王晨峰，盧旭華

海軍軍醫(yī)大學長征醫(yī)院骨科，上海 200003

椎間盤退行性變（IDD）是指在多種病因作用下導致椎間盤生物力學和組織結(jié)構(gòu)改變、髓核水分減少、纖維環(huán)破裂、壓迫脊髓和神經(jīng)根進而引起腰腿痛的疾病，近年來逐漸趨于年輕化［1-2］。IDD是脊柱外科的研究重點之一，但是其病因和發(fā)生機制尚不明確。有研究［3-7］報道，IDD主要與炎性反應(yīng)、細胞衰老和細胞外基質(zhì)成分改變等有關(guān)。因此，深入探索IDD的發(fā)生機制、尋找其早期診斷標志物和治療靶點具有重要意義。近年來，隨著生物信息學技術(shù)的發(fā)展和普及，許多疾病相關(guān)的基因組測序成為研究熱點。本研究通過基因表達匯編（GEO）數(shù)據(jù)庫中IDD相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)，分析篩選獲取差異表達基因（DEG），并對DEG進行功能富集和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析，以挖掘IDD疾病的新型標志物，為IDD的早期診治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

從GEO中搜索脊柱IDD相關(guān)的芯片數(shù)據(jù)。下載GSE124272［8］和 GSE150408［9］數(shù)據(jù)集中的芯片數(shù)據(jù)，平臺文件均為 GPL21185（Agilent-072363 SurePrint G3 Human GE v3 8x60K Microarray 039494）。GSE124272中包含健康志愿者和IDD患者外周全血樣本各8例，GSE150408中包含健康志愿者和IDD患者外周全血樣本各17例。下載GSE23130［10］數(shù)據(jù)集中的芯片數(shù)據(jù)作為驗證集，平臺文件為GPL1352［（U133_X3P）Affymetrix Human X3P Array］，依 據(jù)Thompson退行性變等級［11］分類將23例總樣本分為正常纖維環(huán)樣本15例和IDD纖維環(huán)樣本8例。

1.2 數(shù)據(jù)校正

將GSE124272和GSE150408芯片數(shù)據(jù)整合，并通過平臺文件中的基因名稱對芯片數(shù)據(jù)進行注釋。使用R 4.0軟件sva數(shù)據(jù)分析包對2個芯片數(shù)據(jù)進行校正，去除批次效應(yīng)，達到聯(lián)合分析的目的。

1.3 篩選 DEG

通過R 4.0軟件limma數(shù)據(jù)分析包比較正常人和IDD患者外周血中的基因表達改變。DEG的篩選標準均設(shè)定為校正后P＜ 0.05 和 | log2 差異倍數(shù) |≥0.585，繪制火山圖。然后依據(jù)DEG在不同樣本中的表達情況進行聚類分析，觀察基因間和樣本間的分布關(guān)系。

1.4 基因功能和通路富集分析

基因本體（GO）是用于基因注釋和分析基因生物學過程的主要生物信息學工具，京都基因與基因組百科全書（KEGG）是用于了解高級功能和生物系統(tǒng)的大規(guī)模分子數(shù)據(jù)庫。使用在線數(shù)據(jù)庫DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）對DEG進行GO和KEGG通路分析，設(shè)定P＜ 0.05為有統(tǒng)計學意義。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將DEG導入STRING（http：//string-db.org/）在線分析網(wǎng)站，按照組合得分＞ 0.9的標準并隱藏未參與構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)的蛋白，將輸出結(jié)果導入Cytoscape 3.7.1軟件進行可視化。利用Cytoscape 3.7.1軟件的MCODE插件篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中最為顯著的蛋白模塊獲取關(guān)鍵基因，并觀察其在驗證數(shù)據(jù)集中的表達情況。

1.6 關(guān)鍵基因?qū)DD的診斷價值分析

利用GSE124272、GSE150408數(shù)據(jù)集中的數(shù)據(jù)，通過計算受試者工作特征（ROC）曲線評估關(guān)鍵基因在IDD中表達的診斷價值，曲線下面積即代表基因的診斷效能。

2 結(jié) 果

2.1 DEG 篩選結(jié)果

通過將GSE124272和GSE150408芯片數(shù)據(jù)聯(lián)合分析后，共篩選出DEG 597個，包含上調(diào)基因363個和下調(diào)基因234個（圖1）。聚類分析將表達量相近的基因聚集，結(jié)果顯示4組樣本質(zhì)量合格，并且無批次效應(yīng)的影響。GSE23130數(shù)據(jù)集經(jīng)分析后，共篩選出DEG 1 017個。

圖1 DEG篩選Fig.1 Screening of DEG

2.2 GO 和 KEGG 分析

GO功能分析分為生物過程、細胞組分和分子功能3個部分，分析結(jié)果顯示，DEG參與的生物過程主要為細胞黏附、生物黏附和細胞間黏附等，細胞組分主要為褶皺膜、細胞間連接和核質(zhì)等，而分子功能則以多聚RNA結(jié)合、蛋白酶體結(jié)合和蛋白復(fù)合物結(jié)合等為主（圖2a），提示DEG主要參與細胞黏附、細胞凋亡、趨化作用和細胞遷移等功能。KEGG信號通路分析結(jié)果顯示，DEG主要參與細胞外基質(zhì)受體相互作用和癌癥中的信號通路（圖2b）。

圖2 DEG的GO和KEGG分析Fig.2 GO and KEGG analysis of DEG

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和蛋白模塊分析

由圖3可見，PPI網(wǎng)絡(luò)共有171個節(jié)點（蛋白）和313條邊（蛋白之間的相互聯(lián)系）。利用MCODE插件進行蛋白模塊分析，獲得最為顯著的2個模塊和17個關(guān)鍵基因，模塊1由9個節(jié)點（LSM2、POLR2F、RBMX、POLR2C、HNRNPD、SUGP1、SRRT、SRSF7和PPIL4）和36條邊組成（圖4a），模塊2由8個節(jié)點（RPS3A、RPL15、SSR1、RPL23A、RPS29、EEF1A1、SMG1和RPL22）和25條邊構(gòu)成（圖4b）。經(jīng)過GSE23130數(shù)據(jù)集驗證發(fā)現(xiàn)，RBMX、EEF1A1、SSR1和POLR2C在外周血和椎間盤組織樣本中均為DEG（圖4c）。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析Fig.3 PPI network analysis

圖4 模塊1、2的PPI網(wǎng)絡(luò)分析及關(guān)鍵基因驗證Fig.4 PPI network analysis and hub gene verification of modules 1，2

2.4 RBMX、EEF1A1、SSR1和POLR2C對IDD的診斷價值

ROC曲線分析結(jié)果顯示，外周血中RBMX、EEF1A1、SSR1和POLR2C對IDD診斷均具有一定價值，曲線下面積分別為0.763、0.741、0.710、0.702（圖5a～d），4個基因構(gòu)建的聯(lián)合診斷模型診斷價值進一步提高（曲線下面積為0.795，圖5e），提示這4個基因可作為IDD診斷的血液學標志物。

圖5 關(guān)鍵基因的診斷能力Fig.5 Diagnostic efficacy of hub genes

3 討 論

IDD是臨床常見病和多發(fā)病，嚴重影響患者生活質(zhì)量。因此，通過生物信息學技術(shù)探索IDD的發(fā)生機制，挖掘疾病相關(guān)的生物標志物，對IDD的早期診治具有重要意義。本研究結(jié)果表明，DEG主要參與細胞黏附、細胞凋亡、趨化作用和細胞遷移等功能。有研究［12］表明，在細胞和動物實驗中通過抑制凋亡表型，可防止椎間盤過早發(fā)生退行性變，使其繼續(xù)維持正常的生理功能，這或?qū)⒊蔀镮DD的治療方向之一。本研究的KEGG信號通路富集分析結(jié)果顯示，DEG主要富集于細胞外基質(zhì)受體相互作用和癌癥中的信號通路。并在分析過程中引入包含椎間盤組織樣本的GSE23130數(shù)據(jù)集來進一步佐證結(jié)果的科學性和準確性，篩選出RBMX、EEF1A1、SSR1和POLR2C 4個關(guān)鍵基因，通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析和ROC曲線分析進一步明確了這4個關(guān)鍵基因可作為IDD的診斷標志物。

RBMX基因是著絲粒非編碼RNP復(fù)合體的一個組成部分，其表達與Caspase3相關(guān)，并參與損傷后神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡過程［13］。EEF1A1負責將氨基酰tRNA酶解到核糖體，有研究［14-15］發(fā)現(xiàn)，EEF1A1可有效保護帕金森疾病引起的腦神經(jīng)退行性變和死亡，與EEF1A2亞型共同參與神經(jīng)退行性變性的進展。SSR1是一種糖基化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜受體，與通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的蛋白易位有關(guān)，可作為多種癌癥的預(yù)后指標［16］。POLR2C編碼RNA聚合酶Ⅱ的第三大亞基；Zhu等［17］的研究發(fā)現(xiàn)，POLR2C為腰椎IDD的關(guān)鍵基因，可作為IDD治療的重要靶點。上述研究結(jié)果進一步支持了本研究結(jié)果的可信度。

全血組織樣本獲取途徑極為便捷，篩選血液學診斷標志物可為疾病的早期診治提供方向。Kyritsis等［18］分析脊髓損傷患者急性期外周血整體基因表達，鑒別急性脊髓損傷后全血細胞中自然殺傷細胞和巨噬細胞等的變化，后構(gòu)建損傷程度預(yù)測模型，依據(jù)預(yù)測效力篩選出對脊髓損傷嚴重程度具有診斷和預(yù)后價值的生物標志物。Grad等［19］首次發(fā)現(xiàn)血漿中CCL5和CXCL6的升高與IDD程度密切相關(guān)，并推測這些趨化因子可能是診斷和監(jiān)測IDD的血液學生物標志物。Qi等［20］證實，血清CTX-Ⅱ和COMP是診斷IDD的可靠指標，其濃度與IDD的發(fā)生過程呈正相關(guān)。本研究通過生物信息學分析方法篩選出IDD患者外周血診斷標志物RBMX、EEF1A1、SSR1和POLR2C，四者聯(lián)合應(yīng)用可提高對IDD的診斷效力。通過生物信息學方法篩選診斷標志物對IDD的早期診治具有重大臨床意義，也為后期實驗提供了新的研究策略。

綜上所述，通過生物信息學技術(shù)聯(lián)合分析基因表達匯編數(shù)據(jù)芯片，探索IDD的診斷標志物，為進一步闡明IDD的發(fā)生機制及早期臨床診治提供理論參考，并為IDD靶向治療藥物的研發(fā)提供方向。