金孝華，黃莎莎，龐珊珊，戴樸，高華方，馬旭*

(1.國家衛(wèi)生健康委科學技術研究所，北京 100081；2.北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院，北京 100005；3.中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學部，北京 100853)

耳聾是最常見的出生缺陷性疾病之一，同時也是人類最常見的感覺功能障礙之一。研究發(fā)現(xiàn)，新生兒雙側聽力障礙(≥40 dB)發(fā)病率超過0.1%，隨著遲發(fā)性聽力障礙增加，到青春期發(fā)病率則高達0.35%[1]?！吨袊錾毕莘乐螆蟾?2012)》明確指出，2008至2010年我國先天聽力障礙發(fā)生率分別為19.9/萬、21.5/萬和21.9/萬，呈逐年上升趨勢[2]。目前研究表明，約60%的耳聾與遺傳因素有關，遺傳性耳聾約70%為非綜合征型，其余為綜合征型，遺傳性耳聾具有高度的遺傳異質性和廣泛的種族差異[3]。根據(jù)中國聾病分子流行病學數(shù)據(jù)，我國耳聾人群的主要致病基因是GJB2[4]、SLC26A4[5-6]和線粒體基因12SrRNA[7]。目前，新生兒聽力與耳聾易感基因聯(lián)合篩查作為有效的遺傳性耳聾三級預防手段，已在全國多個省市開展并且取得成效，其中4個耳聾基因9個位點及4個耳聾基因20個位點的篩查方案應用較廣[8-9]。為了進一步提高聾病易感基因突變篩查的效率及基因診斷確診率，本研究利用飛行時間質譜技術(MALDI-TOF MS)建立了單一反應檢測3個常見耳聾基因(GJB2、SLC26A4和線粒體12SrRNA)30個熱點突變位點的方法，并使用臨床樣本對該方法的準確性和有效性進行了驗證。

資料與方法

一、研究對象

選取2016年8月至2017年2月于中國人民解放軍總醫(yī)院就診的700例(327例已知突變位點，373例未進行基因檢測)非綜合征耳聾患者為研究對象。

327例已知突變位點的非綜合征型耳聾患者DNA樣本的納入標準：樣本已經過常見耳聾基因GJB2、SLC26A4和12SrRNA檢測，至少攜帶一個本研究待檢測的突變位點。排除標準：樣本DNA濃度低于10 ng/μl，或者260/280<1.7或260/280>1.9，即樣本DNA質量不能滿足飛行時間質譜檢測試劑要求。

373例未進行基因檢測的非綜合征型耳聾患者全血樣本的納入標準：經體格檢查、專科檢查及聽力學檢查臨床診斷為非綜合征型耳聾的患者。排除標準：急性或慢性中耳炎、外中耳畸形、聽神經瘤、晚期梅尼埃病、耳毒性藥物、腦膜腦炎、新生兒高膽紅素血癥、母親孕期宮內感染、外傷等有明確致聾原因的患者。

所有研究對象均簽署知情同意書，研究經解放軍總醫(yī)院醫(yī)院倫理委員會批準。

二、研究方法

1.DNA提?。翰捎醚?細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(天根生物)提取非綜合征型耳聾患者全血基因組DNA，提取方法嚴格按照試劑盒說明書進行。利用核酸定量儀(Nano Drop 2000，Thermo Fisher，美國)進行基因組DNA定量和純度測定。

2.飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)檢測耳聾致病基因突變方法的建立：根據(jù)我國聾病分子流行病學數(shù)據(jù)，選擇中國人群常見耳聾基因GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA共30個熱點突變位點(表1)，建立單一反應MALDI-TOF MS檢測耳聾致病基因熱點突變的方法。具體步驟如下：(1)多重PCR擴增：利用Assay Design 4.0軟件(Agena Bioscience，美國)進行多重PCR引物和單堿基延伸引物設計，多重PCR反應體系為5 μl，包括10×PCR Buffer 0.5 μl、25 mmol/L MgCl20.4 μl、25 mmol/L dNTP Mix 0.1 μl、0.5 μmol/L引物1 μl、5 U/μl PCR酶0.2 μl、ddH2O 1.8 μl。PCR擴增程序為：95℃預熱2 min；95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 1 min，45個循環(huán)；72℃ 7 min；4℃保持。(2)蝦堿性磷酸酶(SAP)處理：向5 μl PCR擴增產物中加入2 μl SAP混合液，包括1.7 U/μl SAP 0.3 μl、SAP buffer 0.17 μl、ddH2O 1.53 μl。反應條件為：37℃ 40 min；85℃ 5 min；4℃保持。去除未結合的dNTP。(3)單堿基延伸反應：向SAP處理后的PCR產物中加入配制好的單堿基延伸反應混合液2 μl，包括Buffer 0.2 μl、ddNTP Mix 0.2 μl、單堿基延伸引物0.94 μl、iPLEX單堿基延伸酶0.041 μl、ddH2O 0.619 μl。延伸條件為：94℃ 30 s；94℃ 5 s，(52℃ 5 s、80℃ 5 s，5個循環(huán))，40個循環(huán)；72℃ 3 min；4℃保持。(4)MALDI-TOF MS檢測：將單堿基延伸產物進行脫鹽、樹脂純化后，利用MassARRAY RS1000/Fusio 點樣儀(Agena Bioscience，美國)轉移到芯片上，采用MassARRAY質譜陣列基因分析系統(tǒng)(Agena Bioscience，美國)進行檢測，使用Typer 4.0軟件(Agena Bioscience，美國)進行數(shù)據(jù)分析。每個突變位點由于單堿基延伸產物分子量不同，形成不同的檢測峰而被區(qū)分(圖1)。

表1 耳聾基因GJB2、SLC26A4和線粒體12S rRNA的30個熱點突變位點

3.Sanger測序驗證：在耳聾致病基因突變位點周圍設計上下游擴增引物，PCR反應后獲得目標區(qū)域產物，采用BigDye 3.1(ABI，美國)測序試劑盒進行測序反應，產物經乙醇沉淀法純化后在ABI 3730×l測序儀(ABI，美國)上進行序列分析。

A：GJB2基因c.235delC雜合突變型峰圖；B：GJB2基因c.235delC野生型峰圖；C：質譜聚類圖圖1 MALDI-TOF MS檢測耳聾基因GJB2的檢測結果示例圖

結 果

一、建立檢測常耳聾致病基因熱點突變的單一反應MALDI-TOF MS方法

采用單一反應MALDI-TOF MS對327例已知突變的非綜合征型耳聾樣本(所攜帶的突變涵蓋了本研究要檢測的GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA基因30個位點，每個位點至少有8個以上陽性突變)進行檢測發(fā)現(xiàn)，GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA基因共30個突變位點在327例已知突變樣本中均檢出，其檢測結果與臨床基因診斷結果一致，符合率為100%，說明單一反應MALDI-TOF MS檢測常見耳聾治病基因(GJB2、SLC26A4和線粒體12SrRNA)的方法已成功建立。

二、利用新建立的單一反應MALDI-TOF MS檢測未知突變非綜合征型耳聾患者樣本的質譜結果

利用新建立的單一反應MALDI-TOF MS檢測373例未知突變位點的非綜合征型耳聾患者樣本發(fā)現(xiàn)，56.30%(210/373)患者至少攜帶1個突變，其中基因診斷確診攜帶復合或純合突變的患者為155例，占受檢人群的41.55%(155/373)，只檢測到1個突變的患者55例，占受檢人群的14.75%(55/373)，未檢測到突變的患者163例，占受檢人群的43.70%(163/373)。210例陽性突變攜帶者共涉及55種基因型，其中有5例存在多個基因突變，GJB2基因突變陽性患者93例，占受檢人群的24.93%(93/373)，SLC26A4基因突變陽性患者118例，占受檢人群的31.64%(118/373)，12SrRNA基因m.1555A>G突變占受檢人群的1.07%(4/373)(表2)。

三、Sanger測序驗證

根據(jù)373例未知突變位點的非綜合征型耳聾患者樣本的MALDI-TOF MS結果，針對每個檢出的突變位點分別選擇部分陽性結果樣本總計56例進行Sanger一代測序驗證，Sanger一代測序結果與新建立的MALDI-TOF MS檢測結果一致，符合率為100%。

表2 MALDI-TOF MS檢測應用于373例非綜合征型耳聾患者耳聾基因突變檢測結果

續(xù)表

討 論

耳聾是臨床上導致言語交流障礙的常見致殘性疾病。中國人群GJB2基因突變的攜帶率為3.16%，SLC26A4基因突變的攜帶率為2.75%，線粒體12rRNA突變的攜帶率為2.87‰，GJB2、SLC26A4和線粒體12SrRNA是導致我國耳聾高發(fā)的遺傳學基礎?，F(xiàn)有的耳聾基礎研究和臨床實踐證明，耳聾基因檢測對于耳聾的預防、治療具有重要作用[10]。

目前，耳聾基因檢測已經廣泛應用于臨床耳聾基因診斷和新生兒耳聾基因篩查，所采用的檢測技術包括基因芯片[11]、多色探針熔解曲線分析技術[12]、SNPscan技術[13]、MALDI-TOF MS[14-15]、新一代測序[16]等。其中MALDI-TOF MS為非雜交依賴性，不需要各種標記物，直接以分子量為標記，實現(xiàn)基因分型檢測和DNA突變檢測[17]。MALDI-TOF MS與其他針對已知突變的基因檢測技術相比具有以下技術優(yōu)勢[18]：(1)通量高。MALDI-TOF MS檢測1張384個樣品的芯片需要時間約1 h，一臺儀器每天可以檢測2 000個以上樣品，更適合大規(guī)模人群耳聾基因篩查工作開展；(2)準確率高。MALDI-TOF MS技術原理上相當于微測序反應，而且不需要任何標記物，直接通過分子量大小進行基因分型，結果準確；(3)成本低。不需要熒光標記，相對于SNPscan、芯片法等檢測方法其檢測成本低；(4)突變檢測位點多，覆蓋率高。本研究建立的方法可以單一反應檢測3個耳聾基因30個突變位點，與其它突變檢測技術如多色探針熔解曲線分析技術、Sanger測序等一個反應只能檢測一個或幾個突變位點相比，極大地提高了耳聾基因突變檢出率。目前MALDI-TOF MS除了應用于耳聾基因檢測外，也有研究者將其用于囊性纖維化[19]、苯丙酮尿癥[20]等遺傳病熱點突變檢測。在國內已有研究者利用MALDI-TOF MS開展中國人耳聾基因熱點突變檢測，如Yao 等[14]采用MALDI-TOF MS單一反應檢測GJB2和SLC26A4基因14個突變位點。曾云 等[15]同樣利用該技術單一反應檢測4個耳聾基因20個位點。本研究所建立的MALDI-TOF MS方法將檢測的耳聾基因突變位點增加到30個，對373例未基因診斷的非綜合征型耳聾患者進行檢測，在受檢者中發(fā)現(xiàn)了56.30%(210/373)的陽性攜帶者，其中攜帶復合雜合或純合突變可以明確基因診斷的患者占受檢人群的41.55%(155/373)。與Yao等[14]和曾云 等[15]的方法相比，本研究的方法有效提高了耳聾基因突變檢出率和臨床確診率，特別是改善了前庭導水管擴大(EVAS)主要致病基因SLC26A4的臨床確診率。SLC26A4 基因較大，共有21個外顯子，編碼區(qū)有20個外顯子，如果在只檢出一個突變情況下，對其確診最多需要做18個直接測序反應，成本和工作量都很大。有研究認為，如果將SLC26A4基因檢測突變位點增加到15個，EVAS患者的SLC26A4 基因突變的陽性檢出率能夠達到89.8%，臨床確診率可以達到60.41%，基本可滿足臨床需求[21]。本研究建立的MALDI-TOF MS方法包含了SLC26A4基因19個熱點突變，能很好滿足臨床需求。

本研究建立了基于MALDI-TOF MS的高通量耳聾基因檢測方法，可以單一反應檢測耳聾基因GJB2、SLC26A4和線粒體12rRNA的30個熱點突變，通過大量臨床樣本證明了該方法的準確性和有效性，該方法改善了聾病易感基因突變篩查的效率及基因診斷確診率，可廣泛應用于臨床耳聾基因診斷和新生兒耳聾基因篩查，為耳聾預防工作提供重要的技術支持。