李霞，周宇，湯欣源

1.西安醫(yī)學(xué)院附屬寶雞醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 寶雞 721006；2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 湛江 524023

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種結(jié)直腸炎癥性疾病，其病程較長，可引起腹痛、黏液血便，損害腸道黏膜，嚴(yán)重者甚至發(fā)展成腫瘤[1-2]。研究認(rèn)為，免疫紊亂、腸道上皮細(xì)胞異常增殖分化、微小RNA(microRNA，miRNA)異常表達、腸道菌群失調(diào)等與UC發(fā)病相關(guān)[3-4]。既往研究顯示，尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子2(caudal-related homeobox transcription factor 2，CDX2)在UC中表達水平較低，其可能通過影響腸黏膜屏障功能進而參與UC病變過程[5]；微小RNA-204-5p(microRNA-204-5p，miR-204-5p)在骨關(guān)節(jié)炎中表達下調(diào)，其在骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮抑炎作用[6]。但miR-204-5p在UC中的表達水平及其與CDX2和UC患者預(yù)后的關(guān)系尚不清楚。因此，本文通過檢測miR-204-5p、CDX2在UC中的表達情況，初步分析兩者的相關(guān)性及其與UC患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年4月至2019年12月西安醫(yī)學(xué)院附屬寶雞醫(yī)院消化內(nèi)科診治的115例活動期UC患者為研究對象(UC組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見》[7]中活動期UC的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)檢查/隨訪資料齊全；(3)年齡＞18歲；(4)均進行腸鏡檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有腸道結(jié)核或其他病毒性感染者；(2)有胃腸道手術(shù)史者；(3)近3個月有激素類藥物治療史者；(4)有中毒性巨結(jié)腸、腸局部狹窄、上皮內(nèi)瘤變、腸穿孔、腸梗阻等病變者；(5)有系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病或其他自身免疫疾病者；(6)哺乳/妊娠期者；(7)有貧血、腫瘤者。UC組患者中男性56例，女性59例；年齡33～54歲，平均(43.87±7.58)歲。按《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見》[7]中Truelove-Witts評分標(biāo)準(zhǔn)將UC患者分為輕度活動組(37例)、中度活動組(42例)和重度活動組(36例)。另納入同期在我院進行結(jié)腸鏡檢查的健康者35例作為健康組，其中男性22例，女性13例；年齡33～54歲，平均(42.36±7.39)歲。健康組與UC組受檢者的年齡、性別構(gòu)成比比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集實施結(jié)腸鏡檢查過程中，收集UC患者的病灶腸黏膜組織及健康者的腸黏膜組織，立即置于液氮罐中，過夜，轉(zhuǎn)存于-70℃冰箱。

1.2.2 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法測定腸黏膜組織CDX2 mRNA、miR-204-5p表達水平冰上研碎腸黏膜組織，采用TRIzol?LS Reagent(10296010，美國Invitrogen公司)提取腸黏膜組織總RNA后，以MultiMACS(TM)cDNA Synthesis Kit(130-094-410，美國Miltenyi公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；最后，使用ABI Power SYBRTMGreen PCR Master Mix、qRT-PCR儀(4367659、StepOneTM，美國ABI公司)擴增cDNA，獲得循環(huán)閾值(CT值)。擴增參數(shù)：98.2℃8 min；96.5℃20 s，58.5℃30 s，59.0℃15 s，40個循環(huán)。CDX2 mRNA、miR-204-5p的內(nèi)參基因分別是GAPDH、U6，引物序列見表1，CDX2 mRNA、miR-204-5p相對表達量以2-△△CT法計算。

表1 CDX2 mRNA、GAPDH、miR-204-5p、U6引物序列

1.3 隨訪及預(yù)后以復(fù)診方式對115例UC患者進行2年隨訪，以UC患者入院次日為隨訪起點，以2021年12月或UC患者出現(xiàn)預(yù)后不良情況為隨訪終點，記錄所有UC患者預(yù)后情況。以UC復(fù)發(fā)或UC患者發(fā)生UC相關(guān)結(jié)腸癌/黏膜發(fā)育異常為預(yù)后不良，根據(jù)UC患者2年內(nèi)是否發(fā)生預(yù)后不良情況將其分為預(yù)后不良亞組(46例)和預(yù)后良好亞組(69例)。此外，收集兩組患者體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、腸外表現(xiàn)、吸煙史、病變范圍等臨床資料。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；采用Logistic回歸分析UC患者預(yù)后的影響因素；采用Pearson法分析UC患者腸黏膜組織CDX2 mRNA表達水平與miR-204-5p的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UC組和健康組腸黏膜組織CDX2 mRNA、miR-204-5p表達水平比較UC組患者腸黏膜組織CDX2 mRNA、miR-204-5p表達水平明顯低于健康組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 UC組和健康組腸黏膜組織CDX2 mRNA、miR-204-5p表達水平比較(±s)

表2 UC組和健康組腸黏膜組織CDX2 mRNA、miR-204-5p表達水平比較(±s)

組別健康組UC組t值P值例數(shù)35 115 CDX2 mRNA 1.03±0.34 0.46±0.15 14.094 0.001 miR-204-5p 1.01±0.36 0.49±0.17 11.809 0.001

2.2 UC患者腸黏膜組織CDX2 mRNA表達水平與miR-204-5p的關(guān)系經(jīng)Pearson法分析結(jié)果顯示，UC患者腸黏膜組織CDX2 mRNA表達水平與miR-204-5p呈正相關(guān)(r=0.598，P＜0.05)，見圖1。

圖1 UC患者腸黏膜組織CDX2 mRNA表達水平與miR-204-5p的相關(guān)性

2.3 不同嚴(yán)重程度UC患者腸黏膜組織CDX2 mRNA、miR-204-5p表達水平比較重度活動組UC患者腸黏膜組織CDX2 mRNA、miR-204-5p表達水平低于輕度、中度活動組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；中度活動組UC患者腸黏膜組織CDX2 mRNA、miR-204-5p表達水平低于輕度活動組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

表3 不同嚴(yán)重程度UC患者腸黏膜組織CDX2 mRNA、miR-204-5p表達水平比較(±s)

表3 不同嚴(yán)重程度UC患者腸黏膜組織CDX2 mRNA、miR-204-5p表達水平比較(±s)

注：與輕度活動組比較，aP＜0.05；與中度活動組比較，bP＜0.05。

組別輕度活動組中度活動組重度活動組F值P值例數(shù)37 42 36 CDX2 mRNA 0.70±0.23 0.45±0.15a 0.23±0.08ab 74.146 0.001 miR-204-5p 0.72±0.24 0.47±0.16a 0.28±0.10ab 57.425 0.001

2.4 不同預(yù)后患者的一般資料及腸黏膜組織CDX2 mRNA、miR-204-5p表達水平比較預(yù)后不良組患者有腸外表現(xiàn)占比高于預(yù)后良好組，腸黏膜組織CDX2 mRNA、miR-204-5p表達水平明顯低于預(yù)后良好組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而兩組患者的性別、病變范圍、年齡、BMI、吸煙史占比比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表4。

表4 不同預(yù)后患者的一般資料及腸黏膜組織CDX2 mRNA、miR-204-5p表達水平比較[±s，例(%)]

表4 不同預(yù)后患者的一般資料及腸黏膜組織CDX2 mRNA、miR-204-5p表達水平比較[±s，例(%)]

指標(biāo)年齡(歲)男/女BMI(kg/m2)吸煙史(有/無)腸外表現(xiàn)(有/無)病變范圍左半結(jié)腸全結(jié)腸直腸、乙狀結(jié)腸CDX2 mRNA miR-204-5p預(yù)后良好組(n=69)43.61±7.54 34(49.28)/35(50.72)21.23±2.38 31(44.93)/38(55.07)11(15.94)/58(84.06)23(33.33)15(21.74)31(44.93)0.58±0.19 0.60±0.20預(yù)后不良組(n=46)44.25±7.62 22(47.83)/24(52.17)21.48±2.43 24(52.17)/22(47.83)20(43.48)/26(56.52)18(39.13)9(19.57)19(41.30)0.28±0.07 0.33±0.11 t/χ2值0.444 0.023 0.547 0.581 10.629 0.059 10.243 8.345 P值0.658 0.879 0.585 0.446 0.001 0.816 0.001 0.001

2.5 影響UC患者預(yù)后的危險因素以UC患者預(yù)后是否良好為因變量(良好=0，不良=1)，以CDX2 mRNA(實測值)、腸外表現(xiàn)(無=0，有=1)、miR-204-5p(實測值)為自變量，行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，CDX2 mRNA、miR-204-5p是UC患者預(yù)后不良的保護因素(P＜0.05)，腸外表現(xiàn)是UC患者預(yù)后不良的危險因素(P＜0.05)，見表5。

表5 影響UC患者預(yù)后因素的Logistic回歸分析

3 討論

UC是一種復(fù)發(fā)率較高的炎癥性腸病，隨著疾病反復(fù)發(fā)作，病程延長，UC患者發(fā)生癌變風(fēng)險增加[8-9]。因此，尋找影響UC發(fā)病且可評估UC患者預(yù)后的指標(biāo)，對采取有效干預(yù)措施，改善UC患者生存狀況尤為重要。

CDX2是一種轉(zhuǎn)錄因子，其可調(diào)控胚胎發(fā)育，介導(dǎo)免疫逃逸，調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞增殖、分化，參與營養(yǎng)物質(zhì)消化，影響礦物質(zhì)元素吸收及炎癥反應(yīng)，與腸道疾病發(fā)生發(fā)展有關(guān)[10-11]。近期報道顯示，CDX2在結(jié)腸癌中呈低表達，其與結(jié)腸癌患者預(yù)后顯著有關(guān)，CDX2有望成為評估UC患者預(yù)后的標(biāo)志物[12]；另外，石卉琴等[13]研究發(fā)現(xiàn)，CDX2在UC中表達下調(diào)，經(jīng)麥纖散治療后，其表達水平升高，CDX2可能參與UC腸黏膜修復(fù)。本研究中UC患者腸黏膜組織CDX2 mRNA表達水平較低，與馬濤等[5]和石卉琴等[13]研究趨勢一致，且疾病越嚴(yán)重，UC患者腸黏膜組織CDX2 mRNA表達水平越低，提示CDX2可能與UC病變進程密切相關(guān)，其有望成為評估UC病情的潛在指標(biāo)，推測，低表達CDX2 mRNA可能通過影響腸上皮細(xì)胞分化、增殖，進而引起結(jié)腸上皮發(fā)育不良，使其防御能力下降，導(dǎo)致微生物入侵腸道，從而影響UC病變過程。進一步研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)后不良亞組UC患者黏膜組織CDX2 mRNA表達水平低于預(yù)后良好亞組，提示低表達CDX2 mRNA與UC患者不良預(yù)后相關(guān)，CDX2 mRNA具有評估UC患者預(yù)后的潛在價值。

miRNA可影響炎癥反應(yīng)，參與腸上皮細(xì)胞增殖、凋亡，調(diào)控相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，與結(jié)腸癌、UC等腸道疾病進展密切相關(guān)[14-15]。近期研究顯示，微小RNA-21-5p在UC中呈過表達，其可通過影響細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)進而影響UC進展[16]；此外，微小RNA-219-5p在UC中表達水平降低，其可通過調(diào)節(jié)Treg/Th17細(xì)胞平衡進而參與UC的炎癥反應(yīng)及腸損傷過程[17]。以上研究表明，miRNA可能在UC中具有重要調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-204-5p在胃癌中表達下調(diào)，其可通過靶向調(diào)控有關(guān)基因，抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲，促進胃癌細(xì)胞凋亡，進而在胃癌中起抑癌作用，miR-204-5p可能是胃癌的治療靶標(biāo)[18]；且ZHENG等[19]通過構(gòu)建miR-204-5p的納米遞送系統(tǒng)，用于治療結(jié)腸癌，結(jié)果顯示，miR-204-5p的納米遞送系統(tǒng)可靶向腫瘤組織，進而發(fā)揮抑癌作用，為治療結(jié)腸癌提供新選擇。本研究顯示，UC患者腸黏膜組織miR-204-5p表達水平低于健康者，與其在結(jié)腸癌的研究結(jié)果類似[19]，且miR-204-5p表達水平隨UC加重而呈降低趨勢，提示miR-204-5p可能與UC疾病進展顯著相關(guān)，為診治UC、評估UC患者病情提供新靶點，推測miR-204-5p可能通過與靶基因結(jié)合，進而參與腸上皮細(xì)胞凋亡，影響炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)腸黏膜屏障功能，從而影響UC病理變化。進一步研究顯示，預(yù)后不良UC患者腸黏膜組織miR-204-5p表達水平低于預(yù)后良好UC患者，提示miR-204-5p與UC患者預(yù)后有關(guān)，其有望成為評估UC預(yù)后的指標(biāo)。

此外，本文探究了UC患者腸黏膜組織CDX2 mRNA表達水平與miR-204-5p的相關(guān)性，結(jié)果顯示，CDX2 mRNA表達水平與miR-204-5p呈正相關(guān)，提示CDX2 mRNA可能與miR-204-5p共同影響UC發(fā)生發(fā)展，但其機制尚需深入探究。腸道病變是UC患者的主要病變表現(xiàn)，但也存在口腔潰瘍、關(guān)節(jié)炎等腸外表現(xiàn)，本文中有腸外表現(xiàn)的UC患者預(yù)后不良風(fēng)險較高，分析可能原因，UC腸道炎癥程度與腸外表現(xiàn)有關(guān)，UC患者腸道炎癥越嚴(yán)重，關(guān)節(jié)炎等腸外表現(xiàn)發(fā)生概率越大，升高UC患者預(yù)后不良風(fēng)險[20]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，腸黏膜組織CDX2 mRNA、miR-204-5p表達水平降低也可使UC患者發(fā)生不良預(yù)后風(fēng)險增加，檢測腸黏膜組織CDX2 mRNA、miR-204-5p表達水平有益于臨床診治UC、判斷UC患者病情、評估UC患者預(yù)后。

綜上所述，UC患者腸黏膜組織CDX2 mRNA、miR-204-5p表達水平較低，兩者呈正相關(guān)，且CDX2 mRNA、miR-204-5p均與UC疾病程度、預(yù)后有關(guān)，為臨床診治UC、評估UC患者預(yù)后提供新思路。后期將從基礎(chǔ)實驗角度探究miR-204-5p在UC中的機制，為臨床診治UC提供更多依據(jù)。