毛林軍，瑪依拉，杜鵬程，雷 熙，齊·阿拉達(dá)爾，彭新榮*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究所，烏魯木齊 830011）

成纖維細(xì)胞生長因子（Fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs）是具有多種生物活性的多肽生長因子。在脊椎動物發(fā)育過程中，F(xiàn)GF信號在各種進(jìn)程的調(diào)節(jié)都表達(dá)和參與。FGFs通常很小，大約17～35 kDa，是一種分泌型的高度堿性蛋白質(zhì)[1]。在哺乳動物的發(fā)育系統(tǒng)中有22個FGF成員根據(jù)其序列同源性和生化特性分為7個亞家族。成纖維生長因子5（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF5）屬于一種調(diào)控毛發(fā)生長周期的調(diào)控因子，誘導(dǎo)生長期的毛囊進(jìn)入退行期，F(xiàn)GF5轉(zhuǎn)基因突變小鼠的被毛長度比野生型明顯增長[2，3]，F(xiàn)GF5基因刪除綿羊羊毛長度明顯增加。通過對FGF5基因編輯綿羊表型數(shù)據(jù)的采集，整理和分析，其后代細(xì)毛長度和產(chǎn)量分別比野生型提高18.8%和30.3%。精液冷凍對畜牧業(yè)生產(chǎn)至關(guān)重要，利用精液冷凍技術(shù)將這些稀有和珍貴的品種以及品種優(yōu)良的個體進(jìn)行精液冷凍，并且能夠促進(jìn)動物遺傳資源的長期保存和加速遺傳多樣性的傳播；FGF5基因編輯綿羊的精液冷凍保存不僅可以將優(yōu)秀的品種和基因資源進(jìn)行長期保存，而且能有效減少基因編輯綿羊的存欄數(shù)，優(yōu)化種質(zhì)資源的配置。為長期保存基因編輯綿羊種資源提供理論依據(jù)和技術(shù)幫助，從而提高良好的推廣價值和經(jīng)濟(jì)效益。精子的冷凍保存技術(shù)不僅可以大大減少必須保存的動物數(shù)量，更有效地存檔基因改造品系，并便于與其他實驗室交換品系，從而提高動物福利和成本效益；還可以將優(yōu)良的種質(zhì)資源進(jìn)行長期保存，并能夠使遺傳優(yōu)勢品種得以廣泛傳播；同時也有助于在日常生活中推廣人工受精，增加經(jīng)濟(jì)效益。精液冷凍保存可使因年老、疾病、殘疾而被淘汰或死亡的優(yōu)良品種仍然可以繁衍后代[4]。BSA是牛血清中的一種球狀蛋白，是牛血清的主要成分，能與小分子物質(zhì)及多種陰、陽離子結(jié)合，能為血液起到營養(yǎng)、載體蛋白、p H緩沖及維持滲透壓等作用[5，6]；在精液中，BSA與精子質(zhì)膜中的磷脂相互作用，減小在精液冷凍保存過程中精子的損傷程度[7]，可通過吸附和清理細(xì)胞膜外的離子及小分子物質(zhì)，保持精子膜內(nèi)外的滲透壓平衡，減少精液在稀釋、冷凍過程中對精子質(zhì)膜的損傷，有效保護(hù)精子的質(zhì)膜，提高精液冷凍保存效果[8]。BSA還可作為營養(yǎng)物質(zhì)，在冷凍保存過程中給精子提供能量和運(yùn)動等生理功能。本試驗在常規(guī)精液冷凍保護(hù)中添加不同濃度的BSA，以期提高FGF5基因編輯綿羊精液冷凍效率。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本實驗以新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究中心所屬中澳綿羊育種研究所（綿羊繁殖實驗基地）課題組成功構(gòu)建的成年3只FGF5基因編輯綿羊為研究對象。

1.2 試驗材料

精子全自動分析儀（南寧松景天倫生物科技有公司）、精子質(zhì)膜完整性雙重性熒光染色試劑盒（上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司）、精子頂體形態(tài)花生凝集素?zé)晒馊旧噭┖校ㄉ虾＝苊阑蜥t(yī)藥科技有限公司）等。

1.3 試驗方法

1.3.1 精液的采集

選擇一只個體大小與采精公羊相似，發(fā)情明顯、性情溫順的母羊作為臺羊，牽至采精場地保定好。將采精公羊趕到采精場外的欄里，把采精場地門打開讓采精的公羊自己進(jìn)入采精場地，防止采精公羊受驚或應(yīng)激，不要用力拉拽進(jìn)去。為了讓公羊的性欲更旺盛和精液不受污染，采精公羊進(jìn)入場地后不要讓其立刻去爬胯母羊，將包皮周圍的毛用毛巾擦拭清理干凈[9，10]，再讓其自行爬胯臺羊。采精人員右手持安裝好集精杯的假陰道身體蹲于臺羊的右后側(cè)，假陰道前端呈三角形的內(nèi)膠胎低于后端裝好的集精杯，假陰道與地面呈40～45度的角靠近臺羊的臀部，當(dāng)公羊爬胯到臺羊的背上伸出陰莖時，采精人員用左手及時托住陰莖包皮，將陰莖輕輕導(dǎo)入假陰道內(nèi)，陰莖在假陰道內(nèi)抽搐幾下后，公羊的后軀急速向前猛力一沖，并弓腰后，射精完成[11，12]。綿羊的受精過程只有幾秒鐘，采精人員需集中精力。公羊從母羊身上跳落下來時，采精人員順著公羊的動作取下假陰道，取下集精杯，將剛采下的精液送至實驗室進(jìn)行處理。

1.3.2冷凍液配方

1.3.3 稀釋比例

本實驗采用兩次稀釋法，采集精液后要迅速進(jìn)行稀釋，每次稀釋都在等溫的條件下添加A液和B液。稀釋比例：各組的A液與精液的稀釋比例為1∶1或按照精子的密度大小和直線前進(jìn)的活力將稀釋倍數(shù)至1∶2，B液的稀釋量為鮮精與A液稀釋后相等的量比例為1∶1。將各個冷凍液按照配方精確稱量，加入雙蒸水進(jìn)行溶解，之后加入不同濃度的BSA，混勻后過濾分裝，保存于-20℃?zhèn)溆?。使用時將冷凍液放于37℃水浴鍋中解凍融化，與采集后的鮮精等溫稀釋混合[13]。

1.3.4 BSA對FGF5基因編輯綿羊常溫保存效果的影響

將采集的精液放于含不同濃度（0%、0.2%、0.5%、1%）的BSA精液冷凍保護(hù)劑中，于常溫（18℃～20℃）保存，每隔6 h檢測精子的活率，查看不同濃度的BSA對FGF5基因編輯綿羊精液保存時間的影響。

1.3.5 FGF5基因編輯綿羊的精液冷凍程序

1.3.5.1 精液平衡 本試驗采用二次平衡法，第一次平衡，將剛采集來的新鮮精液在顯微鏡下（×400倍）觀察精子的密度、活率、精子直線前進(jìn)的活力，并記錄，然后添加與精液量同等或2倍不含甘油各組的A液，輕輕搖晃，將標(biāo)簽貼在A液稀釋后的15 mL的離心管蓋上做好標(biāo)記，各組稀釋后的精液均置于室溫10 min待溫度降至自然溫度后，用6～8層紗布將其包裹[14，15]，移至4℃冰箱平衡，時間均為2 h，對平衡后的精液進(jìn)行活率檢測，做好記錄。第二次平衡，將各組第一次稀釋平衡后的FGF5基因編輯綿羊精液在冰箱里添加與A液和精液稀釋后等量的含甘油的各組B液，輕搖混合后再放置4℃冰箱平衡2 h。對平衡后的精子活率進(jìn)行檢測，做好記錄。精液平衡完后，將精液吸入0.25 mL細(xì)精管內(nèi)分裝好，將細(xì)精管平放于自制的鐵架上，再將鐵架緩慢放進(jìn)提前準(zhǔn)備好溫度-125℃的泡沫箱里進(jìn)行熏蒸，細(xì)精管與液氮面的距離在保持3 mL，熏蒸8 min，熏蒸完畢后將細(xì)精管投入液氮中進(jìn)行冷凍；在泡沫箱里將細(xì)精管裝入標(biāo)記好的凍存管里放入紗布袋子放進(jìn)液氮罐里保存[16，17]。用紗布膠帶做好凍存時間、羊號等信息。凍精過程要嚴(yán)格把控溫度。

1.3.5.2 解凍 用鑷子從液氮罐中取出凍存的FGF5編輯綿羊的細(xì)精管，在空氣中輕晃動8～10 s，置于38～40℃水浴中輕搖晃動解凍15～30 s，拿出用酒精棉球?qū)⒓?xì)管擦拭，擦干后用消過毒的剪刀將其剪開置于1.5 mL的EP管里，然后剪斷細(xì)精管的另一頭，將精液自然流進(jìn)EP管里，然后對精液進(jìn)行品質(zhì)檢測[18]。

1.3.6 精液品質(zhì)的檢測

1.3.6.1 活率檢測 采用伊紅-苯胺黑染色法檢測常溫保存時的活率[19]。觀察精子的染色情況，未著色的精子為白色即為活精，著色的精子即呈紅色為死精，背景呈紫紅色。利用邁朗精子全自動分析系統(tǒng)對冷凍后的精子進(jìn)行基礎(chǔ)指標(biāo)檢測。每個樣本在顯微鏡（×400倍）鏡下觀察5個視野，每次計數(shù)200個精子，記錄未著色（活精）的精子數(shù)量，計算未著色的精子占200個精子的百分比，即精子活率=未著色的精子數(shù)/總精子數(shù)×100%。

1.3.6.2 畸形率檢測 本實驗采用的是姬姆薩染色法檢測精子的畸形率[20]。置于顯微鏡下放大400倍觀察精子形態(tài)，數(shù)不同視野下200個精子，計算精子的畸形率：畸形率=（精子畸形數(shù)/200）×100%。

1.3.6.3 精子的質(zhì)膜完整性檢測 采用精子質(zhì)膜完整性雙重性熒光染色法[21]，按試劑盒的說明進(jìn)行試驗檢測，具體操作如下：

（1）取1 mL解凍后的FGF5基因編輯綿羊精液放于1.5 mL的離心管中；

（2）將有精液的離心管放于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min；

（3）取出離心管于微孔板迷你離心機(jī)離心5 min，600 g；

（4）小心抽取上清液棄掉；

（5）離心管內(nèi)加入1 mL GENMED保存液（Reagent A），混勻顆粒群；

（6）吸取100 μL精子于新的1.5 mL的離心管力；

（7）加入10 μLGENMED染色液A（Reagent B），混勻；

（8）37℃培養(yǎng)箱孵育10 min，避免光照；

（9）取出離心管向內(nèi)小心加入5 μLGENMED染色液B（Reagent C），混勻；

（10）37℃培養(yǎng)箱孵育10 min，避免光照。

（11）吸取50 μL到載玻片上，蓋上蓋玻片，鏡下觀察。

每次隨機(jī)選擇5個視野，每個視野中精子計數(shù)在200個。綠色熒光GENMED染色液A激發(fā)波長490 nm，散發(fā)波長520 nm。紅色熒光GENMED染色液B激發(fā)波長488 nm，散發(fā)波長630 nm。鏡下觀察染色結(jié)果，整個精子頭部呈現(xiàn)明亮綠色熒光說明質(zhì)膜完整，整個或部分精子頭部呈現(xiàn)紅色熒光說明質(zhì)膜完全損傷，整個精子頭部呈現(xiàn)橘黃色熒光說明質(zhì)膜損傷。置于顯微鏡下放大400倍觀察精子形態(tài)，數(shù)不同視野下200個精子。質(zhì)膜完整率=（總精子數(shù)-質(zhì)膜不完整精子數(shù)）／200×100。

1.3.6.4精子頂體完整性檢測 采用精子頂體形態(tài)花生凝集素?zé)晒馊旧╗22]。按試劑盒的說明進(jìn)行試驗檢測，具體操作如下：

（1）取1 mL解凍后的FGF5基因編輯綿羊精液放于1.5 mL的離心管中；

（2）將有精液的離心管放于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min；

（3）取出離心管于微孔板迷你離心機(jī)離心5 min，600 g；

（4）小心抽取上清液棄掉；

（5）離心管內(nèi)加入1 mLGENMED保存液（Reagent A），混勻顆粒群；

（6）吸取100 μL精子于新的1.5 mL的離心管內(nèi)；

（7）加入10 μLGENMED染色液A（Reagent B），混勻；

（8）室溫孵育5 min，避免光照；

（9）取出離心管于微孔板迷你離心機(jī)離心5 min，600 g；

（10）小心抽取上清液棄掉；

（11）加入500 μLGENMED清理液（Reagent C），混勻顆粒群；

（12）取出離心管于微孔板迷你離心機(jī)離心5 min，600 g；

（13）小心抽取上清液棄掉；

（14）重復(fù)（11）-（13）一次；

（15）向離心管內(nèi)加入100 μLGENMED保存液（Reagent A），混勻顆粒群；

（16）即刻移取20 μL置潔凈的載玻片一端；

（17）用吸頭或載玻片將精液輕推勻載玻片另一端；

（18）置于空氣中晾干；

（19）加上200 μL預(yù)冷的GENMED固著液（Reagent D），覆蓋樣品表面；

（20）室溫下孵育1 min；

（21）小心抽去固著液（用吸紙將固著液吸去）；

（22）小心加上200 μL GENMED染色液B(Reagent E)，覆蓋樣品表面；

（23）室溫下孵育20 min，避免光照；

（24）小心抽去染色液（用吸紙將染色液吸去）；

（25）小心加上200 μL GENMED清理液（ReagentC)，覆蓋樣品表面；

（26）小心抽去清理液（用吸紙將清理液吸去），蓋上蓋玻片；

（27）熒光顯微鏡下觀察計數(shù)，每次隨機(jī)選擇5個視野，每個視野中精子數(shù)在200個。

觀察藍(lán)色熒光GENMED染色液A(Reagent B)：激發(fā)波長350 nm，散發(fā)波長460 nm，可見亮藍(lán)白色熒光，表明死亡精子細(xì)胞；暗淡藍(lán)色熒光，表明活體精子（注意：在GENMED固著液（Reagent D)處理之前，進(jìn)行觀察）。

觀察綠色熒光-GENMED染色液B(Reagent E)：濾波器激發(fā)波長490 nm，散發(fā)波長530 nm，可見綠色熒光，表明精子頂體區(qū)域。觀察結(jié)果：整個頂體均勻明亮，呈綠色熒光說明頂體完整；頂體赤道面均勻，呈明亮綠色熒光，而20%頂體帽端無熒光顯示，說明頂體分散不均；精子頭部無熒光，說明頂體缺失。置于顯微鏡下放大400倍觀察精子形態(tài)，數(shù)不同視野下200個精子。頂體完整率=（總精子數(shù)-頂體不完整精子數(shù)）／200×100。

1.3.7 統(tǒng)計分析

本試驗所收集的數(shù)據(jù)使用Excel 2019版本軟件進(jìn)行整理分析，顯著性分析用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）的形式表示，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的BSA對FGF5基因編輯綿羊精液常溫保存效果的影響

由表1顯示FGF5基因編輯綿羊的精液在常溫（18℃～20℃）的條件下保存，保存18 h前添加不同濃度BSA的保護(hù)劑在各時間點的精子活率均高于濃度為0%的BSA組，差異顯著（P＜0.05），精子活力都能保持60%以上；保存18 h后濃度為0.5%BSA在各時間點的精子活率高于其他組，差異顯著（P＜0.05）。

表1 不同濃度BSA對FGF5精子活率及存活時間的影響

2.2 不同濃度的BSA對FGF5基因編輯綿羊精液冷凍-解凍后活率、活力、直線速率（VSL）、側(cè)擺幅值（ALH）的影響

通過邁朗精子全自動分析系統(tǒng)可以分析精子的活力、活率、運(yùn)動速率和運(yùn)動軌跡等相關(guān)信息。如表2所示，在精液冷凍保護(hù)劑中加入BSA可以顯著提高FGF5基因編輯綿羊精液冷凍后精子的活率、活力。添加的濃度為0.5%的BSA精液解凍后的精子活率和活力、直線速率較對照組和濃度為0.2%和1%的試驗組有著顯著性差異（P＜0.05），精子活率為39.81%。BSA濃度為0.2%和1%精液解凍后的精子活率和活力、直線速率均無顯著差異（P＞0.05）；BSA的濃度為0.2%和1%精液解凍后的精子活率和活力較于對照組有顯著性差異（P＜0.05），直線速率無顯著差異（P＞0.05）；經(jīng)試驗表明濃度為0.5%的BSA組優(yōu)于其他組。

表2 冷凍液配方

表2 不同濃度的BSA對FGF5基因編輯綿羊精液冷凍-解凍后的影響

2.3 不同濃度BSA對FGF5基因編輯綿羊精液冷凍-解凍后精子形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性的影響

表3表明了在精液冷凍保護(hù)劑中添加BSA對綿羊精液冷凍-解凍后精子結(jié)構(gòu)完整性的影響。在常規(guī)精液冷凍保護(hù)劑中添加不同濃度的BSA后，精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性均高于對照組，其中添加BSA的濃度為0.5%的效果相對優(yōu)于其他組；添加BSA的濃度為0.5%精子頂體完整率顯著高于BSA濃度為0.2%、1%和試驗組（P＜0.05），濃度為0.5%的精子畸形率顯著低于其他試驗組和對照組（P＜0.05）。BSA濃度為0.2%、1%精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)無顯著性差異（P＜0.05）。

表3 不同濃度BSA對精液冷凍-解凍后精子形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性的影響

3 討 論

FGF5已被證明是調(diào)節(jié)頭發(fā)生長的一個強(qiáng)有力的候選基因，F(xiàn)GF5基因修飾可以促進(jìn)毛發(fā)生長并延長毛囊的生長期，進(jìn)而改善羊毛品質(zhì)而且能穩(wěn)定遺傳[23]。FGF5通過促進(jìn)毛囊從生長期轉(zhuǎn)變?yōu)橥嘶冢瑥亩种泼业纳L，負(fù)面調(diào)節(jié)毛囊生長周期。因此，F(xiàn)GF5基因在調(diào)節(jié)被毛長度等方面起著重要作用。最近，許多研究人員發(fā)現(xiàn)FGF5基因在許多物種中都是多態(tài)的，在幾種哺乳動物物種中已經(jīng)描述了與長毛表型相關(guān)的功能缺失突變[24]。然而，目前對FGF5基因的進(jìn)化特征和生物學(xué)機(jī)制知之甚少。本研究以此前成功獲得的FGF5基因編輯綿羊為研究對象，該綿羊具有高品質(zhì)性狀和優(yōu)良的羊毛長度，顯著提高了羊毛產(chǎn)量、伸直長度和自然毛長，且表型性狀可穩(wěn)定遺傳。精液冷凍保存不僅可以長期將FGF5基因編輯綿羊基因資源進(jìn)行長期保存，而且能有效減少基因編輯綿羊的存欄數(shù)，優(yōu)化種質(zhì)資源的配置。精子冷凍保存在畜牧業(yè)生產(chǎn)至關(guān)重要，它能夠促進(jìn)和加速遺傳多樣性的傳播，并促進(jìn)遺傳優(yōu)勢動物在世界各地的分布[25～27]。有研究表明，在精子冷凍保存中精子活率、活力和精子細(xì)胞膜穩(wěn)定性等是最重要的[28～30]。BSA對離子和小分子進(jìn)行清除平衡精子質(zhì)膜兩側(cè)的滲透壓，并且阻止精子質(zhì)膜與活性氧發(fā)生過氧化反應(yīng)，從而有效地保護(hù)精子質(zhì)膜。Rachmawati等[31]報道，在牛精液冷凍保護(hù)劑添加為濃度0.2%的BSA最適濃度，可防止精液在冷凍過程中發(fā)生休克。本試驗研究結(jié)果顯示，在常溫保存條件下，常規(guī)冷凍保護(hù)劑中添加濃度為0.5%的BSA對FGF5基因編輯綿羊精液稀釋保存時精子活率的保持情況最好，說明了濃度為0.5%的BSA有助于提高FGF5基因編輯綿羊精液的生存能力，這與李彥林等[32]的研究結(jié)果不一致，其研究結(jié)果是在精液稀釋液中添加0.2%BSA對馬鹿精子的保存效果更佳。在對添加BSA濃度的精子冷凍研究中，添加BSA的最適濃度結(jié)果有所差異，這可能是由于精子的冷凍保護(hù)劑和稀釋液以及試驗動物品種之間有差異性所導(dǎo)致。在本試驗中發(fā)現(xiàn)，過多或少量的BSA都不利于FGF5基因編輯綿羊精子的生存能力和冷凍效果，這與崔凱[33]研究結(jié)果一致。在精液冷凍保存過程中，添加不同濃度的BSA對綿羊精液的冷凍保存有一定的改善和提高。此次試驗篩選出濃度為0.5%的BSA對FGF5基因編輯綿羊精液冷凍效果最佳。為FGF5基因編輯綿羊的精子冷凍保存提供了合理的理論依據(jù)、技術(shù)幫助和有益的參考。

4 結(jié)論

本試驗表明，在綿羊的常規(guī)冷凍保護(hù)劑中添加一定濃度的BSA對精液冷凍能起到改善作用，且在精液冷凍的生產(chǎn)實踐中有一定的實際意義，在常規(guī)精液冷凍保護(hù)劑中添加0.5%的BSA能顯著改善解凍后精子的各項指標(biāo)，有利于FGF5基因編輯綿羊精液的冷凍保存。