黃舒婷溫 炬江奕恒秦 思

1.廣東省第二人民醫(yī)院民航院區(qū)門(mén)診部，廣東廣州 510405；2.廣東省第二人民醫(yī)院皮膚性病科，廣東廣州 510317

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是世界上第六大常見(jiàn)癌癥類(lèi)型，每年約有80余萬(wàn)例新增確診患者，死亡率占所有惡性腫瘤的1%～2%，在我國(guó)，每年新增22.5萬(wàn)例，死亡10.3萬(wàn)例。由于HNSCC發(fā)病部位特殊，臨床特征不明顯，往往患者確診時(shí)已處于晚期，而晚期HNSCC常易發(fā)生轉(zhuǎn)移。目前，臨床上對(duì)頭頸部腫瘤的診斷主要依靠影像學(xué)檢查，容易發(fā)生漏診。微小染色體維持蛋白2（minichromosome maintenance protein 2，MCM2）是參與真核細(xì)胞DNA復(fù)制啟始和延長(zhǎng)調(diào)控的關(guān)鍵蛋白，研究發(fā)現(xiàn)其在宮頸癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌等疾病中有重要意義，但在HNSCC中研究甚少。本研究通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)探究MCM2在HNSCC中的表達(dá)，為HNSCC的診斷及治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 MCM2作為差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG）的鑒定

運(yùn)用基因表達(dá)公共（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)下載GSE2379和GSE23036數(shù)據(jù)集，共包含99個(gè)HNSCC樣本和31個(gè)正常樣本，并定義|logFC|＞1且調(diào)整后的P值＜0.05的基因?yàn)镈EG。

1.2 UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析

運(yùn)用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)的UALCAN網(wǎng)站可在線(xiàn)分析多種惡性腫瘤的臨床數(shù)據(jù)，獲取特定基因在不同組織中的表達(dá)情況。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析UALCAN網(wǎng)站的數(shù)據(jù)，使用GraphPad Prism 9.3.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)重新可視化，探討不同因素下正常組織和HNSCC樣本中MCM2的表達(dá)情況及意義。

1.3 TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)免疫分析

腫瘤免疫評(píng)估資源（Tumor Immune Estimation Resource，TIMER）數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)分析不同癌癥類(lèi)型免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的網(wǎng)站，通過(guò)該數(shù)據(jù)庫(kù)分析HNSCC中MCM2與多種免疫細(xì)胞的相關(guān)性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 關(guān)鍵基因的篩選和構(gòu)建蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)

Linked Omics數(shù)據(jù)庫(kù)收集了32種TCGA癌癥類(lèi)型和10種臨床蛋白組學(xué)腫瘤的多組學(xué)數(shù)據(jù)，在該數(shù)據(jù)庫(kù)中利用Pearson檢驗(yàn)分析并篩選出與MCM2密切相關(guān)的前5個(gè)正相關(guān)基因作為關(guān)鍵基因，運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析以上基因的PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 GSCALite數(shù)據(jù)庫(kù)分析

GSCALite數(shù)據(jù)庫(kù)是用于基因表達(dá)、單核苷酸變異，甲基化，通路活性和藥物敏感性等分析的平臺(tái)，使用該數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)MCM2及其相關(guān)關(guān)鍵基因的藥物敏感性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 MCM2在HNSCC中的表達(dá)

數(shù)據(jù)集GSE2379和GSE23036中，MCM2在HNSCC腫瘤組織中的表達(dá)均高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1A）。通過(guò)篩選DEG并繪制火山圖（圖1B），觀(guān)察到MCM2是一個(gè)上調(diào)的DEG，提示MCM2在HNSCC中高表達(dá)并在致癌性中起作用。

圖1 MCM2在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)

2.2 HNSCC患者中不同因素對(duì)MCM2表達(dá)的影響

不同年齡段HNSCC中MCM2的表達(dá)均高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），41～60歲組別MCM2的表達(dá)量最高。不同性別HNSCC中MCM2表達(dá)均高于正常組織，且男性患者高于女性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同腫瘤分級(jí)HNSCC中MCM2表達(dá)均高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。腫瘤分化越差者，MCM2表達(dá)水平越高。不同臨床分期HNSCC中MCM2表達(dá)均高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而不同臨床分期HNSCC 的MCM2表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同分級(jí)淋巴轉(zhuǎn)移的HNSCC中MCM2表達(dá)高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但MCM2的表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移程度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染與否的HNSCC中MCM2表達(dá)均高于正常組織，且HPV陽(yáng)性患者M(jìn)CM2表達(dá)高于HPV陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

圖2 UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中的MCM2表達(dá)量比較

2.3 HNSCC中MCM2的表達(dá)與免疫細(xì)胞的關(guān)系

TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，HNSCC中MCM2與B細(xì)胞、CD8T細(xì)胞、CD4T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的浸潤(rùn)水平均成正相關(guān)（P＜0.05）（圖3）。

圖3 MCM2與常見(jiàn)免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析

2.4 HNSCC中關(guān)鍵基因的共表達(dá)分析

Linked Omics數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出與MCM2顯著正相關(guān)的前5個(gè)基因作為關(guān)鍵基因，包括微小染色體維持蛋白6（minichromosome maintenance complex component 6，MCM6）、微小染色體維持蛋白5（minichromosome maintenance complex component 5，MCM5）、無(wú)齒E3泛素蛋白連接酶同源物（Denticleless E3 ubiquitin protein ligase homolog，DTL）、晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)蛋白（timeless circadian regulator，TIMELESS）和DNA聚合酶θ （DNA polymerase theta，POLQ）。利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析（圖4）。

圖4 MCM2的共表達(dá)基因

2.5 MCM2對(duì)癌癥相關(guān)調(diào)節(jié)藥物的影響

通過(guò)分析6個(gè)關(guān)鍵基因的藥物相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)MCM2對(duì)曲美替尼、司美替尼和RDEA119等藥物耐受，對(duì)NPK76-II-72-1、Navitoclax、GSK1070916和I-BET-762等分子類(lèi)藥物敏感（圖5）。

圖5 關(guān)鍵基因與藥物的相關(guān)性

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)多數(shù)據(jù)集分析顯示，HNSCC中MCM2的表達(dá)較正常組織異常增高，且在不同年齡組別、性別、腫瘤分級(jí)、臨床分期和有無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移情況的HNSCC中MCM2均顯著升高。蔡開(kāi)貴等通過(guò)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)MCM2的表達(dá)與人喉鱗狀細(xì)胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）的病理分級(jí)、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成正相關(guān)。但也有研究發(fā)現(xiàn)與早期LSCC相比，晚期喉癌患者M(jìn)CM2的表達(dá)水平顯著降低。本研究提示HNSCC中MCM2的異常表達(dá)與HPV感染情況有關(guān)聯(lián)，王鯤鵬等研究發(fā)現(xiàn)MCM2可能是HPV陽(yáng)性HNSCC診斷及預(yù)后的標(biāo)志物。以上結(jié)果表明，MCM2異常表達(dá)與HNSCC疾病的嚴(yán)重程度和癌癥進(jìn)程有關(guān)。

不同類(lèi)型的免疫浸潤(rùn)細(xì)胞可通過(guò)直接或間接相互作用調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，然而，MCM2與HNSCC腫瘤免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的關(guān)系至今尚無(wú)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)MCM2與多種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)水平密切相關(guān)，提示MCM2調(diào)控頭頸部鱗癌患者的免疫狀態(tài)，影響腫瘤的進(jìn)展。此外，MCM2是口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）患者生存率下降的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Kodani等發(fā)現(xiàn)中分化OSCC具有更高的MCM2標(biāo)記指數(shù)，與患者的預(yù)后相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)MCM2可被多種藥物抑制，考慮MCM2是治療HNSCC的潛在治療靶點(diǎn)。Ahmadinejad等研究表明抗凋亡蛋白抑制劑（Navitoclax）可干擾抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之間的相互作用，激活后者誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。聯(lián)合Navitoclax治療較單用順鉑治療，能有效防止HNSCC的復(fù)發(fā)。GSK1070916為極光激酶B/C抑制劑，靶向作用于有絲分裂突變信號(hào)通路，可消除轉(zhuǎn)移的慢性粒細(xì)胞白血病和急性髓性白血病而不損傷卵巢組織，防止白血病的復(fù)發(fā)。I-BET-762是一種新的溴域抑制劑，可逆地靶向作用于溴結(jié)構(gòu)域和超末端結(jié)構(gòu)域（bromodomain and extra terminal domain，BET）蛋白，削弱其與組蛋白上的乙酰化賴(lài)氨酸結(jié)合的能力，阻斷下游轉(zhuǎn)錄。Zhang等發(fā)現(xiàn)I-BET-762可延遲乳腺癌和肺癌臨床發(fā)病前期的腫瘤發(fā)展，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯，在癌癥的預(yù)防治療上有廣闊的應(yīng)用前景。NPK76-II-72-1目前尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道，且GSK1070916和I-BET-762在HNSCC的相關(guān)文獻(xiàn)中均無(wú)研究，是未來(lái)研究HNSCC治療靶點(diǎn)的新方向。

綜上所述，頭頸部腫瘤病灶部位和病理類(lèi)型多，解剖關(guān)系復(fù)雜，生物靶點(diǎn)為其臨床診斷和靶向免疫治療提供了新思路。本研究提示MCM2是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌潛在的腫瘤標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。