謝燕

福建省龍巖市食品藥品檢驗檢測中心，福建龍巖 364000

薏苡仁收載于《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》）2020年版一部，來源于禾本科植物薏米Coix lacryma-jobi L.var.ma-yuen（Roman.）Stapf的干燥成熟種仁。新版《中國藥典》與舊版比較，薏苡仁項下只新增了玉米赤霉烯酮的限量檢查，其他無變化，《中國藥典》同時也新增了玉米赤霉烯酮測定法的兩個方法：液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質譜法。藥品檢驗機構在首次使用薏苡仁新標準時，必須進行方法確認，并對分析方法中關鍵的指標進行有選擇性的驗證。驗證的指標有：專屬性、準確度、精密度、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性。實驗室應驗證哪些指標，并沒有一個統(tǒng)一明確的規(guī)定，這就導致實驗室需要自主判斷方法的復雜程度，確定哪些方法學參數(shù)對檢驗結果影響最大。本文以“玉米赤霉烯酮測定法”的第二法為實例，對方法確認的內容進行闡述。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

薏苡仁，采購于普通藥店，樣品信息具體見表1。所有批次樣品粉碎過2號篩備用。

表1 樣品信息

1.1.2 標準品

玉米赤霉烯酮對照溶液（中國食品藥品檢定研究院，批號：610022-202101）。

1.1.3 主要試劑

甲醇、乙腈為色譜純，水為一級水，氯化鈉為分析純；ZearaStar型免疫親和柱（Romer labs），Whatman玻璃微纖維濾紙（cytiva）。

1.1.4 主要儀器

1.2 方法

1.2.1 色譜-質譜條件

1.2.1.2 質譜條件 采用電噴霧離子源（electrospray ion source，ESI），負離子掃描，多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，離子源溫度：500℃，電噴霧電壓：-4500 V，氣簾氣：35.0 psi，離子源氣1：50 psi，離子源氣2：50 psi，碰撞氣：氬氣。組分的質譜分析參數(shù)見表2。

表2 玉米赤霉烯酮的保留時間及質譜分析參數(shù)

1.2.2 溶液的制備

1.2.2.1 對照品貯備溶液 精密量取玉米赤霉烯酮對照溶液1 ml置于100 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得。經(jīng)含量折算后，濃度為101 ng/ml。

1.2.2.2 供試品溶液 取薏苡仁粉末20 g，加氯化鈉4 g，精密加入90%乙腈100ml，勻漿處理2min（13000r/min），離心10 min（4000 r/min），精密量取上清液10 ml，置50 ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，離心10 min，用玻璃纖維濾紙濾過，精密量取續(xù)濾液20 ml通過免疫親和柱，用水10 ml重力自然洗脫，棄去洗脫液，使空氣進入柱子，將水擠出柱子，再用1.5 ml甲醇浸泡柱子約3 min后收集洗脫液，置2 ml量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，取續(xù)濾液即得。

1.2.2.3 空白溶液 除不加供試品外，同供試品溶液操作制備。

1.2.2.4 對照品加標溶液 精密量取玉米赤霉烯酮對照溶液適量加90%乙腈制成0.1 μg/ml的溶液。

2 方法確認的驗證內容與結果

2.1 專屬性（空白試驗）

采用空白溶液來判斷在目標物區(qū)域是否存在干擾。當空白溶液的干擾峰峰面積不高于標準曲線濃度最低點峰面積的一半時，可認為專屬性良好。結果顯示空白溶液在對照品相同保留時間處無干擾峰（圖1）。

圖1 薏苡仁（174.9/317.3）色譜圖

2.2 準確度（加樣回收試驗）

精密稱取薏苡仁（批號：2009004）粉末20 g，精密加入對照品加標溶液20 ml，按照“1.2.2.2”項下方法制備加標樣品溶液，平行制備6份，依法進行測定，計算回收率，具體見表3，結果提示方法的回收率良好。

表3 加標回收試驗結果（n=6）

2.3 精密度

2.3.1 方法精密度（重復性）

取同一批樣品（批號：2009004）按照“2.2”項下方法制備加標樣品溶液，平行制備6份，依法進行測定，計算RSD為3.09%，結果表明方法的精密度良好。

2.3.2 儀器精密度

精密量取同一對照品溶液連續(xù)進樣測定7次，測定峰面積的RSD，結果為1.02%，表明儀器精密度良好。

2.4 檢測限

檢測限可分為兩個部分，儀器檢出限和方法檢出限，驗證的是方法檢出限，本文采用信噪比法進行分析，精密量取“2.2”項下的加標樣品溶液適量，不斷稀釋至被測物質注入超高效液相色譜-質譜儀后的信噪比≥3∶1。結果顯示玉米赤霉烯酮峰的信噪比為7，相應的加標樣品溶液濃度為0.0404 ng/ml，當供試品溶液中藥材含量為0.4 g/ml時，本實驗檢出限為0.1 μg/kg，標準規(guī)定檢出限為1 μg/kg，表明方法靈敏度良好。

2.5 定量限

采用信噪比≥10:1測定定量限時，本實驗定量限為0.3 μg/kg。根據(jù)《中國藥典》的要求，定量限結果應符合準確度和精密度要求，因此要用與0.3 μg/kg這個數(shù)據(jù)含量相近的樣品進行驗證。在進行方法確認時筆者認為無須采用此定量限，在能滿足小于標準規(guī)定的定量限4 μg/kg時同時也滿足獲得的信噪比大于等于10∶1即可。因此本實驗以校準曲線最低點的濃度（1.515 ng/ml）作為定量限（3.8 μg/kg）。

驗證過程：精密稱取薏苡仁（批號：2009004）粉末20 g，精密加入對照品加標溶液0.5 ml，按照“1.2.2.2”項下方法制備加標樣品溶液，平行制備3份，依法測定峰面積，重復測定3次，計算回收率，結果顯示信噪比平均值為508，精密度和準確度結果見表4。

表4 定量限驗證結果（n=9）

2.6 線性關系考察

精密量取對照品貯備溶液，用甲醇稀釋制成濃度為1.515、5.050、10.100、20.200、50.500、75.750 ng/ml的系列對照品溶液。精密吸取上述系列對照品溶液各5 μl，注入超高效液相色譜-質譜儀，測定峰面積，重復測定2次，以峰面積為縱坐標，進樣濃度為橫坐標，繪制標準曲線。結果顯示在1.515~75.750 ng/ml范圍內呈良好的線性關系，具體見圖2。

圖2 薏苡仁（174.9/317.3）線性關系

2.7 樣品測定

取3個批次樣品依法操作，計算供試品的含量（表5）。

表5 樣品中玉米赤霉烯酮的含量測定結果和檢測結果

3 討論

3.1 實驗過程遇到的問題

在供試品溶液的制備過程中，發(fā)現(xiàn)離心并不能使溶液澄清，上清液仍渾濁，通過免疫親和柱時，流速十分緩慢，因此增加了玻璃纖維濾紙過濾這一步驟；其次，每一步洗脫都要等到柱內液體近干時再進行下一步，否則目標物還未被吸附就隨著洗脫液一起被洗脫出去；最后增加甲醇浸泡這一步驟也是為了充分將目標物洗脫出來，提高回收率。

3.2 離子對的選擇

《中國藥典》沒有指定定量離子對，筆者選用了響應值高（174.9/317.3）的作為定量離子對，這是為了提高檢出限，便于定量。

3.3 報告限的使用

在“中藥中有害物質痕量殘留檢測分析質量控制指導原則”（中國食品藥品檢定研究院2015年試行版本）中提到了“報告限”，指的是被作為數(shù)值報告的最低濃度，一般等于或略高于最低校準濃度，可以是“2.5”節(jié)的定量限，也可以是1/10最大殘留限量（maximum residue limit，MRL），只要能滿足風險分析的技術要求，實驗室可以自行擬定。例如薏苡仁標準規(guī)定每1000 g含玉米赤霉烯酮不得過500 μg，本文便以1/10 MRL作為報告限（即50 μg/kg），見表5；將報告限的數(shù)值固定后，就不必每一次都測定檢出限，可以節(jié)約很多的人力和物力。

4 結論

方法確認過程并不是方法驗證的重復過程，而是實驗室在實際檢驗條件下進行的適應性考察，需要充分考慮分析方法的復雜程度以及被測樣品的特點；對于玉米赤霉烯酮測定法這種前處理過程復雜且濃度范圍較大的痕量分析方法，建議對檢測限、定量限、專屬性、準確度、精密度等5個指標進行驗證；對于含量測定這種常量分析方法，建議對準確度、精密度、專屬性進行驗證；而對于鑒別方法來說，建議對專屬性進行驗證。