[18]用Lim處理肝臟細胞減少ROS的積累、恢復部分GSH的結(jié)果一致。本試驗中，Lim提高了小鼠卵母細胞抗氧化相關基因GPx3、CAT和Prdx3的mRNA表達水平。Ishak等[31]研究發(fā)現(xiàn)，用Lim治療小鼠結(jié)直腸癌(CRC)可上調(diào)抗氧化相關基因mRNA表達，與本試驗結(jié)果一致。上述結(jié)果說明Lim在小鼠卵母細胞成熟過程中通過上調(diào)抗氧化相關基因參與了氧化還原穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，提高了小鼠卵母細胞抗氧化能力。

成熟卵母細胞和隨后胚胎發(fā)育高度依賴于線粒體，因其自身DNA (mtDNA)不受組蛋白保護而易受到氧化應激的影響[32]。MMP是線粒體依靠呼吸鏈在內(nèi)膜間形成的電勢差，是線粒體氧化磷酸化和形成ATP的源動力[33]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加Lim可顯著提高卵母細胞MMP水平，這與褪黑素[34]、原花青素B1[35]等抗氧化劑通過提高MMP水平而提升卵母細胞質(zhì)量的相關報道一致。本研究結(jié)果表明，小鼠卵母細胞體外成熟期間用Lim處理可以顯著改善線粒體功能，減少氧化應激的影響，提高卵母細胞發(fā)育能力。

氧化應激導致高水平的ROS通過損害卵母細胞和胚胎中的線粒體活性，導致細胞DNA被破壞和細胞色素C的釋放，破壞線粒體膜結(jié)構(gòu)，從而促使細胞凋亡發(fā)生[36]。本試驗中添加Lim處理后，小鼠卵母細胞的抗凋亡相關基因Bcl-2、Bcl-xl的mRNA表達水平提高，促凋亡相關基因Caspase-3的mRNA表達水平降低。Mahmoud等[37]發(fā)現(xiàn)，在大鼠肝細胞中添加Lim可降低凋亡標志基因Caspase-3的表達，表明Lim在缺血性肝臟中發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用，這與本研究結(jié)果一致。本試驗還發(fā)現(xiàn)，添加Lim可以降低囊胚內(nèi)凋亡細胞比率。卵母細胞中凋亡相關基因mRNA表達水平和囊胚凋亡結(jié)果均證明添加Lim可抑制卵母細胞發(fā)育至囊胚過程中的細胞凋亡。

4 結(jié) 論

在體外成熟培養(yǎng)液中添加20 μmol/L Lim可以保護卵母細胞在體外成熟培養(yǎng)過程中免受氧化應激損傷、提高抗氧化能力、增強線粒體功能、降低細胞凋亡水平，提高卵母細胞成熟質(zhì)量從而提高體外受精胚胎的發(fā)育潛力。