姚元謙 呂建林 柳琳琳 王光耀

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病科，廣西南寧 530023

肝細(xì)胞癌目前仍是全球致死性惡性腫瘤的主要類(lèi)型之一[1]。手術(shù)治療是肝癌患者早期有效治療手段，可惜大部分患者確診時(shí)已是中晚期，盡管近年來(lái)開(kāi)發(fā)了多種晚期肝癌的新療法，但仍達(dá)不到臨床所需療效[2-3]。鐵死亡主要由鐵介導(dǎo)的氧化損傷、過(guò)度脂質(zhì)氧化和細(xì)胞膜損傷驅(qū)動(dòng)[4]，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡在各種癌癥治療中具有重要作用[5]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）起初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，而近年積累的證據(jù)表明，lncRNA 的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[6]。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)，構(gòu)建基于鐵死亡相關(guān)lncRNA 的肝癌預(yù)后模型，希望能為打破肝癌治療困境提供新視角。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)下載肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共424 個(gè)樣本。從FerrDb 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取246 個(gè)與肝癌相關(guān)的鐵死亡基因。

1.2 鐵死亡基因功能富集分析

運(yùn)用R 軟件進(jìn)行差異分析，并以|logFC|＞1、FDR＜0.05 為過(guò)濾條件，篩選出差異表達(dá)基因，進(jìn)行基因集（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）、GO、KEGG 富集分析。

1.3 鐵死亡相關(guān)lncRNA 篩選

參考Gencode 數(shù)據(jù)庫(kù)的基因注釋?zhuān)崛∞D(zhuǎn)錄組中的lncRNA。運(yùn)用Pearson 相關(guān)性檢驗(yàn)，以|cor|＞0.4、P ＜0.001 為過(guò)濾條件，獲取鐵死亡相關(guān)lncRNA。

1.4 預(yù)后相關(guān)鐵死亡lncRNA 篩選

通過(guò)差異分析，提取差異鐵死亡lncRNA 的腫瘤組表達(dá)數(shù)據(jù)，進(jìn)行單因素Cox 回歸分析，以P ＜0.001為過(guò)濾條件，篩選與預(yù)后相關(guān)的鐵死亡lncRNA。

1.5 構(gòu)建肝癌預(yù)后模型

進(jìn)行多因素Cox 回歸分析，構(gòu)建基于鐵死亡相關(guān)lncRNA 的預(yù)后模型，該模型的計(jì)算公式：

其中xi為每個(gè)lncRNA 的表達(dá)水平，Coefi為回歸系數(shù)。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將隊(duì)列中的患者分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組，并進(jìn)行預(yù)后分析。

1.6 低風(fēng)險(xiǎn)組與高風(fēng)險(xiǎn)組的免疫差異

從TIMER2.0 數(shù)據(jù)庫(kù)下載免疫細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)據(jù)，并通過(guò)文獻(xiàn)檢索獲得47 個(gè)免疫檢查點(diǎn)基因。以P ＜0.05 為過(guò)濾條件，篩選兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的免疫細(xì)胞、免疫檢查點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 鐵死亡基因功能富集分析

篩選出84 個(gè)差異表達(dá)鐵死亡基因，見(jiàn)圖1A。GSEA 富集分析發(fā)現(xiàn)，涉及雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物（mechanistic target of Rapamycin 1，mTORC1）基因集、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）調(diào)控基因集等，見(jiàn)圖1B。GO、KEGG 富集分析得到生物學(xué)進(jìn)程631 條、細(xì)胞組分22 條、分子功能77 條、信號(hào)通路56 條，見(jiàn)圖1C～D。

圖1 鐵死亡基因差異分析及富集分析

2.2 篩選預(yù)后相關(guān)的鐵死亡lncRNA 并構(gòu)建預(yù)后模型

共鑒定出5 296 個(gè)與鐵死亡相關(guān)的lncRNA，篩選出差異lncRNA 共781 個(gè)，預(yù)后分析獲得66 個(gè)與預(yù)后相關(guān)的lncRNA?；貧w分析納入17 個(gè)lncRNA 參與模型構(gòu)建，其模型相關(guān)系數(shù)詳見(jiàn)表1。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式計(jì)算各患者的風(fēng)險(xiǎn)得分，并將隊(duì)列中的肝癌患者分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組。

表1 構(gòu)建預(yù)后模型多因素Cox 分析結(jié)果

2.3 預(yù)后分析及模型評(píng)估

Kaplan-Meier 生存曲線(xiàn)及預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)散點(diǎn)圖顯示，低風(fēng)險(xiǎn)組預(yù)后優(yōu)于高風(fēng)險(xiǎn)組（P ＜0.01），見(jiàn)圖2A～B。受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線(xiàn)顯示，該模型對(duì)生存期具有良好的預(yù)測(cè)能力，且優(yōu)于其他臨床性狀的預(yù)測(cè)效果，見(jiàn)圖2C～D?；貧w分析顯示，該模型與總生存期顯著相關(guān)，且具有獨(dú)立預(yù)后價(jià)值，見(jiàn)圖2E～F。

圖2 兩組預(yù)后分析及模型評(píng)估

2.4 預(yù)后相關(guān)lncRNA-mRNA 共表達(dá)分析

模型中l(wèi)ncRNA 基本在高風(fēng)險(xiǎn)患者中呈高表達(dá)狀態(tài)，且大部分隨著病程的進(jìn)展而增高。lncRNAmRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖3A，圖中紅色節(jié)點(diǎn)為lncRNA、綠色節(jié)點(diǎn)為mRNA；表達(dá)熱圖見(jiàn)圖3B。

圖3 參與模型構(gòu)建的lncRNA 表達(dá)分析

2.5 高風(fēng)險(xiǎn)組與低風(fēng)險(xiǎn)組免疫差異分析

免疫細(xì)胞浸潤(rùn)熱圖見(jiàn)圖4A，圖中展示了不同平臺(tái)的分析結(jié)果。有17 個(gè)具有表達(dá)差異的免疫檢查點(diǎn)，見(jiàn)圖4B。根據(jù)以上免疫分析的結(jié)果，進(jìn)一步分析14 個(gè)差異最顯著的鐵死亡基因（logFC＞3）與免疫分子靶點(diǎn)間的相關(guān)性，見(jiàn)圖5。

圖4 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及免疫檢查點(diǎn)的差異分析

圖5 鐵死亡基因與免疫靶點(diǎn)相關(guān)性分析

3 討論

鐵死亡作為一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式，在腫瘤研究中備受關(guān)注，而lncRNA 與鐵死亡之間具有調(diào)控關(guān)系[7]。本研究利用生物信息學(xué)，分析鐵死亡及相關(guān)lncRNA 在肝癌中的作用機(jī)制。

差異表達(dá)最顯著的鐵死亡基因中，部分已被證實(shí)參與鐵代謝或腫瘤的調(diào)節(jié)。NQO1 在細(xì)胞內(nèi)起到抗氧化作用[8]，其在肝癌患者中高表達(dá)，且與患者生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)[9]。SLC7A11 在多種惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)，能夠抑制鐵死亡、促進(jìn)腫瘤發(fā)展[10-11]。AURKA 是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)激酶，其能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡[12]。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）能維持細(xì)胞的抗氧化損傷作用，G6PD 過(guò)表達(dá)能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖[13-14]。HAMP 是維持體內(nèi)鐵代謝穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵基因，當(dāng)HAMP 表達(dá)下調(diào)時(shí)可抑制細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[15]。富集分析發(fā)現(xiàn)，在肝癌中mTORC1 復(fù)合物處于激活狀態(tài)，其能通過(guò)調(diào)節(jié)代謝過(guò)程為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[16]。糖酵解途徑也在肝癌中處于激活狀態(tài)，是腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)活躍的代謝表征，糖酵解是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)[17]。而γ 干擾素應(yīng)答調(diào)控途徑在肝癌中處于抑制狀態(tài)，該因子缺陷小鼠能自發(fā)地發(fā)生肺上皮惡性腫瘤[18]，但也有研究認(rèn)為其能夠使腫瘤細(xì)胞誘發(fā)強(qiáng)效的免疫逃逸機(jī)制[19]?？籽┑萚20]發(fā)現(xiàn)，敲除AC012073.1 能夠明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力，而過(guò)表達(dá)該基因則會(huì)促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。LINC00205 能夠作為內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)性RNA，促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖[21]，且該基因高表達(dá)的肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率較高[22]。

免疫治療策略能提高肝癌患者的生存率[23]。腫瘤中的淋巴細(xì)胞在免疫逃逸中發(fā)揮著重要作用，包括調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞、腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞等[24]。本研究結(jié)果顯示，高、低風(fēng)險(xiǎn)組有17 個(gè)具有表達(dá)差異的免疫檢查點(diǎn)。目前，以單克隆抗體為代表的一系列免疫檢查點(diǎn)抑制劑在抗腫瘤中取得了較大成功[25]。