馮 勉，尚明玉，畢亞珍，胡文萍，張 莉

(中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

烏珠穆沁羊和湖羊是中國重要的地方綿羊品種，其中烏珠穆沁羊具有產肉性能好、生長速度快、耐粗飼和抗病力強等優(yōu)點，在中國內蒙古地區(qū)被大量飼養(yǎng)[1-2]。湖羊具有性成熟早、繁殖力高、發(fā)育速度快和適應力強等優(yōu)點，近年來逐漸被全國很多地方引入[3-5]。分子標記技術因具有更豐富的信息量、更高的準確性已經在畜禽種質資源評價、候選功能基因定位、疾病診斷與治療和分子輔助育種等方面被廣泛應用[6-8]。

巖藻糖基轉移酶8(fucosyltransferase 8，FUT8)基因是巖藻糖基轉移酶家族成員之一，位于綿羊7號常染色體上，在哺乳動物組織中普遍存在，并對正常的生長發(fā)育具有重要的作用[9-11]。研究發(fā)現，FUT8是唯一能夠負責產生核心聚焦結構的酶，在核心巖藻糖基化過程中，僅FUT8能夠催化N-聚糖完成糖基化[12]。Wang等[10]研究發(fā)現，敲除FUT8基因會影響小鼠的正常生長，導致小鼠發(fā)育遲緩甚至死亡，其致病機理與TGF-β信號通路密切相關。李明等[13]研究證實，敲除FUT8基因不僅影響小鼠的正常發(fā)育，而且影響小鼠腸道微生物的組成。Seth等[14]研究發(fā)現，在斑馬魚FUT8基因敲低模型中，FUT8基因表達量降低會導致斑馬魚輕度獨眼、小前腦和U形體節(jié)缺陷。Yoshida等[15]對1 309條尼羅羅非魚8個表型性狀的全基因組關聯分析結果表明，FUT8基因的1個突變位點與總增重及日增重均具有顯著相關性。在人的肝癌研究中，降低FUT8基因的表達可以降低肝癌細胞的活性并減弱細胞的轉移和侵襲能力[16]。目前，FUT8基因在畜禽研究中報道較少，僅在俾路支羊中發(fā)現FUT8基因的1個SNP與日增重顯著相關[17]。因此，開展綿羊FUT8基因多態(tài)性與生長發(fā)育表型相關性的研究具有重要的意義。

本研究以烏珠穆沁羊和湖羊為研究對象，通過檢索數據庫和查閱文獻[18]，選擇與體重、體尺性狀相關聯的FUT8基因g.74522417 C>T位點，采用飛行時間質譜及基因芯片2種方法對FUT8基因g.74522417 C>T位點進行基因型檢測，并將基因型與2個品種綿羊生長性狀進行關聯分析，以期為豐富綿羊分子標記資源、改良綿羊生長發(fā)育性狀提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗群體和表型數據

307只烏珠穆沁羊來自內蒙古東烏珠穆沁旗原種羊場和正藍旗羊場，993只湖羊來自甘肅中盛華美羊產業(yè)發(fā)展有限公司。試驗羊健康水平良好且體況相近，采用統一的飼養(yǎng)標準、營養(yǎng)水平和管理規(guī)范。頸靜脈采集血樣并裝于含有抗凝劑的離心管中，―20 ℃保存?zhèn)溆?。使用血液基因組DNA提取試劑盒(Omega公司)提取綿羊血液基因組DNA，―80 ℃保存?zhèn)溆?。生長性狀測定指標包括：烏珠穆沁羊4月齡體重和體尺(體高、體長、胸圍、管圍)，6月齡體重和體尺(體高、體長、胸圍、管圍、胸寬、胸深)；湖羊初生重、斷奶重、2月齡重，3、4月齡的體重和體尺(體高、體長、胸圍、管圍、胸寬、胸深、腰角寬、十字部高)，5、6月齡的體重和體尺(體高、體長、胸圍、管圍、胸寬、胸深、腰角寬、十字部高)以及背膘厚度、眼肌面積。所有性狀指標均按照《肉羊生產性能測定技術規(guī)范》(T/CAAA080—2022)的規(guī)定執(zhí)行，并對表型數據進行校正，校正后均呈正態(tài)分布。

1.2 位點信息及引物合成

通過查詢數據庫確定FUT8基因存在于綿羊的7號染色體，g.74522417 C>T位點所在位置為FUT8基因的內含子區(qū)域。根據突變位點的物理位置信息，采用Assay Design 3.1軟件設計合適的引物，其中上游引物：5′-ACGTTGGATGCATGT-AGCTCAGAAACACAG-3′；下游引物：5′-ACGT-TGGATGTTGGTCTAGGAAAGAAAAG-3′。引物由SEQUENOM公司合成。

1.3 基因分型

采用Illumina OvineSNP 600K BeadChip及Illumina OvineSNP 50K BeadChip芯片分別對烏珠穆沁羊和湖羊2個群體FUT8基因g.74522417 C>T突變位點進行基因型檢測，利用Plink 1.90對2個品種綿羊芯片數據進行質量控制。采用Sequenom MassARRAY?SNP技術對烏珠穆沁羊FUT8基因g.74522417 C>T突變位點進行基因型檢測，分型所用的DNA樣本均經檢測合格之后方可使用。具體步驟包括：利用設計合成的特異性引物進行PCR擴增；擴增產物磷酸化處理；單堿基延伸；延伸產物純化；純化產物點樣至芯片上；飛行時間質譜；提取原始數據。

1.4 數據統計分析

使用Excle 2016計算FUT8基因g.74522417 C>T位點的基因頻率、基因型頻率、純合度(homozygosity,Ho)、雜合度(heterozygosity,He)和有效等位基因數(effectively allele number,Ne)。通過χ2檢驗檢測突變位點在群體中的哈代-溫伯格平衡狀態(tài)，其中P>0.05表示該位點處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)。通過多態(tài)信息含量(polymorphic information content,PIC)檢測基因變異程度，其中PIC<0.25表示低度多態(tài)；0.250.50表示高度多態(tài)，基因多態(tài)性越高變異程度越大[19]。利用SPSS 25.0統計軟件中的單因素方差分析對基因型和表型性狀進行關聯分析，利用鄧肯氏法進行差異顯著性檢驗，數據用平均值±標準誤表示，P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著[20-21]。

2 結 果

2.1 FUT8基因g.74522417 C>T位點分型及多態(tài)性

在烏珠穆沁羊群體中，FUT8基因g.74522417 C>T位點通過綿羊600K芯片和飛行時間質譜分型的結果相同，均檢測到3種基因型：CC、TC和TT，其中TC型為優(yōu)勢基因型；多態(tài)信息含量為0.37，屬于中度多態(tài)；純合度、雜合度及有效等位基因數分別為0.50、0.50和2.00(表1)。χ2檢驗結果表明，FUT8基因g.74522417 C>T位點在烏珠穆沁羊群體中處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)(P>0.05)。

在湖羊群體中，FUT8基因g.74522417 C>T位點通過綿羊50K芯片也檢測到3種基因型：CC、TC和TT，其中TC為優(yōu)勢基因型；多態(tài)信息含量為0.37，屬于中度多態(tài)；純合度、雜合度及有效等位基因數分別為0.50、0.50和1.98(表1)。χ2檢驗結果表明，FUT8基因g.74522417 C>T位點在湖羊群體中處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)(P>0.05)。

2.2 FUT8基因g.74522417 C>T位點與烏珠穆沁羊不同發(fā)育時期生長性狀的關聯分析

由表2可知，4月齡烏珠穆沁羊FUT8基因g.74522417 C>T位點TC基因型個體體長顯著大于CC基因型(P<0.05)，6月齡TC基因型個體體高顯著大于TT基因型(P<0.05)，其他生長性狀在不同基因型個體之間均無顯著差異(P>0.05)。

2.3 FUT8基因g.74522417 C>T位點與湖羊不同發(fā)育時期生長性狀的關聯分析

由表3、4可知，各時間點湖羊FUT8基因g.74522417 C>T位點不同基因型個體間體重差異均不顯著(P>0.05)；3月齡湖羊TC和CC基因型個體管圍顯著大于TT基因型(P<0.05)；5月齡湖羊CC基因型個體管圍和腰角寬均顯著大于TT基因型(P<0.05)；6月齡湖羊CC基因型個體的管圍極顯著大于TT基因型(P<0.01)，其他體尺性狀不同基因型個體之間差異均不顯著(P>0.05)。由表5可知，6月齡湖羊FUT8基因g.74522417 C>T位點CC基因型個體眼肌面積顯著大于TT基因型(P<0.05)，5、6月齡背膘厚度和5月齡眼肌面積不同基因型個體之間差異均不顯著(P>0.05)。

表5 FUT8基因g.74522417 C>T位點與5、6月齡湖羊眼肌面積和背膘厚的關聯分析Table 5 The association analysis of FUT8 gene g.74522417 C>T with eye muscle area and backfat thickness in Hu sheep at 5 and 6 months of age

3 討 論

近年來，隨著人民生活水平的不斷提高，羊肉需求量也日益增加。中國雖是養(yǎng)羊和羊肉消費大國，存欄量、出欄量和羊肉產量均居世界第一位，但單產水平較低，自給能力不足，綿羊胴體重與畜牧業(yè)發(fā)達國家相比仍然存在較大差距[22-24]。隨著生物信息學與分子生物學技術的快速發(fā)展，畜禽動物遺傳育種技術也取得了相當的進步，利用分子標記輔助選擇技術來優(yōu)化經濟性狀指標和培育高產優(yōu)良品種已逐漸成為重要的育種手段。因此，挖掘和篩選綿羊生長性狀的關鍵候選基因和標記位點有助于加快其分子選育進程，加速優(yōu)質種羊培育，提高養(yǎng)殖者的經濟效益。

FUT8基因在哺乳動物組織中廣泛表達，是翻譯后N-糖基化修飾過程中的關鍵酶，這種翻譯后修飾可快速改變蛋白質的生物學性質。FUT8能夠與多種蛋白質及受體相互作用，廣泛參與調節(jié)細胞內的多種代謝及信息傳遞途徑，對細胞生長和分化具有顯著影響[25]。目前，FUT8基因的研究主要集中在小鼠和人上，與機體正常器官和骨骼肌發(fā)育密切相關[13-14]。為了深入探索FUT8基因與綿羊生長性狀的相關性，本研究通過基因分型檢測了FUT8基因g.74634571 C>T位點在湖羊和烏珠穆沁羊2個群體中的多態(tài)性，結果發(fā)現，FUT8基因g.74522417 C>T位點在2個綿羊群體中均處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)，說明FUT8基因g.74522417 C>T位點在長期的選擇和進化過程中具有較強的遺傳穩(wěn)定性，受到較少的人工選擇，未發(fā)生遺傳漂變。FUT8基因g.74522417 C>T位點在湖羊和烏珠穆沁羊中的有效等位基因數約為2，說明該位點在湖羊和烏珠穆沁羊群體中均勻分布。純合度和雜合度均為0.50，表明在這2個綿羊群體中遺傳豐富度較高。FUT8基因g.74522417 C>T位點在烏珠穆沁羊和湖羊群體中均處于中度多態(tài)，說明該位點在這2個綿羊群體中的變異可能性較大，作為選擇位點的潛力較大。

研究發(fā)現，FUT8基因與雞體內脂肪沉積顯著相關[25]；FUT8基因g.74634571位點與0～6月齡俾路支羊日增重顯著關聯[17]。本研究結果表明，在烏珠穆沁羊群體中，FUT8基因g.74522417 C>T位點TC基因型個體4月齡體長顯著大于CC基因型，6月齡個體體高顯著大于TT基因型；在湖羊群體中，FUT8基因g.74522417 C>T位點TC和CC基因型個體3月齡管圍顯著大于TT基因型個體，CC基因型個體5月齡管圍、腰角寬及6月齡管圍、眼肌面積均顯著或極顯著大于TT基因型。盡管FUT8基因g.74522417 C>T位點與湖羊和烏珠穆沁羊體重的相關性并不顯著，但本研究發(fā)現，TC基因型烏珠穆沁羊個體體尺更具優(yōu)勢，TC和CC基因型湖羊個體體尺更具優(yōu)勢，FUT8基因g.74522417 C>T位點在不同程度上與烏珠穆沁羊和湖羊的生長發(fā)育性狀顯著關聯。因此，FUT8基因g.74522417 C>T位點可作為影響烏珠穆沁羊、湖羊生長發(fā)育性狀的候選分子標記。

4 結 論

FUT8基因g.74522417 C>T位點與烏珠穆沁羊4月齡體長、6月齡體高均呈顯著關聯，與湖羊3月齡胸圍、5月齡管圍和腰角寬、6月齡管圍和眼肌面積均呈顯著或極顯著關聯。該位點可能是影響綿羊生長性狀的潛在分子標記，在綿羊分子選育中具有一定的指導意義。