苑婕，王紅旗，謝麗敏，葛曉靜

1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八八醫(yī)院第三派駐門診部，河南 鄭州 450001；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八八醫(yī)院藥劑科，河南 鄭州 450042

被譽(yù)為“雪山仙草”、“高原人參”、“東方神草”的紅景天藥用歷史悠久，“治血病、赤巴病、瘡癤潰爛”[1]是著名藏醫(yī)經(jīng)典《四部醫(yī)典》對(duì)紅景天的記載。《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列入上經(jīng)[2]、《本草綱目》將其列為上品[3]。大花紅景天Rhodiola crenulate(Hook.f.et Thoms.)H.Ohba被2015版《中國藥典》(一部)收錄，其干燥根和根莖作為其基源藥材，功效：益氣、活血、通脈、平喘。主治胸痹心痛，氣虛血瘀，倦怠氣喘，中風(fēng)偏癱[4]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明紅景天具有特殊的“適應(yīng)原”功效，不僅能抗缺氧、抗疲勞、抗輻射，還具有強(qiáng)心、抗心律失常、抗衰老、保護(hù)器官免受自由基損傷等作用[5]，在治療呼吸疾病、心腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤疾病、腎臟疾病等方面均有不同功效[6-9]。

網(wǎng)路藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，借助計(jì)算機(jī)技術(shù)，從整體角度通過解析藥物和治療對(duì)象之間的分子關(guān)聯(lián)規(guī)律來闡釋藥物作用機(jī)制和疾病機(jī)制，因與中醫(yī)藥學(xué)整體論思想異曲同工，故為發(fā)現(xiàn)中藥有效活性成分、闡釋中藥分子作用機(jī)制和解析方劑配伍規(guī)律等提供了新方法新思路[10]。本文以紅景天為研究對(duì)象，將紅景天化學(xué)成分、體內(nèi)作用靶點(diǎn)、心腦血管類相關(guān)疾病通過隨機(jī)森林算法建立了復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度進(jìn)行拓?fù)浣馕?，闡釋其在心腦血管類疾病治療中的分子作用機(jī)制，為紅景天的臨床應(yīng)用和開發(fā)研究提供參考，為相關(guān)疾病候選藥物研發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集4類陽性樣本集可直接從KEGG數(shù)據(jù)庫下載，拆分再隨機(jī)組合后獲得陰性樣本集，如圖1。陰性樣本集配對(duì)原則：不包含陽性樣本集中的配對(duì)；數(shù)量為陽性樣本集兩倍。陰性、陽性樣本集合并即為本研究的數(shù)據(jù)集。藥物分子描述符使用PowerMV軟件、靶蛋白分子描述符使用ProFeat軟件分別進(jìn)行計(jì)算，得到7202維的原始數(shù)據(jù)集，通過降維、歸一化計(jì)算保證后期模型的運(yùn)行速度和精度，降維處理如圖2，歸一化處理參考公式(1)。

圖1 獲取樣本集

圖2 數(shù)據(jù)集降維

1.2 模型隨機(jī)森林(random forest，RF)模型隨機(jī)森林算法穩(wěn)定性好、對(duì)異常值和噪聲容忍度高、不容易過擬合，利用集成學(xué)習(xí)思想，通過自助法(bootstrap)重采樣技術(shù)，隨機(jī)生成訓(xùn)練樣本和測(cè)試樣本，一個(gè)訓(xùn)練樣本生成一棵決策樹即一個(gè)分類器，多個(gè)訓(xùn)練樣本生成多個(gè)決策樹組成隨機(jī)森林，測(cè)試樣本的分類結(jié)果按決策樹投票分?jǐn)?shù)判定[11]，構(gòu)建隨機(jī)森林模型如圖3。本文采用K折交叉驗(yàn)證檢驗(yàn)隨機(jī)森林的分類能力和預(yù)測(cè)精度。假設(shè)可選的模型為M={M1,M2,M3,…Md}，K=10，即采用10折交叉驗(yàn)證，測(cè)試集為訓(xùn)練集的1/10，每個(gè)模型均進(jìn)行10次訓(xùn)練，10次測(cè)試，10次錯(cuò)誤率計(jì)算平均值，最終選擇平均率最小的模型Mi。

圖3 隨機(jī)森林模型

2 結(jié)果

2.1 模型優(yōu)化決策樹的個(gè)數(shù)(rtree)和節(jié)點(diǎn)分裂過程中抽取的特征個(gè)數(shù)(mtry)是隨機(jī)森林算法構(gòu)建過程中兩個(gè)重要參數(shù)，需進(jìn)行優(yōu)化。本文采用網(wǎng)格搜索法優(yōu)化參數(shù)獲得最高模型交叉驗(yàn)證正確率(Ac)[12]，結(jié)果見表1。

表1 本文模型的參數(shù)優(yōu)化

2.2 紅景天作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)紅景天9個(gè)化學(xué)成分可從化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)(http://www.organchem.csdb.cn/scdb/)下載，與上文四種已知的靶點(diǎn)進(jìn)行組合并構(gòu)建預(yù)測(cè)集。預(yù)測(cè)集進(jìn)行同樣的降維和歸一化處理后，投入RF建立的分類預(yù)測(cè)模型。表2列出了11個(gè)與紅景天化學(xué)成分作用的體內(nèi)潛在作用靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)出現(xiàn)頻次較高且有代表性；應(yīng)用Cytoscape_v3.8.2軟件構(gòu)建紅景天化學(xué)成分-體內(nèi)作用靶點(diǎn)-相關(guān)疾病網(wǎng)絡(luò)模型，見圖4；紅景天所含4號(hào)化合物(紅景天苷)-體內(nèi)作用靶點(diǎn)-相關(guān)疾病網(wǎng)絡(luò)模型見圖5。兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)模型中圓形節(jié)點(diǎn)代表紅景天化學(xué)成分、正方形節(jié)點(diǎn)代表潛在作用靶點(diǎn)、矩形節(jié)點(diǎn)代表相關(guān)疾??；某化合物與潛在作用靶點(diǎn)間的鏈接關(guān)系、靶點(diǎn)與相關(guān)疾病相互關(guān)系均以邊相連代表。從圖4紅景天化學(xué)成分與靶點(diǎn)間的鏈接關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖可見，成分、靶點(diǎn)和疾病間存在復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)潢P(guān)系，分析統(tǒng)計(jì)見表3，紅景天每個(gè)成分的平均靶點(diǎn)數(shù)為19。藥物成分節(jié)點(diǎn)與作用靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行連接，連接邊數(shù)總和即為連接度。4號(hào)成分紅景天苷是紅景天的主要有效成分，研究廣泛。本文以紅景天苷的網(wǎng)絡(luò)可視圖(圖5)舉例說明，4號(hào)成分作用于體內(nèi)17個(gè)與圖中21種疾病相關(guān)聯(lián)的靶點(diǎn)。以上網(wǎng)絡(luò)分析反應(yīng)了中藥化學(xué)成分、體內(nèi)作用靶點(diǎn)及相關(guān)疾病間的復(fù)雜作用機(jī)制。

表2 本文預(yù)測(cè)的紅景天11個(gè)潛在作用靶點(diǎn)

表3 9種化合物的連接度

圖4 紅景天9個(gè)化學(xué)成分-體內(nèi)作用靶點(diǎn)-相關(guān)疾病網(wǎng)絡(luò)模型

圖5 4號(hào)化合物(紅景天苷)-體內(nèi)作用靶點(diǎn)-相關(guān)疾病網(wǎng)絡(luò)模型

3 討論

3.1 文獻(xiàn)驗(yàn)證本文對(duì)紅景天9種化學(xué)成分進(jìn)行了心腦血管相關(guān)疾病體內(nèi)潛在作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)，接下來將對(duì)文獻(xiàn)驗(yàn)證進(jìn)行報(bào)道。王小博等[1]研究發(fā)現(xiàn)，紅景天及紅景天苷可改善缺氧所致腦損傷，兩者的作用機(jī)制均是通過抑制腦細(xì)胞線粒體膜轉(zhuǎn)運(yùn)孔的開放、降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、上調(diào)Bcl-2表達(dá)以及下調(diào)胱天蛋白酶3表達(dá)等。鈉通道電流對(duì)維持腦缺血損傷后神經(jīng)元細(xì)胞膜電位起著非常重要的作用，通過實(shí)驗(yàn)研究，黃媛恒等[13]發(fā)現(xiàn)：使用紅景天苷進(jìn)行體外灌流，大鼠心肌細(xì)胞膜鈉通道電流的電流-電壓曲線將下移，同時(shí)電流幅值增加。黃媛恒等[13]得出結(jié)論：該作用可能與紅景天苷增加鈉通道失活電位、抑制電流失活有關(guān)。CAO等[14]發(fā)現(xiàn)紅景天苷可恢復(fù)缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞內(nèi)的鈉通道電流和瞬時(shí)外向鉀通道電流，并呈一定的劑量依賴性。深入研究紅景天苷具體作用的鈉通道亞型、紅景天對(duì)腦缺血后神經(jīng)元鈉通道電流的影響機(jī)制，并以此為基礎(chǔ)，新的離子通道亞型抑制劑將有望被開發(fā)，非選擇性鈉通道抑制劑的不良反應(yīng)將被減少。張慶光等[15]在綜述中指出，紅景天苷能通過多靶點(diǎn)、多通路有效防治心腦、肝等組織的缺血再灌注損傷。梁子亮等[16]在紅景天化學(xué)成分的潛在靶標(biāo)研究中，將紅景天活性成分與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的缺氧誘導(dǎo)因子-1穩(wěn)定性相關(guān)的靶標(biāo)ARD1、PHD2、GSK3β、Hdm2、pVHL等進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果為陽性，認(rèn)為其能夠結(jié)合。趙小輝[17]研究表明，紅景天苷對(duì)心臟具有保護(hù)作用，且有效改善心肌舒縮功能，有效降低心力哀竭所致的心臟損傷，是通過調(diào)節(jié)腎上腺素及去甲腎上腺素水平而發(fā)揮作用的。本文預(yù)測(cè)出的靶點(diǎn)，只有鈉離子通道、鉀離子通道、腎上腺素受體在以往文獻(xiàn)中有涉及，其他靶點(diǎn)尚未得到文獻(xiàn)驗(yàn)證。

3.2 總結(jié)紅景天作為一類珍貴的天然植物藥材，藥理作用得到廣泛研究，但多集中在動(dòng)物的體外與體內(nèi)作用機(jī)制的探索，分子作用機(jī)制研究尚可進(jìn)一步開展，同時(shí)研究大多為其主要成分紅景天苷，其他有效成分的作用通路還需進(jìn)一步挖掘。本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)思想，采用隨機(jī)森林算法建立了具有較高精度預(yù)測(cè)紅景天治療心腦血管類疾病關(guān)鍵靶標(biāo)的模型，并將紅景天9種化學(xué)成分、體內(nèi)潛在作用靶點(diǎn)及相關(guān)疾病進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化，進(jìn)一步研究分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)驗(yàn)證關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)、潛在靶標(biāo)、相關(guān)疾病，為紅景天治療心腦血管等疾病的分子作用機(jī)制及物質(zhì)基礎(chǔ)、為紅景天活性成分及制劑的臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)和理論依據(jù)。同時(shí)為從天然活性成分基礎(chǔ)上研發(fā)出源于中藥的創(chuàng)新藥物提供參考，為進(jìn)一步開發(fā)和利用中藥提供研究思路。