王 翠，謝彩華，錢(qián) 勇

（河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 鄭州 450008）

雞病毒性疾病對(duì)養(yǎng)雞業(yè)危害嚴(yán)重，目前在獸醫(yī)臨床上尚無(wú)特效藥物可以治療。干擾素是一類(lèi)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生的具有多重生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)，它能夠激活機(jī)體內(nèi)抗病毒效應(yīng)從而起到抗病毒作用。尤其是α干擾素，其屬于細(xì)胞水平上的廣譜抗病毒、抗腫瘤和具有免疫激活功能活性的細(xì)胞因子，其主要通過(guò)抑制病毒增殖、增強(qiáng)抗腫瘤活性以及加強(qiáng)NK 細(xì)胞活性，增強(qiáng)其殺傷病毒感染細(xì)胞的能力，是一類(lèi)具有臨床應(yīng)用價(jià)值的抗病毒制劑。重組雞α干擾素（recombinant chicken interferon α，rChIFN-α）是雞α干擾素和白細(xì)胞介素2基因的融合表達(dá)蛋白，在雞體內(nèi)外均具有α干擾素和白細(xì)胞介素-2蛋白的雙重生物學(xué)活性，適宜劑量的rChIFN-α在雞體內(nèi)具有顯著的抗病毒活性和免疫增強(qiáng)活性，是潛在的基因工程抗病毒制劑。

目前我國(guó)尚無(wú)rChIFN-α生物學(xué)活性測(cè)定方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部主編的《中華人民共和國(guó)獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2001 版）豬白細(xì)胞干擾素、《中國(guó)藥典》“注射用重組人干擾素α1b”、“重組人干擾素α1b 注射液”都是采用細(xì)胞病變抑制法測(cè)定生物學(xué)活性。該文參照目前公認(rèn)的“微量細(xì)胞病變抑制法”（簡(jiǎn)稱(chēng)CPE 抑制法），采用雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）/水皰性口炎病毒（VSV）、雞成纖維細(xì)胞系（DF-1）/ 水皰性口炎病毒（VSV）測(cè)定了3 個(gè)批次的rChIFN-α抗病毒活性，比較了CEF和DF-1兩種細(xì)胞的優(yōu)劣，選擇出了成本低、操作便捷的細(xì)胞，為后續(xù)rChIFN-α的深入研究提供了參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

DMEM 高糖培養(yǎng)基和D-Hanks 緩沖液為武漢博士德生物公司產(chǎn)品；胎牛血清為Sera Pro 公司產(chǎn)品；胰蛋白酶-EDTA消化液和青鏈霉素混合液（100X）為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

二級(jí)生物安全柜為青島海爾生物產(chǎn)品；二氧化碳培養(yǎng)箱為美國(guó)Thermo 公司產(chǎn)品；倒置熒光顯微鏡為日本尼康公司產(chǎn)品；恒溫水浴鍋為上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.1.3 細(xì)胞與毒株

細(xì)胞與毒株DF-1 細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽聲明科技有限公司；9日齡SPF雞胚購(gòu)自乾元浩（鄭州）生物藥廠；水泡性口炎病毒毒株（VSV毒株），由河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心保存；重組雞α干擾素由河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心制備與保存，批號(hào)分別為202101、202102和202103。

1.2 方法

1.2.1 CEF細(xì)胞的制備

二級(jí)生物安全柜中取出9日齡SPF雞胚，外殼進(jìn)行消毒，然后用鑷子打開(kāi)氣室，取出雞胚體于一次性無(wú)菌平皿中；剪去頭、四肢和內(nèi)臟，采用PBS洗滌2次后，剪碎胚體，PBS再洗滌2次；加入25 mL DMEM高糖培養(yǎng)基和5 mL胰蛋白酶-EDTA消化液，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化20 min后，棄去培養(yǎng)基；加入40 mL 含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，用吸管反復(fù)吹打數(shù)次以使細(xì)胞團(tuán)塊分散成為單個(gè)細(xì)胞；將分散均勻的單個(gè)細(xì)胞混合物加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.2 DF-1細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

取培養(yǎng)至單層、長(zhǎng)勢(shì)良好的DF-1細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基重新懸??；按100 μL/孔的量加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)單層，備用。

1.2.3 樣品稀釋與細(xì)胞混合

3 個(gè)批次待檢rChIFN-α樣品由21至225進(jìn)行連續(xù)2 倍倍比稀釋。待96 孔培養(yǎng)板中的CEF 和DF-1 細(xì)胞長(zhǎng)至鋪滿(mǎn)單層，用D-Hanks 液洗滌細(xì)胞兩次，將上述稀釋好的待檢樣品依次分別加入CEF和DF-1細(xì)胞中，每個(gè)稀釋度重復(fù)4孔，同時(shí)設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組。置37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h左右。

1.2.4 加入VSV病毒

24 h后，以100 TCID50/ml的濃度加入VSV，每孔100 μL。同時(shí)設(shè)置病毒對(duì)照組。置37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h左右。

1.2.5 觀察結(jié)果

加入VSV 病毒24～36 h 左右，電子顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，若細(xì)胞對(duì)照組中各孔的細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)良好，而病毒對(duì)照組中各孔細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)皺縮、變圓、破碎、脫落，有75%～100%細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變和死亡，則說(shuō)明該次試驗(yàn)設(shè)置的對(duì)照系統(tǒng)成立，試驗(yàn)結(jié)果可信。

1.2.6 生物學(xué)活性單位計(jì)算

按照Reed-Muench 法計(jì)算試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算公式為：距離比=（高于50%的百分?jǐn)?shù)－50）/（高于50%的百分?jǐn)?shù)－低分50%百分?jǐn)?shù)）=（80－50）/（80－20）=30/60=0.5。即此批次rChIFN-α待檢樣品稀釋到2-17.5（1∶185 364）時(shí)能保護(hù)半數(shù)細(xì)胞免受VSV病毒攻擊損害。該批次rChIFN-α樣品的效價(jià)即為185 364 單位，因此得出干擾素的國(guó)際單位（以IU表示）。

2 結(jié)果

2.1 顯微鏡下觀察

3 個(gè)批次的rChIFN-α細(xì)胞病變孔數(shù)與細(xì)胞病變程度比較；CEF和DF-1細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞正常，病毒對(duì)照組出現(xiàn)病變典型。

2.2 結(jié)果計(jì)算

2.2.1 rChIFN-α在CEF細(xì)胞上生物學(xué)活性計(jì)算結(jié)果

3 個(gè)批次rChIFN-α能抑制50%細(xì)胞病變的干擾素稀釋度的對(duì)數(shù)log2X均為22，即rChIFN-α（0.1 ml）稀釋到2-22時(shí)能保護(hù)半數(shù)細(xì)胞免受損害，計(jì)算X=4.19 107IU/ml，即rChIFN-α的效價(jià)為4.19 107IU/ml（見(jiàn)表1）。同等試驗(yàn)條件下細(xì)胞對(duì)照組各孔細(xì)胞狀態(tài)和長(zhǎng)勢(shì)良好，病毒對(duì)照組各孔細(xì)胞均出現(xiàn)病變或死亡。

表1 重組雞α干擾素在CEF細(xì)胞上生物學(xué)活性測(cè)定

2.2.2 rChIFN-α在DF-1細(xì)胞上生物學(xué)活性計(jì)算結(jié)果

3個(gè)批次rChIFN-α能抑制50%細(xì)胞病變的干擾素稀釋度的對(duì)數(shù)log2X分別為22、22、21，即rChIFN-α（0.1 ml）稀釋到2-22和2-21時(shí)能保護(hù)半數(shù)細(xì)胞免受損害，計(jì)算X=4.19 107IU/ml、X=4.19 107IU/ml X=2.10 107IU/ml，即rChIFN-α的效價(jià)為4.19 107IU/ml、4.19 107IU/ml、2.10 107IU/ml。

同等試驗(yàn)條件下細(xì)胞對(duì)照組各孔細(xì)胞狀態(tài)和長(zhǎng)勢(shì)良好，病毒對(duì)照組各孔細(xì)胞均出現(xiàn)病變或死亡。該研究過(guò)程發(fā)現(xiàn)高濃度的rChIFN-α?xí)?dǎo)致CEF和DF-1細(xì)胞死亡，表明rChIFN-α在CEF 和DF-1 兩種細(xì)胞上抗VSV 活性存在最適作用濃度，并非濃度越高抗VSV活性越好。

2.3 結(jié)果比較

在CEF 和DF-1 細(xì)胞上對(duì)3 個(gè)批次rChIFN-α生物學(xué)活性進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得出rChIFN-α在CEF和DF-1細(xì)胞上生物學(xué)活性效價(jià)分別為4.19 107IU/mL、4.19 107IU/mL、4.19 107IU/mL 和4.19 107IU/mL、4.19 107IU/mL、2.10 107IU/mL，結(jié)果表明差異不顯著（P值＞0.05）。

3 結(jié)論

rChIFN-α在CEF 和DF-1 細(xì)胞上進(jìn)行生物學(xué)活性測(cè)定結(jié)果差異不顯著。鑒于CEF細(xì)胞制備繁瑣、成本較高，而DF-1細(xì)胞可大量增殖、傳代培養(yǎng)，且培養(yǎng)便捷可節(jié)約成本。因此，選擇DF-1細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)?！?/p>