王 騫，包慧芳，丁榮榮，史應(yīng)武，楊紅梅，楚 敏，王 寧*

（1.新疆維吾爾自治區(qū)土壤肥料工作站，烏魯木齊 830006；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第七師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆 奎屯 833200）

引言

生物防治是在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中形成的一種科學(xué)治理方式，微生物源生物農(nóng)藥是防治作物病蟲草害行之有效的方法之一?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subiltis）具有繁殖快、所需營養(yǎng)簡單，耐受性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)，其易于形成芽孢的特點(diǎn)在生產(chǎn)過程中利于生防菌劑的制備、劑型加工及保存[1]。因此，作為生物農(nóng)藥的重要資源，受到越來越多的關(guān)注與開發(fā)。隨著分子測序技術(shù)的發(fā)展，明確菌株基因組序列信息對(duì)揭示其生防潛力具有重要意義?？莶菅挎邨U菌可通過營養(yǎng)競爭、分泌抗菌物質(zhì)、誘導(dǎo)抗性等機(jī)制發(fā)揮生防作用，但能否在作物根際有效定殖是其發(fā)揮作用的首要條件，通常生防菌群體定殖數(shù)量高低與其防效好壞呈正相關(guān)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，生防細(xì)菌在植物根際土壤中主要以生物膜的形態(tài)附著在土壤粒子表面或植物根系表面。生物膜的形成可增強(qiáng)微生物對(duì)外界環(huán)境的耐受性，使細(xì)菌群體數(shù)量以群聚的形式維持在較高水平，利于有效占據(jù)保護(hù)植物根系的侵染位點(diǎn)，達(dá)到保障營養(yǎng)競爭和空間競爭的群體數(shù)量，同時(shí)還和其它生防機(jī)制協(xié)同作用，降低病蟲草害的發(fā)生，最終達(dá)到促進(jìn)植物健康生長的目的[3]。所以，生防細(xì)菌生物膜形成的研究將為生防菌株的遺傳改良及其合理使用提供科學(xué)依據(jù)和遺傳信息。瓜列當(dāng)又稱分枝列當(dāng)（Orobanche acgyptiaca Pers.），是列當(dāng)科一年生全寄生性植物，對(duì)新疆甜瓜、番茄、辣椒等經(jīng)濟(jì)作物危害嚴(yán)重。本研究前期對(duì)一株源自新疆番茄田的枯草芽孢桿菌DNKAS進(jìn)行抗瓜列當(dāng)?shù)姆佬?yàn)證，小區(qū)實(shí)驗(yàn)表明菌劑添加量為3.2 kg/畝時(shí)，防治效果可達(dá)52.33%，番茄增產(chǎn)56.48%[4]。本研究主要從基因組信息角度揭示DNKAS菌株的生防機(jī)理。本實(shí)驗(yàn)利用全基因組測序技術(shù)對(duì)菌株DNKAS基因組進(jìn)行功能注釋與比較基因組分析，獲得該菌株基因組基本特征。重點(diǎn)比對(duì)分析該菌株群體感應(yīng)與生物膜形成相關(guān)基因的組成和差異，為深入研究其定殖特性，揭示其防控瓜列當(dāng)草害的防效作用機(jī)制積累了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

枯草芽孢桿菌DNKAS（B.subtilis DNKAS），由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所保藏，分離自新疆加工番茄農(nóng)田。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌種保存、活化及擴(kuò)增培養(yǎng)基均為營養(yǎng)肉湯（NB）和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA），購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 試劑與試劑盒

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（Tiangen）、DL2000（Takara）、瓊脂糖（Takara）、50×TAE buffer（Takara）和GelGreen核酸染料（Biotium），用于DNKAS菌株基因組DNA提取和檢測。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取與檢測

菌株活化后無菌接種于NB培養(yǎng)基中，在37℃、180 r/min條件下培養(yǎng)16 h，將發(fā)酵液8 000 g離心10 min收集菌體，使用基因組提取試劑盒提取DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA樣品的濃度和降解程度，NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測樣品純凈度。

1.2.2 基因組測序與基因功能注釋

將檢測合格的基因組DNA委托青島華大基因研究院運(yùn)用BGISEQ-50平臺(tái)測序，SOAPdenovo組裝軟件對(duì)reads數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，得到的scaffold序列使用BLAST軟件與KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）、GO（Gene Ontology）、NR（Non-Redundant Protein Database）、COG（Cluster of Orthologous Groups of proteins）、SwissProt（UniProtKB/Swiss-Prot）、NOG(evolutionary genealogy of genes:Non-supervised Orthologous Groups)等6個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對(duì)分析，完成基因功能注釋[5]。

1.2.3 同源基因組學(xué)分析

基于NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)完成全基因組序列比對(duì)，找出與DNKAS序列相似度99%以上的菌株信息。將DNKAS菌株基因組序列與相關(guān)參考菌進(jìn)行比較分析，統(tǒng)計(jì)其同源基因基本特征。運(yùn)用OrthoMCL軟件，選擇perl腳本分析特有和共有基因，單拷貝直系同源基因運(yùn)用single-copy orthologs進(jìn)行鑒定。系統(tǒng)進(jìn)化樹利用TreeBeST軟件構(gòu)建[6]，設(shè)置自展1 000次的置信值，5%的序列差異。

1.2.4菌株生物膜形成相關(guān)基因分析

根據(jù)全基因組進(jìn)化分析結(jié)果，選取與DNKAS菌株親緣關(guān)系最近的8株B.subtilis與相對(duì)較遠(yuǎn)的1株B.thuringiensis。使用Diamond(v0.8.23.85)軟件[7]與KEGG(v87)[8]數(shù)據(jù)庫比對(duì)，確定生物被膜相關(guān)的基因，并根據(jù)基因信息確定其位置信息。通過blast比對(duì)查看生物被膜基因序列同源性，與選取的參考菌株的相應(yīng)蛋白序列基因進(jìn)行比對(duì)和同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組數(shù)據(jù)組裝與基因預(yù)測

測序得到的DNKAS菌株原始reads數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控、質(zhì)量評(píng)估和組裝后共得到24個(gè)基因組重疊群(contig)，基因組總長度為4 248 244 bp，組成19個(gè)基因組框架(scaffold)，GC含量為43.42%。DNKAS基因組序列已經(jīng)提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得全基因組注冊(cè)號(hào)JABUOT000000000。DNKAS菌株基因組總長度為4 248 244 bp，預(yù)估可編碼4 359個(gè)基因，占全基因組的88.88%，編碼基因平均長度是866.19 bp，獲得序列中包括69個(gè)tRNA，4個(gè)rRNA和49個(gè)sRNA基因。含有串聯(lián)重復(fù)序列（TR序列）68個(gè)，其中微衛(wèi)星DNA（Microsatellite DNA）1個(gè)，小衛(wèi)星DNA（MinisatelliteDNA）47個(gè)。

2.2 枯草芽孢桿菌DNKAS功能注釋

采用本地BLASTP的方法對(duì)DNKAS進(jìn)行COG功能注釋，在DNKAS基因組中共有3 796個(gè)基因被成功注釋。通過聚類分析，發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)功能主要集中在8個(gè)方面，包括：一般性功能預(yù)測基因（389個(gè))、氨基酸代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)基因（328個(gè)）、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因（327個(gè)）、轉(zhuǎn)錄基因（327個(gè)）、細(xì)胞壁/膜/包膜生物發(fā)生基因（242個(gè)）、翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成基因（231個(gè)）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制基因（212個(gè)）、輔酶的運(yùn)輸和代謝基因（199個(gè)）、無機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因（197個(gè)），各基因的功能注釋占COG數(shù)據(jù)庫功能注釋總基因數(shù)的百分比依次為10.2%、8.6%、8.6%、8.6%、6.4%、6.1%、5.6%、5.2%、5.2%、5.1%、4.6%。功能未知基因有239個(gè)，占比6.3%。氨基酸代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝占比較高，這可能說明該菌株可廣泛利用環(huán)境中營養(yǎng)，即環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，該特征是優(yōu)良生防菌具備的特征之一。

在KEGG數(shù)據(jù)庫中，枯草芽孢桿菌DNKAS共有2 775個(gè)基因得到功能注釋，可以分成30個(gè)亞分類圖，關(guān)于菌株膜運(yùn)輸和碳水化合物代謝功能的基因得到較多的注釋。利用注釋的功能基因構(gòu)建代謝通路圖，最終獲得159個(gè)代謝通路。GO數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)共有5 793個(gè)基因得到功能注釋，主要注釋為生物過程、細(xì)胞成分和分子功能3部分，具體的注釋基因數(shù)量結(jié)果見圖1。NR即非冗余的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，經(jīng)過比對(duì)，在NR數(shù)據(jù)庫中DNKAS基因組有3 924個(gè)基因得到注釋。Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫主要對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行注釋，擁有較高的可靠性，DNKAS基因組中有3 924個(gè)基因的蛋白序列在該數(shù)據(jù)庫中得到功能注釋。

圖1 枯草芽孢桿菌DNKAS基因組GO功能分類

2.3 同源基因組分析

經(jīng)NCBI比對(duì)，與DNKAS全基因組序列同源性97%以上菌株有289株，高度相似即同源性99%以上菌株有8株，選取這8株菌與DNKAS進(jìn)行同源性比較，ATCC10792為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis），為B.subtilis同屬不同種的菌株，是本研究選取的基因組外群，基本情況見表1。維恩圖（圖2）表明包括DNKAS在內(nèi)的9株枯草芽孢桿菌共有2 400個(gè)同源基因，其中同源基因家族數(shù)量為1 354個(gè)。依據(jù)這10個(gè)菌株全基因組同源基因分析數(shù)據(jù)，進(jìn)行直系同源單拷貝基因多序列比對(duì)，基于TreeBeST軟件構(gòu)建進(jìn)化樹（圖3），結(jié)果顯示9株B.subtilis與B.thuringiensis形成明顯分枝，DNKAS與NCD-2、UD1022遺傳距離更近，與ZD01、BSD-2、HJ5、BAB-1、SX01705、XF-1遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)。

表1 基因組基本情況

圖2 DNKAS菌株與其它芽孢桿菌的同源性比較

圖3 進(jìn)化樹分析

2.4 基因功能注釋生物被膜相關(guān)基因比較

利用Diamond(v0.8.23.85)軟件將DNKAS菌株的蛋白序列在KEGG(v87)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，找到與生物被膜相關(guān)的基因，隨后根據(jù)基因信息找到重疊群的信息，DNKAS菌株生物膜形成相關(guān)基因的具體定位信息見表2，共有26個(gè)生物膜形成基因，行使20種功能，分布于7個(gè)contig中，其中38.5%的基因位于contig27中，19.2%的基因位于contig24。選取XF-1、NCD-2這兩株與DNKAS遺傳距離存在差異的菌株基因組進(jìn)行生物膜形成相關(guān)基因的同源性比較，兩兩比較結(jié)果與進(jìn)化樹結(jié)果相似，即DNKAS的生物膜功能基因與NCD-2的基因同源性更高，見表3，只在PTS-Glc-EIIA，crr基因存在差異，NCD-2J菌株缺少DNKAS位于contig25的相同基因。

表2 DNKAS菌株生物膜形成相關(guān)基因

表3 菌株間生物膜形成基因的同源性比對(duì)

3 討 論

化學(xué)除草劑在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的高產(chǎn)豐收中起到十分重要的作用，但長期大劑量連續(xù)噴施產(chǎn)生了諸多問題。目前，利用微生物防除列當(dāng)雜草的研究日益增多。已報(bào)道的具有防除列當(dāng)潛能的微生物主要是列當(dāng)病原菌、寄主植物共生菌或其他微生物，包括鐮刀菌[9]、根瘤菌[10]、假單胞菌[11]和叢枝菌根真菌[12]等。Nemat Alla等利用盆栽試驗(yàn)證明尖孢鐮刀菌FoxyⅠ和FoxyⅡ的孢子懸浮液對(duì)鋸齒列當(dāng)和分枝列當(dāng)有顯著防效，將兩種菌的劑型加工為固態(tài)顆粒也有相同效果[13]。Mabrouk等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)接種根瘤菌P.1236和P.SOM可顯著降低豌豆根部鋸齒列當(dāng)?shù)拿劝l(fā)率，增加列當(dāng)塊莖的壞死率[14]?？莶菅堪麠U菌（B.subtils）菌株DNKAS作為一種高效生防菌株，已完成列當(dāng)防除的田間實(shí)驗(yàn)。DNKAS菌株綠色環(huán)保，對(duì)人畜無毒無害，具有較高的生防潛力，有待進(jìn)一步防效驗(yàn)證。

本次參與比對(duì)的菌株多作為益生菌進(jìn)行過報(bào)道。UD1022是美國特拉華大學(xué)報(bào)道的一株根際促生細(xì)菌[15]，NCD-2、BAB-1、BSD-2、XF-1為河北農(nóng)林科學(xué)院、河北工業(yè)大學(xué)、云南農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)的生防菌，主要用于棉花黃萎病、番茄灰霉病、十字花科根腫病等的防治[16-19]。與DNKAS全基因組進(jìn)化分析親緣關(guān)系最近的NCD-2、UD1022均是定殖能力強(qiáng)的菌株，因此DNKAS可有效發(fā)揮生防作用，推測也與其易于定殖有關(guān)。通過基因組基本特征的統(tǒng)計(jì)，DNKAS菌株編碼4 217個(gè)基因，數(shù)目最多，通過后續(xù)基因注釋可繼續(xù)深入挖掘其生防機(jī)理。

對(duì)生防微生物全基因組序列進(jìn)行比較和同源基因分析是獲取其功能相關(guān)核心基因的常用方法。高圣風(fēng)將胡椒瘟病生防菌B.subtilsVD18R19與B.Subtilis 168、B.subtilisW23、B.velezensisFZB42進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)4個(gè)菌株共有基因2 745個(gè)，特有基因1 055。生防菌VD18R19的特有基因?yàn)?97個(gè)，含有6個(gè)抑菌代謝產(chǎn)物編碼基因簇，與模式菌株168具有極高的同源性[20]。王曉宇在對(duì)B.subtils BS-916的全基因組測序分析發(fā)現(xiàn)，與其它已測序全基因組芽孢桿菌相比，其GC含量最高，達(dá)到46.4%，含有多種典型的抗菌物質(zhì)編碼基因簇[21]。隨著測序菌株數(shù)量及測序深度的不斷提高，獲得的基因資源在不斷積累，從菌株共有基因中獲取的關(guān)鍵基因數(shù)量也在不斷增多，通過同源基因比較可深入挖掘與生物性狀相關(guān)的關(guān)鍵基因位點(diǎn)。

生物膜是細(xì)菌生長過程中為適應(yīng)周圍環(huán)境，而分泌的胞外聚合物，具有一定三維結(jié)構(gòu)，使微生物群體能附著于固體或生物表面[22]。oxyR是細(xì)菌抗氧化系統(tǒng)OxyR調(diào)節(jié)蛋白的編碼基因，oxyR調(diào)節(jié)子可抑制細(xì)菌外膜蛋白相變，增強(qiáng)菌株抗逆性。SinR是Spo0A-P的主要調(diào)節(jié)子編碼基因，受其調(diào)控的Spo0A基因起到中央轉(zhuǎn)錄監(jiān)管作用，控制著包括生物膜基質(zhì)所必需的基因表達(dá)在內(nèi)的100多個(gè)基因的表達(dá)。SlrR基因表達(dá)水平的高低調(diào)控SlrR-SinR開關(guān)，介導(dǎo)抑制自溶素產(chǎn)生，決定著維持生物膜中細(xì)胞鏈結(jié)構(gòu)的完整性。DNKAS菌株的這些基因與NCD-2相似性一致，二者僅在PTS-Glc-EIIA蛋白組分存在差異，DNKAS菌株具有2個(gè)，而NCD-2只有1個(gè)該基因。PTS-Glc-EIIA是由crr基因編碼的PTS系統(tǒng)葡萄糖特異性EIIA組分，是依賴于磷酸烯醇丙酮酸的糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，與糖類物質(zhì)在細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)攝入有關(guān)，因此菌株間對(duì)碳水化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)能力可能存在差異。

4 結(jié) 論

定殖能力是芽孢桿菌發(fā)揮其生防功能的重要前提，對(duì)其生物膜形成分子機(jī)制的解讀是研究生防作用的關(guān)鍵所在，全基因組測序及比較基因組分析是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的有力工具。本研究對(duì)菌株DNKAS進(jìn)行全基因組測序和比較分析，為枯草芽孢桿菌的功能基因組學(xué)研究提供了參考數(shù)據(jù)，為深入研究其定殖特性和作用機(jī)制，以更有效地開發(fā)和應(yīng)用芽孢桿菌除草劑提供依據(jù)。