焦鳳娟,劉俊杰,盧思維,姜東君

（濟寧醫(yī)學院精神衛(wèi)生學院 山東省行為醫(yī)學重點實驗室，山東 濟寧 272067）

轉(zhuǎn)錄因子EB（transcription factor EB，TFEB）是小眼畸形相關轉(zhuǎn)錄因子（microphthalmiaassciated transcription factor，MiTF）/轉(zhuǎn)錄因子E（transcription factor E，TFE）家族成員之一，屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子。活化的TFEB可通過協(xié)同溶酶體表達和調(diào)控（coordinated lysosomal expression and regulation，CLEAR）信號網(wǎng)絡參與自噬溶酶體基因表達調(diào)控，在神經(jīng)退行性疾病、腫瘤和脂質(zhì)代謝紊亂等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［1-5］。TFEB絲氨酸殘基的磷酸化狀態(tài)與其功能活性密切相關［6］。研究［7-11］顯示：TFEB多個絲氨酸位點可被多種激酶磷酸化并抑制核轉(zhuǎn)位，降低其活性，將磷酸化位點突變?yōu)闊o法被磷酸化的丙氨酸后可促進TFEB核轉(zhuǎn)位，上調(diào)自噬溶酶體等相關基因表達。但相關研究大多集中于動物和細胞水平，體外分析TFEB功能的研究尚不多見。

重 疊 延 伸PCR（gene splicing by overlap extension PCR，SOE PCR）技術是在PCR技術的基礎上，利用具有互補末端的引物使PCR產(chǎn)物形成重疊鏈，通過重疊鏈的不斷延伸，將不同來源的基因片段拼接起來的一項實驗技術［12］。相對于傳統(tǒng)基因突變技術，SOE PCR技術不受基因突變位置及突變類型的限制，成功率較高，已成為目前研究蛋白質(zhì)結構和功能的重要方法［13］。本研究以插入人TFEB基因片段的原核表達質(zhì)粒pGEX-6p-1-TFEB為模板，將TFEB基因中114位絲氨酸殘基突變?yōu)闊o法被磷酸化的丙氨酸，將TFEB及其突變體在大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）中誘導表達，對獲得的重組蛋白純化，為進一步在體外分析TFEB功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株、主要試劑和儀器pGEX-6p-1-TFEB質(zhì)粒為濟寧醫(yī)學院精神衛(wèi)生學院山東省行為醫(yī)學重點實驗室保存。E.coli感受態(tài)細胞DH5α和BL21（北京全式金生物技術有限公司）。T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ（美國New England Biolabs公司），2×phahta Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），DNA Marker、質(zhì)粒DNA提取試劑盒和DNA純化試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］，GS4B谷胱甘肽瓊脂糖微珠（美國GE Healthcare公司），氨芐青霉素和異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylbeta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）（美國Sigma公司），考馬斯亮藍R250（上海碧云天生物技術有限公司），其余試劑均為國產(chǎn)分析純或生化試劑。PCR儀及電泳裝置（美國Bio-Rad公司），紫外分光光度計BioSpec-nano（日本島津公司），超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。DNA測序由青島擎科梓熙生物技術有限公司完成。

1.2 定點突變引物設計將TFEB絲氨酸114位點突變?yōu)椴荒鼙涣姿峄谋彼?，根?jù)SOE PCR引物設計原理，共設計4條引物，正向引物（F）和反向引物（R）為2條外側引物，其5′末端分別帶有BamHⅠ和SalⅠ酶切位點，用于擴增全長TFEB基因片段；Fn和Rn為突變引物，用于擴增含突變位點的基因片段。引物由青島擎科梓熙生物技術有限公司合成。引物序列見表1。其中斜體部分表 示BamHⅠ（GGATCC）酶 切 位 點 和SalⅠ（GTCGAC）酶切位點，標下劃線的堿基代表突變堿基。

表1 SOE PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of SOE PCR

1.3 SOE PCR技術定點突變目的基因SOE PCR技術定點突變主要通過3步PCR反應完成。以野生型TFEB質(zhì)粒pGEX-6p-1-TFEB為模板，采用DNA聚合酶對正向引物F和突變引物Rn及反向引物R和突變引物Fn進行第1步PCR擴增，獲得含突變位點及其上下游片段產(chǎn)物1和產(chǎn)物2。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離、DNA純化試劑盒回收純化，以產(chǎn)物1和產(chǎn)物2為模板進行第2步變性退火，DNA純化試劑盒回收純化。取DNA純化產(chǎn)物為模板，采用DNA聚合酶對正向和反向外側引物F和R進行第3步PCR擴增，產(chǎn)物即為引入目的突變位點DNA片段。第1、2和3步PCR擴增循環(huán)條件均為95℃預變性30 s；95℃變性15 s，60.3℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共35個循環(huán)；72℃最后延伸5 min。第2步變性退火PCR條件為95℃預變性30 s；95℃變性15 s，65℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共15個循環(huán)；72℃延伸5 min。見圖1。

圖1 SOE PCR技術定點突變圖Fig.1 Site-directed mutagenesis by SOE PCR technique

1.4 載體pGEX-6p-1-TFEB S114A構建和鑒定突變DNA片段和pGEX-6p-1空載體分別采用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ進行雙酶切，純化后的酶切產(chǎn)物采用T4 DNA連接酶于室溫連接4～6 h。連接產(chǎn)物經(jīng)DH5α轉(zhuǎn)化、涂板后，挑取單克隆菌落，37℃、220 r·min－1搖菌過夜，經(jīng)菌液PCR驗證為陽性克隆后，抽提質(zhì)粒進行雙酶切和DNA測序鑒定。

1.5 野生型TFEB及其突變體TFEB S114A體外誘導表達將鑒定正確的重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-TFEB和pGEX-6p-1-TFEB S114A分別轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細胞BL21，鋪至含50 mg·L－1氨芐青霉素LB培養(yǎng)皿上，次日，挑選單克隆菌落，接種至5～10 mL含相應抗生素LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。按照1∶100接種量將過夜培養(yǎng)的菌液接種至10 mL含相應抗生素LB液體培養(yǎng)基中，600 nm波長處吸光度（A）值為0.6～1.0時，加入IPTG至不同終濃度，不同溫度下誘導表達過夜，取樣SDS-PAGE凝膠電泳分析蛋白表達情況。

1.6 體外誘導表達產(chǎn)物分離純化收集100 mL誘導表達的菌體，加入10 mL預冷PBS緩沖液，冰浴超聲裂解細胞（工作2 s，間隔3 s，功率30%）至澄清透明，12 000 r·min－1、4℃離心15 min，收集菌體和上清。將上清與Glutathione-Sepharose 4B瓊脂糖凝珠混合，室溫旋轉(zhuǎn)孵育1 h，2 000 r·min－1、4℃離心5 min，棄上清收集瓊脂糖珠，采用Elution buffer（10 mmol·L－1還 原 型 谷 胱 甘 肽，50 mmol·L－1Tris-HCl，pH 8.0）洗脫3次，純化后產(chǎn)物進行SDS-PAGE分析，檢測蛋白濃度和相對分子質(zhì)量，純化蛋白樣品于－80℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結 果

2.1 突變體TFEB S114A原核表達載體的構建以重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-TFEB為PCR模板，以F和Rn為引物進行PCR反應，獲得約360 bp的特異性條帶，該條帶即為含突變位點TFEB分子的上游基因片段；以Fn和R為引物進行PCR擴增，獲得約1 071 bp的特異性條帶，該條帶為含突變位點TFEB分子的下游基因片段，見圖2A?；蚱未笮∨c預期相符。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳純化后的上、下游基因片段為模板，以F和R為引物進行第3步PCR，獲得約1 431 bp的特異性條帶，與預期條帶大小相符，見圖2B。將該片段連接至載體pGEX-6p-1上獲得重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-TFEB S114A。雙酶切鑒定載體連接正確，酶切產(chǎn)物電泳后出現(xiàn)約2 700 bp載體片段和1 431 bp突變TFEB插入片段條帶，與預期結果一致，見圖2C。DNA測序分析結果顯示：目的位點突變成功，已由絲氨酸密碼子TCT突變?yōu)楸彼崦艽a子GCT，見圖2D。

圖2 突變TFEB S114A片段克隆與鑒定Fig.2 Cloning and identification of mutant TFEB S114A fragment

2.2 TFEB和突變體TFEB S114A誘導表達及純化實驗通過對IPTG濃度、溫度和時間等條件的優(yōu)化，成功誘導出野生型和S114A突變型TFEB蛋白，并且最佳誘導表達條件為0.5 mmol·L－1IPTG在16℃低溫條件下誘導過夜，見圖3A。純化后野生型和S114A突變型TFEB蛋白采用BSA進行半定量，結果顯示：得到純度較高的重組蛋白，純化后蛋白濃度約為10 g·L－1，見圖3B。

圖3 融合蛋白GST-TFEB和GST-TFEB S114A表達純化電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expression and purification of fusion proteins GST-TFEB and GST-TFEB S114A

3 討 論

TFEB在 自 噬 溶 酶 體 通 路 （autophagylysosomal pathway，ALP）調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用［14-16］。在 細 胞 和 動 物 水 平 的 研 究［17-21］證 實：TFEB蛋白中特定絲氨酸殘基的磷酸化是調(diào)節(jié)其亞細胞定位及其蛋白質(zhì)相互作用的重要機制，研究TFEB的磷酸化狀態(tài)是進一步分析其功能變化的重要前提。

定點突變技術已逐漸成為研究蛋白質(zhì)結構及其功能的有力工具。目前基因定點突變技術主要包括寡核苷酸介導的定點突變、盒式定點突變和PCR介導的定點突變?；赟OE PCR技術的定點突變是利用互補引物（含點突變、插入或缺失等）使2種PCR產(chǎn)物通過重疊鏈的退火延伸，并在擴增反應中使片段拼接獲得突變產(chǎn)物的高效、便捷的PCR定點突變技術。與其他定點突變技術比較，該技術不需要限制性內(nèi)切酶消化和連接酶處理，可以很快獲得依靠其他限制性內(nèi)切酶消化方法難以獲得的產(chǎn)物。此外，該技術還可以在外側引物的兩端設計酶切位點，更有利于進一步的連接克隆，且成功率較高，目前廣泛應用于定點突變和基因重組等方面［22-23］。本 研 究 采 用SOE PCR技 術 在 體 外 將TFEB的絲氨酸114位點突變?yōu)闊o法被磷酸化的丙氨酸。設計突變引物時需保證2條引物之間至少有20 bp的堿基互補區(qū)。此外，為防止PCR過程中錯搭，突變引物Tm值不能低于60℃。本研究中突變引物Fn和Rn長度均為31 bp并且完全重疊，符合突變引物設計原則。

為了提高可溶性蛋白表達水平，本研究從誘導溫度、誘導時間和誘導劑IPTG濃度3個方面進行了優(yōu)化，結果顯示：0.5 mmol·L－1IPTG、16℃誘導過夜可獲得較多可溶性蛋白。誘導溫度可影響重組蛋白的誘導表達及蛋白的可溶性［24］。部分蛋白在高溫誘導表達時容易出現(xiàn)錯誤性折疊，從而形成包涵體沉淀，而低溫誘導有助于蛋白的可溶性表達［25］。本文作者也發(fā)現(xiàn)在16℃誘導條件下形成的包涵體較少。IPTG作為一種強誘導劑，在菌體中無法被代謝，可以持續(xù)地發(fā)揮作用。研究［26］顯示：高濃度IPTG對菌株有一定的毒性作用，而較低濃度IPTG可以適當?shù)亟档娃D(zhuǎn)錄速率，更有利于蛋白的可溶性表達。本研究結果顯示：IPTG濃度對野生型和S114A突變型TFEB蛋白表達無明顯影響，最終選擇0.5 mmol·L－1IPTG作為TFEB蛋白的誘導濃度。

綜上所述，本研究以pGEX-6p-1-TFEB原核表達質(zhì)粒為模板，通過體外定點突變技術將TFEB絲氨酸114位點突變?yōu)闊o法被磷酸化的丙氨酸，并通過E.coli體外誘導表達系統(tǒng)成功誘導并純化出帶有GST標簽的野生型和突變型TFEB，為進一步了解TFEB在相關疾病中的功能和機制提供了實驗依據(jù)。