于心同，楊文佳，趙 娜，陳云飛

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437)

圍絕經(jīng)期是女性一生中一個特殊時期，從閉經(jīng)前第一次月經(jīng)不規(guī)律開始，至閉經(jīng)1年后結(jié)束[1]。失眠是圍絕經(jīng)期女性常見的癥狀，圍絕經(jīng)期睡眠障礙的患病率與文化和種族密切相關(guān)[2]，在我國患病率高達51%～55%[3-4]，在美國患病率為31%～42%[5]，日本為28%，韓國為15.9%[6]。失眠不僅會影響患者心理健康，還會增加心臟和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和病死率[7-8]。圍絕經(jīng)期失眠(Perimenopausal insomnia，PMI)常與抑郁、潮熱、疲勞、食欲下降/增加、體重減輕/增加、夜尿癥共存，并可增加與失眠有關(guān)的危害[9-10]。研究表明較低的雌二醇和較高的黃體生成激素水平與圍絕經(jīng)期失眠顯著相關(guān)，但病理機制尚不明確[11-12]。激素替代療法被圍絕經(jīng)期失眠患者廣泛使用，但隨著激素的應(yīng)用，其弊端日益顯現(xiàn)，從短期治療來看，子宮出血和乳房觸痛是最主要的不良反應(yīng)[13-14]。針灸治療PMI療效顯著[15-16]，其通過審因論治、辨證取穴，在改善主客觀睡眠指標(biāo)、啟動內(nèi)源性的調(diào)節(jié)機制等方面占有明顯優(yōu)勢，針灸通過內(nèi)源性雌激素的調(diào)節(jié)大大減少了外源性雌激素導(dǎo)致的各種疾病的風(fēng)險，明顯提高了臨床治療PMI的安全性和有效性。電針治療PMI的報道眾多、療效肯定，但對大鼠睡眠覺醒腦電圖的改善報道描述不詳[17]。本研究通過客觀觀察模型大鼠睡眠覺醒腦電圖(睡眠覺醒時程、睡眠覺醒累積量、不同持續(xù)時間睡眠波出現(xiàn)次數(shù)、睡眠覺醒時相轉(zhuǎn)換次數(shù))及血清性激素的水平來探討電針對PMI大鼠睡眠覺醒的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：SPF級雌性SD大鼠，體重(200±20)g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK(滬)2018-0040。實驗動物分籠飼養(yǎng)在睡眠覺醒生物解析系統(tǒng)(腦電圖監(jiān)測專用飼養(yǎng)籠)。飼養(yǎng)環(huán)境：恒溫(24±1)℃、恒濕(60±2)%、隔音、靜電屏蔽、7:00 am至7:00 pm(12 h/12 h)明亮黑暗周期(光照度≈100 lux)，連續(xù)進行大鼠生殖道脫落細(xì)胞學(xué)觀察動情周期，出現(xiàn)典型的動情周期納入本實驗研究。實驗過程中嚴(yán)格遵照中華人民共和國科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。適應(yīng)性飼養(yǎng)后1周后進行實驗。

1.1.2 主要實驗試劑與儀器：義齒基托樹脂 (批號160508，上海張江生物材料有限公司)，牙脫粉(批號140316，上海張江生物材料有限公司)，戊巴比妥鈉(批號20200422，美國默克公司)，青霉素鈉(批號H13020655，華北制藥股份有限公司)，大鼠FSH、LH、E2ELISA試劑盒(批號202007,上海哈靈生物科技有限公司)，腦立體定位儀(美國Stoelting公司)，電鉆(28505，PROXXONGET日本株式會社)，Neuro Log放大器(Digitimer)，睡眠生物解析系統(tǒng)(日本Biotex公司)，電腦記錄睡眠軟件(日本Biotex公司)，華佗牌 0.3 mm×13 mm一次性使用無菌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，電針治療儀(G6805-1A，上海華誼醫(yī)用儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 建模及分組：采用隨機數(shù)字表法將40只大鼠隨機均分為對照組、模型組、電針組和假電針組，每組各10只。除對照組外，其余各組大鼠采用雙側(cè)卵巢切除的方法構(gòu)建PMI大鼠模型[18-19]。具體方法：戊巴比妥鈉40 μg/g腹腔麻醉，背部手術(shù)區(qū)域剃毛、75%酒精消毒，大鼠脊柱與兩側(cè)髂嵴最高點連線的交點作為標(biāo)記點，向上做2～3 cm的縱行切口，分離皮膚與筋膜，脊柱標(biāo)記點左右各旁開1 cm，鈍性分離腰肌，完整提出卵巢組織并結(jié)扎，切除雙側(cè)卵巢，注意包膜是否完整，常規(guī)縫合后，傷口處以青霉素處理。對照組采用假手術(shù)的方法，摘除卵巢周圍少量脂肪組織，并確保卵巢及包膜保持完整。術(shù)后恢復(fù)3 d，所有大鼠每天行陰道涂片觀察生殖道脫落細(xì)胞，判定動情周期變化。模型組、電針組和假電針組大鼠陰道涂片連續(xù)1周無成熟脫落細(xì)胞，證明手術(shù)成功。對照組術(shù)后出現(xiàn)典型的動情周期變化，證明假手術(shù)成功。四組大鼠手術(shù)后給予無大豆飲食以排除大豆植物雌激素的影響。

1.2.2 大鼠腦電圖記錄電極埋置術(shù)：四組大鼠均行腦電圖記錄電極埋置術(shù)[20]，戊巴比妥鈉40 μg/g腹腔麻醉動物，將大鼠固定于腦立體定位儀上，頭部剪毛，消毒，縱行剪開頭部皮膚，剝離皮下組織，刮除骨膜，充分暴露顱骨，植入腦電圖記錄電極并埋入肌電記錄線。皮層腦電圖電極(采用不銹鋼針)植入左側(cè)頂葉皮層兩點(lambda 前方和側(cè)面各2 mm)，額葉皮層(bregma前方和側(cè)面各2 mm)來記錄前頂葉腦電活動。將2個直徑1 mm的不銹鋼螺絲釘植入顱骨內(nèi)，在額骨正中鉆孔安置接地電極。另一對電極線被附著在頸部肌肉以測量肌電活動。用牙科水泥將電極固定于顱骨上，術(shù)后2 d內(nèi)予以抗生素。大鼠術(shù)后在睡眠生物解析系統(tǒng)內(nèi)恢復(fù)10 d。同時按照12 h/12 h明暗周期飼養(yǎng)(7:00 am至7:00 pm)。

1.2.3 干預(yù)方法：對照組和模型組正常飼養(yǎng)，不予電針干預(yù)。電針組：造模及電極埋置術(shù)后第10天，取雙側(cè)“安眠穴”(EX-HN18) ，安眠穴位于翳風(fēng)與風(fēng)池兩穴連線之中點[21]，取穴定位參照李忠仁主編《實驗針灸學(xué)》，用0.5寸(針身長13 mm)30號毫針斜刺，每天上午8:00～10:00接G6805-Ⅱ型電針儀，連續(xù)波，2 Hz，電壓2 V，強度以大鼠頸部輕微振動、無嘶叫為度，正負(fù)極分別接兩側(cè)“安眠穴”，每天1次，每次20 min，共治療7次。假電針組：按照參考文獻[22]，將針灸針刺入大鼠穴位皮下后連接電針，但不予通電，其余操作同上述電針組方法。

1.2.4 動情周期監(jiān)測：采集陰道分泌物進行涂片，右手持吸有少量0.9%氯化鈉溶液的光滑吸管。將其緩慢沖入陰道內(nèi)沖洗數(shù)次，吸取少量陰道液并緩慢抽出，均勻涂抹于載玻片上，干燥后放入盛有95%乙醇的盒內(nèi)固定，采用巴氏染色法，光鏡下觀察大鼠陰道上皮細(xì)胞的變化情況，用于監(jiān)測大鼠的動情周期。

1.2.5 血清FSH、LH、E2水平檢測：末次電針治療后，深度麻醉大鼠，腹主動脈取血。室溫血液自然凝固10～20 min，離心20 min(2000～3000 r/min)，仔細(xì)收集血清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。應(yīng)用雙抗體夾心法測定，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中大鼠血清FSH、LH、E2水平。

1.2.6 腦電圖記錄與分析：經(jīng)睡眠生物解析系統(tǒng)記錄完成的大鼠腦電(EEG)和肌電(EMG)信號經(jīng)系統(tǒng)放大、濾波、數(shù)模轉(zhuǎn)換后，用軟件實時記錄。EEG/EMG記錄結(jié)束后，運用分析軟件，按統(tǒng)一設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)自動掃描判別出覺醒(Wake)、快速眼動睡眠(REMs)和非快速眼動睡眠(NREMs)。自動掃描完成后，進行人工檢查，綜合判讀腦電與肌電，必要時改正[20]。

1.2.7 大鼠24 h睡眠覺醒時程分析：觀察睡眠覺醒量，分析睡眠覺醒晝夜節(jié)律以及睡眠異常出現(xiàn)的時間。以晝夜24 h為橫坐標(biāo)，以每小時各睡眠覺醒時相的量為縱坐標(biāo)，繪制出24 h時程曲線。

1.2.8 大鼠睡眠覺醒累積量分析：觀察睡眠覺醒量，分析晝夜12 h/12 h各個時相的累積量，如數(shù)據(jù)點集中出現(xiàn)在某一區(qū)段，則計算這一區(qū)段的睡眠覺醒累積量，繪制出直方圖。睡眠覺醒累計量直方圖反應(yīng)的是晝夜12 h/12 h或是某一時間段的睡眠變化。

1.2.9 大鼠不同持續(xù)時間睡眠波出現(xiàn)次數(shù)：觀察睡眠覺醒結(jié)構(gòu)，分析不同時長睡眠片段出現(xiàn)的次數(shù)，考察睡眠狀態(tài)維持的能力。

1.2.10 大鼠睡眠覺醒時相轉(zhuǎn)換次數(shù)：觀察睡眠覺醒結(jié)構(gòu)，分析各睡眠覺醒時相之間的轉(zhuǎn)換次數(shù)，考察睡眠的穩(wěn)定性、中途覺醒等。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠動情周期變化比較 見表1。電針后，與對照組比較，模型組、電針組和假電針組大鼠動情周期紊亂率顯著增高(P<0.05,P<0.01)；與模型組比較，電針組大鼠動情周期紊亂率顯著降低(P<0.05)。

表1 各組大鼠動情周期變化比較

2.2 各組大鼠24 h睡眠覺醒時程比較 見圖1。電針后，與對照組比較，模型組和假電針組大鼠24 h睡眠覺醒晝夜節(jié)律減弱，白天覺醒增多，NREMs減少，尤其在白天的12:00和17:00覺醒增多、11:00和17:00 NREMs減少(P<0.05,P<0.01)。與模型組比較，電針組24 h睡眠覺醒晝夜節(jié)律趨勢接近對照組，白天12:00和17:00覺醒減少、11:00和17:00 NREMs增多(P<0.05,P<0.01)。REMs組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

A：各組大鼠24 h覺醒時間；B：各組大鼠24 h REM睡眠時間；C：各組大鼠24 h NREM睡眠時間。與對照組比較，*P<0.05，△P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，▲P<0.01

2.3 各組大鼠睡眠覺醒累積量比較 見圖2。電針后，與對照組比較，模型組和假電針組大鼠睡眠覺醒累積量在12 h白天和24 h全天覺醒增多、NREMs減少(P<0.01)。與模型組比較，電針組大鼠在12 h白天和24 h全天覺醒減少、NREMs增多(P<0.05,P<0.01)。REMs組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

A：各組大鼠白天、夜間、全天覺醒時間累積量；B：各組大鼠白天、夜間、全天REM睡眠時間累積量；C：各組大鼠白天、夜間、全天NREM睡眠時間累積量。與對照組比較，△P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，▲P<0.01

2.4 各組大鼠不同持續(xù)時間睡眠波出現(xiàn)次數(shù)比較 見圖3。電針后，與對照組比較，模型組和假電針組大鼠NREMs在12 h白天和12 h夜間睡眠片段化明顯，短時程次數(shù)增多、長時程次數(shù)減少，尤其短時程(0～16 s)增多、長時程(64～128 s)減少(P<0.05,P<0.01)。與模型組比較，電針組大鼠在12 h白天和12 h夜間睡眠片段化恢復(fù)，短時程(0～16 s)減少、長時程(64～128 s)增多(P<0.05,P<0.01)。REMs組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

A：各組大鼠白天不同時長NREM睡眠片段發(fā)生次數(shù)；B：各組大鼠夜間不同時長NREM睡眠片段發(fā)生次數(shù)；C：各組大鼠白天不同時長REM睡眠片段出現(xiàn)的次數(shù)；D：各組大鼠夜間不同時長REM睡眠片段出現(xiàn)的次數(shù)。

2.5 各組大鼠睡眠覺醒時相轉(zhuǎn)換次數(shù)比較 見圖4。 電針后，與對照組比較，模型組和假電針組大鼠12 h白天慢波睡眠到覺醒(S-W)之間的轉(zhuǎn)換增多(P<0.05,P<0.01)，與模型組比較，電針組大鼠在12 h白天 S-W之間的轉(zhuǎn)換減少(P<0.05)，睡眠維持穩(wěn)定。12 h白天除S-W之間的轉(zhuǎn)換以及12 h夜間所有時相之間的轉(zhuǎn)換比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

A：各組大鼠白天各睡眠覺醒時相之間的轉(zhuǎn)換次數(shù)；B：各組大鼠夜間各睡眠覺醒時相之間的轉(zhuǎn)換次數(shù)。

2.6 各組大鼠血清FSH、LH、E2水平變化比較 見表2。 電針后，與對照組比較，模型組和假電針組大鼠血清FSH、LH水平升高(P<0.01)、E2水平降低(P<0.01)，電針組大鼠血清FSH升高(P<0.05)、E2水平降低(P<0.01)；與模型組比較，電針組大鼠血清FSH、LH水平降低(P<0.05)、E2水平升高(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清FSH、LH、E2水平變化比較

3 討 論

睡眠是一種高度保守的生命現(xiàn)象，與生物進化、物種繁衍和個體生存發(fā)展等密切相關(guān)。失眠等睡眠問題是婦女圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后的主要主訴，隨著人們對身心健康的逐漸重視，門診中睡眠問題患者越來越多，女性步入絕經(jīng)期后逐漸出現(xiàn)失眠并進展為慢性失眠，嚴(yán)重影響患者的社會功能。該階段是女性一生所必須經(jīng)歷的生理過程，卵巢功能一旦衰竭或被切除和破壞，卵巢分泌的雌激素就會減少。隨著社會的發(fā)展，人們精神壓力增加，卵巢早衰的情況也在增加，睡眠覺醒障礙發(fā)病率升高，失眠即成為圍絕經(jīng)期女性最常見的主訴之一[23-24]。

PMI的發(fā)病因素多樣，且相互關(guān)聯(lián)。此時若不及時醫(yī)治，可導(dǎo)致圍絕經(jīng)期時間延長，患老年病幾率增高，工作效率降低，生活質(zhì)量下降，并增加家庭矛盾，破壞家庭關(guān)系。長期失眠不僅會對患者的正?；顒赢a(chǎn)生很大影響，而且還會降低患者的生理功能并引起一系列并發(fā)癥[25-26]。與睡眠好的絕經(jīng)婦女比較，睡眠差的絕經(jīng)婦女更容易伴發(fā)慢性疾病以及更差的健康狀況，因此有必要為絕經(jīng)相關(guān)失眠癥提供有效的療法。提高圍絕經(jīng)期女性生活質(zhì)量，讓每個圍絕經(jīng)期女性都可以安心健康地過渡到下一個人生階段，非常重要。

中醫(yī)學(xué)中并無“圍絕經(jīng)期失眠”的專屬名詞，但依據(jù)其主要發(fā)病時間和臨床特點，可將之歸屬于“經(jīng)斷前后諸證”“不寐”等范疇。圍絕經(jīng)期失眠因其所處的特殊生理階段，因此與普通失眠又有不同，與“臟躁”“百合病”“郁病”相關(guān)?！秲?nèi)經(jīng)·上古天真論》曰：“七七，任脈虛，太沖脈衰，天癸竭，地道不通，故形壞而無子”，該階段女性天癸將竭，腎氣漸衰，沖任空虛虧損，導(dǎo)致臟腑失于濡養(yǎng)，陰陽失于平衡而失眠。同時，圍絕經(jīng)期失眠，存在精血虧虛、陰血不足的基本病機，而在此基礎(chǔ)上出現(xiàn)心神受擾，神魂不安。綜合圍絕經(jīng)期女性的生理特點，極易發(fā)生失眠。

激素替代療法、催眠藥和精神藥物一直用于圍絕經(jīng)期失眠患者的治療，但這些藥物都有嚴(yán)重的不良反應(yīng)[27]。失眠的認(rèn)知行為療法和睡眠限制療法已開始用于PMI的治療，但臨床運用比較局限。課題組之前評估了針灸治療PMI患者的短期療效[28]，研究表明針刺可以明顯降低PMI患者失眠嚴(yán)重程度(ISI)評分、匹茲堡睡眠質(zhì)量指數(shù)(PSQI)評分，顯著提升睡眠效率和夜晚整體睡眠時間，并顯著降低夜間覺醒時間，尤其可以減少患者淺睡眠時間，針灸在主觀和客觀上促進PMI的臨床相關(guān)改善。另有研究評估了電針對PMI患者睡眠和生活質(zhì)量短期和長期的影響[29]，結(jié)果證實電針治療優(yōu)于假電針治療，是一種更安全、更有效的治療方法，可以改善絕經(jīng)后患者的睡眠質(zhì)量，并具有長期的療效和出色的安全性。

女性進入圍絕經(jīng)期前后，體內(nèi)的卵巢激素也會發(fā)生相應(yīng)的變化，在此階段，卵巢體積變小，卵泡發(fā)育欠佳，雌激素水平降低、孕酮分泌含量生理性地減少，卵巢激素的波動而對睡眠產(chǎn)生影響[30]。本研究采用ELISA法測定大鼠血清FSH、LH、E2水平的變化情況，與對照組比較，模型組大鼠陰道脫落細(xì)胞顯示動情周期紊亂或消失，血清FSH、LH水平升高、E2水平降低。與模型組比較，電針組大鼠血清FSH、LH水平降低、E2水平升高。說明電針可以調(diào)節(jié)PMI大鼠血清性激素水平，調(diào)節(jié)體內(nèi)卵巢激素水平的變化。

實驗研究發(fā)現(xiàn)，去卵巢小鼠不能有效維持覺醒，活動期睡眠量增加，表現(xiàn)出類似絕經(jīng)期白天嗜睡樣睡眠障礙[18]。電針可影響PMI大鼠睡眠時相，延長REMS、SWS1 時間[17]，能增加去卵巢大鼠NREM睡眠時間，減少覺醒時間，改善去卵巢大鼠的睡眠覺醒狀態(tài)[31]。腦電記錄是睡眠研究的必要手段，本實驗研究了電針對去卵巢大鼠睡眠覺醒腦電圖的改變，通過對大鼠睡眠覺醒時程、睡眠覺醒累積量、不同持續(xù)時間睡眠波出現(xiàn)次數(shù)、睡眠覺醒時相轉(zhuǎn)換次數(shù)的分析，說明了電針對PMI大鼠睡眠覺醒量、睡眠結(jié)構(gòu)的改善。研究發(fā)現(xiàn)：模型組大鼠24 h睡眠覺醒時程在白天的覺醒增多、NREMs減少，白天和夜間短時程NREMs出現(xiàn)次數(shù)增多、長時程NREMs出現(xiàn)次數(shù)減少，白天睡眠到覺醒之間的轉(zhuǎn)換增多。嚙齒類大鼠為夜行動物，睡眠問題發(fā)生在白天與人類夜間睡眠相符。電針治療后，電針組大鼠白天的覺醒減少、NREMs增多，白天和夜間短時程NREMs出現(xiàn)次數(shù)減少、長時程增多，白天睡眠到覺醒之間的轉(zhuǎn)換減少。說明電針可以改善圍絕經(jīng)期失眠大鼠的睡眠覺醒狀態(tài)，減少覺醒量，增加睡眠量，對于睡眠結(jié)構(gòu)有顯著影響，可提升睡眠的質(zhì)量，保持睡眠維持能力和穩(wěn)定性。

綜上所述，電針對PMI大鼠睡眠覺醒腦電圖具有積極的改善作用，可減少覺醒時間，增加睡眠時間，改善其睡眠結(jié)構(gòu)，提升睡眠質(zhì)量，我們認(rèn)為電針可以作為治療PMI或卵巢早衰的臨床手段，其機制可能與血清性激素水平有關(guān)。