唐穎慧，葉苗青，何瑾瑜，劉皎皎，李粉萍，薛敬東，楊躍青

(陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710003)

非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除酒精和其他明確損肝因素外所致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過(guò)度沉積、肝臟彌漫性脂肪浸潤(rùn)為主要臨床特征的疾病[1]。NAFLD病程包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化、肝癌。實(shí)踐提示，這種疾病后期通常會(huì)向肝硬化乃至肝癌進(jìn)行演變，對(duì)人們的身體健康已經(jīng)構(gòu)成嚴(yán)重威脅[2]。國(guó)內(nèi)有1/3的人群患有非酒精性脂肪性肝病，隨著生活方式的迅速轉(zhuǎn)變，我國(guó)非酒精性脂肪性肝病發(fā)展日益加重[3-4]。因此，NAFLD的發(fā)病機(jī)制和藥物防治已經(jīng)成為當(dāng)前中醫(yī)研究熱點(diǎn)。

化脂復(fù)肝顆粒是根據(jù)陜西省中醫(yī)醫(yī)院名中醫(yī)張瑞霞治療脂肪肝的經(jīng)驗(yàn)方制成的中成藥，其可減輕四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷，可明顯降低乙硫氨酸誘導(dǎo)的脂肪肝大鼠的總膽紅素和TG含量，減輕脂肪肝重量和肝臟病理?yè)p傷[5]。張欣等[6]和李小瑞等[7]報(bào)道采用化脂復(fù)肝顆粒治療脂肪肝患者的總有效率分別達(dá)到 86.9% 和 86.7%，證實(shí)化脂復(fù)肝顆粒具有降低血脂、保肝降酶及改善脂肪肝臨床表現(xiàn)的作用，但目前化脂復(fù)肝顆粒治療非酒精性脂肪性肝病的機(jī)制并不十分明確。

近年相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞是肝臟內(nèi)含量最豐富的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，肝臟中的巨噬細(xì)胞Kupffer細(xì)胞(KCs)是肝臟中炎癥因子的最主要來(lái)源，KCs被激活后，其分泌的各種細(xì)胞因子會(huì)直接作用于肝臟內(nèi)的其他細(xì)胞，能夠直接影響肝臟內(nèi)的脂質(zhì)代謝而誘發(fā)脂肪肝[8]，在NAFLD進(jìn)展及肝臟炎癥損傷中發(fā)揮不可或缺的作用[9-10]。本研究分離培養(yǎng)SD大鼠原代肝臟KCs，通過(guò)設(shè)置不同實(shí)驗(yàn)組別，觀察LPS、高糖對(duì)肝臟KCs炎癥通路的刺激作用，并以化脂復(fù)肝顆粒含藥血清干預(yù)，進(jìn)一步解釋化脂復(fù)肝顆粒通過(guò)改善內(nèi)毒素血癥治療NAFLD的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 原代SD大鼠KCs分離與培養(yǎng) 4周齡雄性SD大鼠禁食不禁水48 h，斷頸處死。肝內(nèi)灌注預(yù)熱灌注液，待肝臟脂肪變軟后以37 ℃預(yù)熱0.5%Ⅳ型膠原酶灌注，剔除肝包膜及結(jié)締組織，剪碎至2 mm×2 mm×2 mm小塊，酶解消化，200目篩網(wǎng)過(guò)濾。離心取上清后再次離心，沉淀細(xì)胞行Percoll 密度梯度離心，收集KCs，制備1×106個(gè)/ml細(xì)胞懸液，接種6孔培養(yǎng)板，37 ℃溫箱內(nèi)孵育20 min，PBS洗去未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)備用。

1.2 KCs分組及處理 分離培養(yǎng)KCs 48 h后，隨機(jī)將其分為空白組、LPS干預(yù)組、LPS+空白血清組、LPS+化脂復(fù)肝組、高糖+對(duì)照組、高糖+LPS干預(yù)組、高糖+LPS+空白血清組、高糖+LPS+化脂復(fù)肝組，LPS干預(yù)濃度為100 ng/ml，高糖干預(yù)為于KCs培養(yǎng)基中另加入葡萄糖30 mmol/L。

1.3 藥物及試劑、儀器 化脂復(fù)肝顆粒，陜西省中醫(yī)醫(yī)院提供；CCK-8試劑盒，碧云天生物公司；ELISA試劑盒，CUSABIO公司；RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒，TAKARA公司；酶標(biāo)儀(MK3)，THERMO 公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱，Sanyo公司。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 促炎因子指標(biāo)：收集培養(yǎng)基，離心取上清，ELISA法測(cè)定腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)含量。

1.4.2 RT-qPCR測(cè)定KCs中Toll 樣受體4(TLR4)、髓樣分化因子(MyD88)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65(NF-κB p65)、NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)、TNF-α、IL-1β、IL-18 mRNA表達(dá)量。

收集細(xì)胞，取適量細(xì)胞樣本加入Trizol室溫裂解5 min，加入1/5Trizol體積的氯仿提取，并用異丙醇沉淀RNA后用75%乙醇洗滌，用滅菌DEPC水溶解抽提總RNA。取1 μg RNA用Super ScriptTMⅡ Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBR Green染料法進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。引物序列：βactin-F 5’-ACCCTAAGGCCAACCGTGAAA-3’，βactin-R 5’-ATGGCGTGAGGGAGAGCATA-3’；TLR4-F 5’-TTCTGCAATGTCTCTGGCAGG-3’，TLR4-R 5’-GCTGAGACTTGGTAGGGCCA-3’；MyD88-F 5’-TGTTCTTGAACCCTCGGACG-3’，MyD88-R 5’-TTCCAGCTCTCGGATCTCCA-3’；NF-κB p65-F 5’-ATCATCGAACAGCCGAAGCA-3’，NF-κB p65-R 5’-TGATGGTGGGGTGTGTCTTG-3’；TNF-α-F 5’-AGGCACTCCCCCAAAAGATG-3’；TNF-α-R 5’-ACTGATGAGAGGGAGGCCAT-3’；NLRP3-F5’-CCTTAAGCTGGAGCTGCTGT-3’；NLRP3-R5’-TCACCTCTCGGCAGTGGATA-3’；Caspase-1-F5’-ACTGCTATGGACAAGGCACG-3’；Caspase-1-R5’-CCTGCCAGGTAGCAGTCTTC-3’；IL-1β-F5’-TTCAGGCAGGCAGTATCACTC-3’；IL-1β-R5’-GAAGGTCCACGGGAAAGACAC-3’；IL-18-F5’-GACTCTTGCGTCAACTTCAAGG-3’；IL-18-R5’-CAGGCTGTCTTTTGTCAACGA-3’。反應(yīng)體系：Power SYBR=Green Master Mix 10 μl，10 μmol/L Forward Primer 0.5 μl，10 μmol/L micro-R 0.5 μl，SDW 8 μl，cDNA 1.0 μl，用DEPC水定容到總體積20 μl。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30～34 s，40個(gè)循環(huán)，60 ℃處收集熒光；55～95 ℃繪制溶解曲線。每個(gè)樣品重復(fù)3次，用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組KCs增殖情況比較 空白及高糖培養(yǎng)對(duì)照組KCs不斷增殖，長(zhǎng)勢(shì)良好；LPS+化脂復(fù)肝組與高糖+LPS+化脂復(fù)肝組KCs緩慢增殖，非高糖組KCs均較含高糖組KCs增殖速率更快；而LPS或高糖+LPS誘導(dǎo)模型組及各加空白血清組KCs于第6 h開始出現(xiàn)凋亡，含高糖組KCs均較非高糖組KCs凋亡速率更快。見圖1。

2.2 各組KCs培養(yǎng)基上清液中促炎因子TNF-α、IL-1β的含量比較 非高糖各組與含高糖各組中促炎因子TNF-α、IL-1β含量均呈相同變化趨勢(shì)，且含高糖各組上述促炎因子含量均較非高糖組高。以非高糖組為例，LPS誘導(dǎo)模型組和LPS+空白血清組的促炎因子TNF-α與IL-1β含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，LPS誘導(dǎo)模型組與LPS+空白血清組間TNF-α與IL-1β含量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與LPS誘導(dǎo)模型組或LPS+空白血清組比較，LPS+化脂復(fù)肝組促炎因子TNF-α與IL-1β含量均顯著降低(P<0.05)。見圖2。

2.3 各組KCs中TLR4/NF-κB/NLRP3通路相關(guān)基因表達(dá)水平比較 非高糖各組與含高糖各組中炎癥相關(guān)基因(TLR4、MyD88、NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β、IL-18)表達(dá)水平均呈相同變化趨勢(shì)，且含高糖各組上述促炎因子及炎癥相關(guān)基因表達(dá)水平均較非高糖組高。以非高糖組為例，LPS誘導(dǎo)模型組和LPS+空白血清組KCs中炎癥相關(guān)基因TLR4、MyD88等的mRNA表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，LPS誘導(dǎo)模型組與LPS+空白血清組間KCs中炎癥相關(guān)基因TLR4、MyD88等的mRNA表達(dá)水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與LPS誘導(dǎo)模型組及LPS+空白血清組比較，LPS+化脂復(fù)肝組KCs中炎癥相關(guān)基因TLR4、MyD88等的mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。見圖3。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

圖3 RT-qPCR檢測(cè)KCs中各炎癥相關(guān)基因表達(dá)水平

3 討 論

NAFLD又稱代謝相關(guān)脂肪性肝病(Metabolic associated fatty liver disease,MAFLD)，包括單純脂肪變性和脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis,NASH)，可進(jìn)展為肝臟纖維化及不可逆的肝硬化和肝細(xì)胞肝癌[11]。早期單純性脂肪肝的患者幾乎不表現(xiàn)出不良結(jié)果，隨著疾病進(jìn)展，如進(jìn)展至NASH，可出現(xiàn)多種并發(fā)癥，如肝衰竭、2型糖尿病(Type 2 diabetes，T2DM)、心血管疾病、腎臟疾病等代謝相關(guān)疾病[12-15]。近年來(lái)，對(duì)NAFLD的發(fā)病機(jī)制的研究有了重大進(jìn)展。關(guān)于NAFLD的發(fā)病機(jī)制，之前的“雙重打擊”學(xué)說(shuō)不足以解釋NAFLD中發(fā)生的相關(guān)分子和代謝變化，目前較推崇的是“多重打擊”學(xué)說(shuō)，其反映了NAFLD的發(fā)病過(guò)程的復(fù)雜性。其發(fā)病機(jī)制可能包括胰島素抵抗、脂肪因子損傷、脂肪組織分泌炎癥因子、腸道菌群紊亂、基因及表觀遺傳學(xué)異常、氧化應(yīng)激、環(huán)境影響及飲食因素等[16-18]。

KCs占全身巨噬細(xì)胞總數(shù)的80%～90%，是體內(nèi)最大的巨噬細(xì)胞群，占肝臟細(xì)胞總數(shù)的15%，占肝臟非實(shí)質(zhì)性細(xì)胞的20%～25%，占肝竇細(xì)胞總數(shù)的30%，是肝臟防御系統(tǒng)主要成員。KCs特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理功能及其在肝臟和全身巨噬細(xì)胞中所處的地位和性質(zhì)決定了它在全身和肝臟疾病發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。在NAFLD中，KCs大量浸潤(rùn)[19]，且極化的KCs會(huì)促進(jìn)NAFLD中肝臟炎癥-纖維化的啟動(dòng)和進(jìn)展[20]。KCs激活后通過(guò)產(chǎn)生TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β、INF-β等炎癥因子招募T淋巴細(xì)胞、NKT細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，間接參加炎癥和免疫反應(yīng)[21]。

有研究指出，NAFLD的進(jìn)展進(jìn)一步受到核苷酸結(jié)合域、富含亮氨酸的家族、熱蛋白結(jié)合域因子-3(NLRP3)炎性小體的影響。NLRP3炎性小體是一種多聚體復(fù)合物，是炎癥反應(yīng)中常見的急性產(chǎn)物。NLRP3炎性小體在慢性肝病的晚期進(jìn)展如NAFLD向NASH的進(jìn)展中起重要作用。Wree等[22]證明，經(jīng)膽堿氨基酸缺乏的飲食喂養(yǎng)，WT小鼠出現(xiàn)肝臟重量增加、血漿ALT和AST 升高等肝臟病理變化，而NLRP3-/-小鼠的肝腫大和肝損傷的表現(xiàn)則明顯減輕。同樣，與正常人比較，NASH 患者的 NLRP3、IL-1β及 IL-18 水平則明顯升高[22]。與正常飲食小鼠比較，高脂飲食組小鼠的 NF-κB的活性高出2倍，且伴有肥胖程度和胰島素抵抗的增加，以及炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α等的升高[23]。此外，有學(xué)者通過(guò)體外研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌DNA含有的未甲基化的胞嘧啶-鳥苷二核苷酸(CpG)序列，可與KCs表面的TLR9結(jié)合，可通過(guò)Toll/白介素-1受體(TIR)結(jié)構(gòu)域啟動(dòng)MyD88依賴性途徑，從而增強(qiáng)促炎基因的表達(dá)和產(chǎn)生IL-1β等[24]。

本研究通過(guò)用LPS或加高糖刺激KCs誘導(dǎo)炎癥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KCs中炎癥因子TNF-α、IL-1β含量以及炎癥相關(guān)基因TLR4、MyD88、NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β、IL-18 mRNA表達(dá)水平均顯著升高，且含高糖各組上述促炎因子及炎癥相關(guān)基因表達(dá)水平均較非高糖組更高。經(jīng)化脂復(fù)肝顆粒含藥血清治療組后，促炎因子TNF-α與IL-1β含量均顯著降低，炎癥相關(guān)基因TLR4、MyD88、NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β、IL-18的mRNA表達(dá)水平也均顯著降低(P<0.05)。提示化脂復(fù)肝顆粒含藥血清可改善KCs活力，有效減輕KCs炎癥反應(yīng)，減少KCs細(xì)胞焦亡的發(fā)生，具有顯著的抗炎、抗氧化損傷及保肝作用，推測(cè)其作用機(jī)制與TLR4/MyD88/NF-κB p65/NLRP3信號(hào)通路直接相關(guān)，為非酒精性脂肪性肝病的治療提供了新的思路及靶點(diǎn)。