蘇 軍，趙明興，李 芳，林乃鍇，孫長(zhǎng)英，魯世金

1.杭州市余杭區(qū)第一人民醫(yī)院骨科，杭州 310000

2.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院骨科，長(zhǎng)治 046000

3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，南寧 530000

原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥與年齡增長(zhǎng)及婦女絕經(jīng)有關(guān)，其特征是骨量減少，骨組織顯微結(jié)構(gòu)改變（松質(zhì)骨骨小梁變細(xì)、斷裂、數(shù)量減少，皮質(zhì)骨多孔、變?。┮灾鹿谴嘈栽龈撸装l(fā)生骨折［1-3］。原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生機(jī)制是骨形成和骨吸收動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)，骨吸收過(guò)度而新骨生成不足［4-5］。目前，臨床上應(yīng)用的抗骨質(zhì)疏松藥物主要分為骨吸收抑制劑和骨形成促進(jìn)劑，雖然有一定的治療作用，但是由于耦合效應(yīng)，骨吸收抑制劑可引起骨形成減少，同樣，骨形成促進(jìn)劑也可引起骨吸收增加，從而限制了它們的功效［6］。深入了解成骨和破骨的分子機(jī)制有助于開(kāi)發(fā)新的靶向治療藥物，如骨硬化蛋白（SOST）抑制劑和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子抑制劑等［7］。

1 材料與方法

1.1 SOST基因沉默質(zhì)粒構(gòu)建

首先經(jīng)PubMed BLAST檢索小鼠SOST基因序列，設(shè)計(jì)2條小鼠共打靶SOST基因沉默靶序列和1條陰性對(duì)照序列，根據(jù)所選用載體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)并合成61 ～ 63 nt的單核苷酸鏈，退火形成雙鏈shRNA（表1）。將磷酸化/退火反應(yīng)體系放入熱循環(huán)儀上，37℃30 min，95℃ 5 min，然后以5℃ /min的速度快速降至25℃，單鏈oligos退火為雙鏈oligos，測(cè)序結(jié)果顯示目的雙核苷酸鏈已經(jīng)插入，證明SOST基因沉默載體構(gòu)建成功（圖1）。將SOST基因沉默載體，陰性對(duì)照載體轉(zhuǎn)染至小鼠骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并設(shè)置空白對(duì)照組（不轉(zhuǎn)染任何載體），待細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，裂解各組細(xì)胞，提取總蛋白，應(yīng)用Western bloting檢測(cè)各組sclerostin蛋白（SOST基因編碼的蛋白）的表達(dá)差異，篩選出SOST基因沉默效果最好的載體。

表1 SOST基因沉默靶序列Tab.1 SOST gene silencing target sequence

圖1 SOST基因沉默雙核苷酸鏈靶序列插入PLX-shRNA-1質(zhì)粒后的測(cè)序Fig.1 Sequencing of SOST gene silencing dinucleotide chain target sequence after insertion into PLX-shRNA-1 plasmid

1.2 模型制作

將驗(yàn)證并篩選的效果最好的慢病毒SOST-RNAi載體、SOST-N陰性對(duì)照載體分別與包裝載體系統(tǒng)一起轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝為假病毒顆粒采用3種方式處理小鼠成骨細(xì)胞前體細(xì)胞MC3T3-E1：①多靶點(diǎn)SOST基因沉默技術(shù)修飾并同時(shí)轉(zhuǎn)染CRISPR-sgRNA載體系統(tǒng)和SOST-RNAi修復(fù)模板載體假病毒顆粒；②同時(shí)轉(zhuǎn)染CRISPR-sgRNA載體系統(tǒng)和SOST-N修復(fù)模板載體假病毒顆粒；③不作任何處理。所有細(xì)胞均在相同條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

取18只18月齡雌性C57BL/6小鼠（湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），麻醉后在無(wú)菌條件下手術(shù)切除雙側(cè)卵巢制作骨質(zhì)疏松模型。模型制備成功后5周，分為3組（n=6）：SOST基因沉默組注射采用多靶點(diǎn)SOST基因沉默技術(shù)修飾并同時(shí)轉(zhuǎn)染CRISPR-sgRNA載體系統(tǒng)和SOST-RNAi修復(fù)模板載體假病毒顆粒的MC3T3-E1細(xì)胞；陰性組注射同時(shí)轉(zhuǎn)染CRISPR-sgRNA載體系統(tǒng)和SOST-N修復(fù)模板載體假病毒顆粒的MC3T3-E1細(xì)胞；空白組注射不作任何處理的MC3T3-E1細(xì)胞。注射量均為200 μL（含2×109個(gè)細(xì)胞），每周注射1次，共注射4次。

1.3 小鼠椎體組織切片制作和染色觀察

各組小鼠在相同條件下繼續(xù)喂養(yǎng)2個(gè)月后手術(shù)取出L1～3，將附著的肌肉組織剔除，用無(wú)菌蒸餾水反復(fù)沖洗。盡快對(duì)樣品進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)，暫不檢測(cè)的樣品保存于-80℃冰箱中。椎體組織用4%多聚甲酫溶液固定，經(jīng)過(guò)脫鈣、無(wú)水乙醇脫水、二甲苯中透明后石蠟包埋。將石蠟塊先按組織的形狀切割，然后進(jìn)行切片、貼片。

1.3.1 HE染色

取石蠟切片，脫蠟后放入雙蒸水中漂洗10 min；用Mayer 蘇木精溶液染色10 ～ 15 min ；雙蒸水浸洗5 min；在0.5%鹽酸-乙醇溶液中分色1 min；自來(lái)水浸洗20 min以上；雙蒸水漂洗5 min；0.5%伊紅染色1 ～ 2 min ；95%乙醇脫水3 min，重復(fù)2次 ；100%乙醇脫水3 min，重復(fù)2次 ；二甲苯透明 5 min，重復(fù)3次；中性樹(shù)膠封片。切片于37℃烘箱干燥，在顯微鏡下觀察，分析結(jié)果，采用Image J軟件計(jì)算骨小梁面積。

1.3.2 Masson三色染色

取石蠟切片，脫蠟后放入雙蒸水中漂洗10 min；放入57℃烘箱中30 min，冷卻20 min，二甲苯透明，梯度乙醇脫水；放入飽和苦味酸溶液1 h，自來(lái)水沖洗5 ～ 10 min ；放入3% Weigert蘇木精溶液染色20 min，自來(lái)水沖洗20 min ；放入1%麗春紅-酸性品紅染色5 min，雙蒸水漂洗30 s，重復(fù)2次 ；2%磷鎢酸浸泡2 min；0.5%苯胺藍(lán)水溶液浸泡8 min；1%醋酸浸泡1 min，重復(fù)2次；雙蒸水漂洗30 s，重復(fù)2次；放入100%乙醇中浸泡2 min，重復(fù)2次；二甲苯溶液浸泡2 min，重復(fù)3次。中性樹(shù)膠封片，37℃恒溫干燥，保存，在顯微鏡下觀察并分析結(jié)果，采用Image J軟件計(jì)算骨小梁面積。

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色

取石蠟切片，脫蠟后放入PBS緩沖液中，經(jīng)抗原修復(fù)液（Vector公司，美國(guó)）80℃加熱20 min，緩沖液清洗2次，再入0.3%過(guò)氧過(guò)氫溶液內(nèi)室溫作用20 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。在2%小牛血清（Jackson公司，美國(guó)）溶液中孵育1 h，分別加兔抗小鼠OPG抗體和RANKL抗體（1∶100，ScienCell公司，美國(guó)）4℃孵育過(guò)夜。次日經(jīng)緩沖液洗滌3次后，加相應(yīng)山羊抗兔IgG二抗（1∶400，ScienCell，美國(guó)）溶液，室溫孵育1 h，緩沖液洗滌3次后，加生物素與卵白素結(jié)合（ABC）試劑盒配制的混合液中孵育1 h。采用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色。呈色反應(yīng)后，切片經(jīng)逐級(jí)脫水并封片，顯微鏡下觀察，采用Image J軟件定量分析骨組織中OPG和RANKL表達(dá)的變化。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)SOST和骨代謝相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)

用TRIzol Reagent裂解液提取小鼠L3總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞SOST和相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平。PCR引物序列：SOST上游引物序列為5’- CGTGCCTCATCTGCCTACTT-3’，下游引 物 序 列 為 5’- ACATCTTTGGCGTCATAGGG-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為199 bp；RUNX2上游引物序列為 5’-AACAACAGCAACAGCAACAA-3’，下 游 引物 序 列 為 5’-CGGTAACCACAGTCCCATCT-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為300 bp；β-catenin上游引物序列為5’-CACTGGCAGCAGCAGTCTTA-3’，下游引物序列為5’-CCCTCATCTAGCGTCTCAGG-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為248 bp ；RANKL上游引物序列為5’-AGCCGAGACTACGGCAAG TA-3’，下游引物序列為 5’-AGTACAGGAACAGAGCGATGC-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為167 bp；骨保護(hù)素（OPG）上游引物序列為5’-GTTCCTGCACAGCTTCACAA-3’，下游引物序列為5’-AAACAGCCCAGTGACCATTC-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為121 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游引物序列為 5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為123 bp。用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPASS 20.0軟件分析、處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)用Dunnettt檢驗(yàn)、方差不齊時(shí)用Dunnett T3檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較 ；以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HE 染色

SOST基因沉默組L1椎板下骨小梁面積（345 780.0±68 138.31）nm2明顯高于陰性組（229 251.0±29 336.83）nm2和空白組（220 809.67±36 865.03）nm2，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，圖2）；陰性組與空白組骨小梁面積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05，圖2）。

圖2 L1 HE染色（×10）Fig.2 HE staining of L1（×10）

2.2 Masson三色染色

SOST基因沉默組L2椎板下骨小梁面積（383 554.67±28 059.27）nm2明 顯 高 于 陰 性 組（240 354.0±26 178.69）nm2和空白組（251 062.0±18 607.67）nm2，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，圖3）；陰性組與空白組骨小梁面積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05，圖3）。

圖3 L2 Masson三色染色（×10）Fig.3 Masson trichrome staining of L2（×10）

2.3 免疫組織化學(xué)染色

SOST基因沉默組OPG表達(dá)量（2.59±0.76）高于陰性組（0.65±0.10）和空白組（0.82±0.10），RANKL表達(dá)量（0.57±0.08）低于陰性組（1.21±0.15）和空白組（1.33±0.17），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，圖4）；陰性組與空白組OPG和RANKL表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05，圖4）。

圖4 L2免疫組織化學(xué)染色（×10）Fig.4 Immunohistochemical staining of L2（×10）

2.4 各組細(xì)胞SOST、骨形成標(biāo)志物、骨吸收標(biāo)志物基因的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，SOST基因沉默組SOST和RANKL相對(duì)表達(dá)量低于陰性組，RUNX2、β-catenin和OPG相對(duì)表達(dá)量高于陰性組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，圖5）。

圖5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)L3中相關(guān)因子表達(dá)Fig.5 Expression of related factors detected by real-time fluorescence quantitative PCR in L3

3 討 論

骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為一個(gè)世界范圍的健康問(wèn)題。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生率在老年婦女中為50% ～60%，男性中為20% ～ 30%［10］；北京市和上海市71 ～ 80歲人群骨質(zhì)疏松癥發(fā)生率分別為73.1%和67.5%［11］。該病發(fā)生率高，保健費(fèi)用消耗大，世界衛(wèi)生組織將其列為老年人三大疾病之一［12］。

骨骼是一種具有高度復(fù)雜性和動(dòng)態(tài)變化特性的結(jié)締組織，破骨細(xì)胞重吸收和成骨細(xì)胞骨重建的平衡是維持骨穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵［13］。RUNX2是調(diào)控骨形成的重要基因，有研究［14］證明，RUNX2基因缺失導(dǎo)致小鼠的成骨細(xì)胞缺乏。RUNX2上調(diào)成骨細(xì)胞相關(guān)基因，如COLIA1、ALP、BSP、BGLAP和OCN等［15］。RANK和RANKL是破骨細(xì)胞形成的關(guān)鍵因子，由成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞分泌，二者結(jié)合后即可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成［16］。OPG由成骨細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌，OPG與RANKL結(jié)合后可阻止RANK/RANKL相互作用，抑制破骨細(xì)胞形成［17］。β-catenin是另一個(gè)調(diào)節(jié)骨代謝的關(guān)鍵因子，激活Wnt/β-catenin信號(hào)傳遞，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化，抑制破骨細(xì)胞增殖分化，改善骨代謝［18］。由此可見(jiàn)，成骨細(xì)胞可分泌調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化和成熟的主要細(xì)胞因子，即成骨細(xì)胞的分化和活性是骨重建的關(guān)鍵。

骨代謝是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，受到局部微環(huán)境和全身因素的影響，包括激素（雌激素和甲狀旁腺激素等）、細(xì)胞因子、趨化因子和生物力學(xué)刺激等［19-22］。這些因素通過(guò)多種信號(hào)通路影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化和活性，而SOST參與多種信號(hào)通路的活性調(diào)節(jié)。①SOST抑制Wnt/β-catenin信號(hào)傳遞，從而抑制成骨細(xì)胞分化、增殖和活性，導(dǎo)致骨形成減少［6］。任艷霞等［23］對(duì)156例絕經(jīng)后2型糖尿病患者血清SOST表達(dá)與骨密度相關(guān)關(guān)系的研究證實(shí)，絕經(jīng)后2型患者SOST高表達(dá)可能導(dǎo)致骨代謝異常，引起骨密度降低，增加骨質(zhì)疏松發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)；相反，SOST功能的缺失能夠?qū)е氯祟惡褪蟮墓敲芏仍龈撸?4］。②TGF-β/BMP通路是影響骨代謝的另一個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。SOST主要通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Ⅰ型和Ⅱ型受體來(lái)抑制TGF-β/BMP通路，從而抑制成骨細(xì)胞分化及骨形成［24］。③甲狀旁腺激素（PTH）通過(guò)cAMP/PKA信號(hào)途徑抑制SOST表達(dá)［25］，PTH也可通過(guò)肌細(xì)胞促進(jìn)因子2（Mef2）來(lái)抑制SOST增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄活性［26］。④Huang等［27］的研究證明，SOST轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游10 kb區(qū)域存在3個(gè)潛在的雌激素受體反應(yīng)元件（ERE）。在成骨細(xì)胞中，雌激素信號(hào)與BMP2信號(hào)傳遞相互作用以間接的方式負(fù)調(diào)控SOST表達(dá)，并且，這種調(diào)控方式涉及Wnt/雌激素受體α和β-catenin信號(hào)通路［28］。⑤SOST啟動(dòng)子上游有一個(gè)140 bp的元件，含有2個(gè)E-box、C/EBP和RUNX2的結(jié)合位點(diǎn)，該元件是SOST基因轉(zhuǎn)錄活性所必需的［29］。因此，SOST可以影響RUNX2的表達(dá)。⑥Yang等［30］發(fā)現(xiàn)，SOST也是成骨轉(zhuǎn)錄因子Osterix的靶基因，Osterix的結(jié)合位點(diǎn)位于SOST基因上游100 ～ 260 bp區(qū)域，Osterix的C末端含有能結(jié)合到特定GC富集區(qū)的DNA結(jié)合域，促進(jìn)SOST啟動(dòng)子活性，從而調(diào)節(jié)SOST蛋白的表達(dá)水平。SOST是一種多肽類骨相關(guān)蛋白，是骨細(xì)胞衍生的骨形成負(fù)調(diào)節(jié)因子［31］。高特異性的表達(dá)模式和獨(dú)特的骨表型使SOST成為治療骨質(zhì)疏松等代謝性骨病和進(jìn)行骨折修復(fù)的一個(gè)很有吸引力的治療靶點(diǎn)［32］。SOST抗體是最近研究的熱點(diǎn)之一，包括romosozumab和blosozumab，它們可以引起骨形成標(biāo)志物的迅速增加，骨吸收標(biāo)志物持續(xù)下降，骨密度顯著增加［3］。

隨著基因修飾技術(shù)的進(jìn)步，開(kāi)發(fā)基因治療的新方法勢(shì)在必行。本研究采用多靶點(diǎn)基因沉默技術(shù)，大大提高了沉默SOST基因表達(dá)的效率。將多靶點(diǎn)沉默SOST基因修飾的MC3T3-E1細(xì)胞通過(guò)尾靜脈注射到骨質(zhì)疏松模型小鼠體內(nèi)2個(gè)月后，觀察到小鼠椎板下骨小梁面積明顯增加，且椎體組織中RUNX2、β-catenin、OPG基因表達(dá)增強(qiáng)，RANKL基因表達(dá)減弱，說(shuō)明注射SOST基因沉默的MC3T3-E1細(xì)胞能使骨質(zhì)疏松小鼠軟骨層下骨小梁形成增多，顯著增強(qiáng)成骨能力。

綜上所述，沉默SOST基因修飾干細(xì)胞治療的應(yīng)用有望增強(qiáng)骨質(zhì)疏松小鼠成骨細(xì)胞的分化和活性，達(dá)到治療骨質(zhì)疏松、降低骨折風(fēng)險(xiǎn)的目的。