王新港，王彥輝，周 欣，丁麗萍，陳圓圓，李厚偉，張先鋒＊

（河南普華基因科技有限公司，河南 鄭州 450002）

鴨2型腺病毒（Duck adenovirus 2，DAdV-2）病和鴨圓環(huán)病毒（Duck circovirus，DuCV）病是嚴(yán)重影響我國水禽養(yǎng)殖的兩種病毒性疾病。雛鴨階段兩種疾病的發(fā)病路和死亡率高。鴨腺病毒感染主要表現(xiàn)為精神萎靡、沉郁和消瘦，排淺黃白色的糞便。病理變化為肝臟腫大并有白色針尖狀壞死點(diǎn)灶，腎臟及脾臟腫大充血，胰腺有白色點(diǎn)狀壞死。而鴨圓環(huán)病毒常呈潛伏感染，并入侵鴨的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致機(jī)體的免疫功能下降，對多種條件性病原抵抗力減弱，使其更易遭受其他致病因素的侵襲。而一旦發(fā)生混合感染（如鴨流感病毒、鴨腺病毒、鴨大腸桿菌等混合感染），感染鴨的死亡率就會(huì)大大提升。目前上述兩種疾病已廣泛流行于廣東、福建、浙江等水禽養(yǎng)殖密集地區(qū)，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

上述兩種病原均為DNA 病毒，引起的臨床癥狀具有一定的相似性，易發(fā)生混合感染，極大地增加了臨床鑒別診斷的難度。而常規(guī)的診斷方法，如動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、免疫學(xué)和病毒分離培養(yǎng)，在臨床診斷中存在診斷時(shí)間長、敏感性低以及操作繁瑣等缺點(diǎn)，在臨床中不易于快速診斷上述兩種疾病。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測方法來診斷和監(jiān)控上述兩種病原，確保養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展尤為重要。

筆者基于前期臨床調(diào)查和研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了DAdV-2 和DuCV 雙重PCR 方法的建立，并對建立的雙重PCR 方法對鴨群中鴨圓環(huán)病毒和鴨腺病毒2 型進(jìn)行鑒別診斷，驗(yàn)證了該方法的可靠性和穩(wěn)定性。對鴨群中鴨圓環(huán)病毒和鴨腺病毒2 型流行病學(xué)調(diào)查及防控提供了可靠的檢測手段，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器與試劑盒

核酸提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；PCR儀、臺(tái)式離心機(jī)、微量移液器、無菌操作臺(tái)、電泳儀、凝膠成像儀由河南普華基因科技有限公司提供。

1.2 陽性病料、菌毒株及臨床樣品

試驗(yàn)用陽性病料：含有鴨圓環(huán)病毒的陽性病料由河南普華基因科技有限公司鑒定和保存。

試驗(yàn)用菌毒株：鴨腺病毒2型、鴨瘟病毒、鴨病毒性肝炎Ⅰ型、鴨呼腸孤病毒、鴨坦布蘇病毒、鴨細(xì)小病毒、鴨大腸桿菌、鴨疫里默氏桿菌、鴨源禽多殺性巴氏桿菌均由河南普華基因科技有限公司鑒定和保存。臨床樣品均來自2019-2020年不同省份送檢疑似病料，共計(jì)83份。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上已報(bào)道的DAdV-2和DuCV的全基因組序列，對不同毒株基因組的比對和分析，篩選其較為保守的核酸片段，應(yīng)用Primer5.0 引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)了兩對針對上述兩種病毒的特異性引物，并通過NCBI（https://www.ncbi.nih.gov/）對兩對引物進(jìn)行在線分析。最終篩選出兩對引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。兩對引物能夠特異性地?cái)U(kuò)增出598bp（DAdV-2）和297bp（DuCV）的特異性片段。

表1 PCR引物信息序列

1.3.2 菌毒株核酸提取

待測樣品核酸的提?。哼x取疑似發(fā)病動(dòng)物無菌采集其內(nèi)臟組織（肝臟和脾臟）約5 g，在超凈操作臺(tái)用手術(shù)剪刀將上述病料組織剪碎，用PBS按照5∶1（W/V）進(jìn)行稀釋后，放置-80 ℃反復(fù)凍融三次，上述待測樣品及對照菌毒株按照病毒基因組提取試劑盒（TIANamp Virus DNA/RNA Kit）進(jìn)行核酸的提取，提取后核酸置-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 雙重PCR擴(kuò)增

在前期單一PCR 研究的基礎(chǔ)上將相同濃度的DAdV-2和DuCV DNA混合后作為雙重PCR模板，對雙重PCR反應(yīng)條件，包括引物終濃度、反應(yīng)體積進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳反應(yīng)體系及最佳反應(yīng)條件。擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定。

1.3.4 雙重PCR特異性實(shí)驗(yàn)

在雙重PCR 擴(kuò)增優(yōu)化基礎(chǔ)上，采用建立的雙重PCR方法分別對鴨病毒性肝炎Ⅰ型、鴨呼腸孤病毒和鴨坦布蘇病毒、鴨腺病毒2 型、鴨圓環(huán)病毒、番鴨細(xì)小病毒、鴨瘟病毒、鴨大腸桿菌、鴨疫里默氏桿菌和鴨源禽多殺性巴氏桿菌的陽性模板及ddH2O 進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)陰性對照，驗(yàn)證所建立雙PCR方法的特異性。

1.3.5 雙重PCR敏感性實(shí)驗(yàn)

利用分光光度計(jì)分別測定DAdV-2 和DuCV 的DNA濃度，用滅菌雙蒸水對其10倍濃度梯度稀釋，將各稀釋度DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測最小檢出量。

1.3.6 雙重RT-PCR方法的臨床應(yīng)用

對河南普華基因科技有限公司研發(fā)中心于2019-2020年采集的83份疑似病死鴨內(nèi)臟作為臨床檢測樣品處理后，保存樣品核酸，用單一PCR和已經(jīng)建立的雙重PCR方法分別對樣品核酸進(jìn)行檢測，通過對兩種方法檢測結(jié)果的比較，來評價(jià)建立的雙重PCR方法的臨床應(yīng)用效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙重PCR的建立

2.1.1 雙重PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件優(yōu)化

在反應(yīng)條件不變的條件下（94 ℃90 s，94 ℃20 s，54 ℃30 s，72 ℃20 s，30個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)72 ℃延伸5 min），將相同濃度的DAdV-2 和DuCV 提取的DNA 混合后作為雙重PCR模板，對雙重PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

引物濃度篩選：選取20 pmol/μL、10 pmol/μL、5 pmol/μL、1 pmol/μL、0.5 pmol/μL共計(jì)5個(gè)不同的引物濃度梯度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行引物濃度篩選。

反應(yīng)體系體積的篩選：在引物濃度為確定條件下，分別選擇12.5 μL、25 μL和50 μL的反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。

考慮到經(jīng)濟(jì)性和操作簡便性，最終選擇的雙重PCR反應(yīng)體系為：2 5BR. BTUFS. JY12.5 μl，兩對上、下游引物各0.5 μl（10 pmol/μL），cDNA 模板各1 μl，ddH2O 補(bǔ)足至

25 μL。

2.1.2 雙重PCR特異性試驗(yàn)

擴(kuò)增結(jié)果顯示，只有DAdV-2和DuCV的混合DNA模板和DAdV-2、DuCV 的單一DNA 模板擴(kuò)增出與目的片段大小相符的條帶。對擴(kuò)增出的DuCV 病毒的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因測序，并對擴(kuò)增產(chǎn)物序列與參考引物序列進(jìn)行生物信息學(xué)軟件分析，兩者核苷酸同源性達(dá)到96%以上，分析結(jié)果證實(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為DuCV病毒。

2.1.3 雙重PCR敏感性試驗(yàn)

利用分光光度計(jì)分別測定DAdV-2 和DuCV 的DNA濃度分別為67 ng、52 ng，用滅菌雙蒸水對其10 倍比梯度稀釋，取10-1～10-5稀釋度進(jìn)行檢測，將各稀釋度DNA作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，檢測最小檢出量。兩種病毒DNA 混合物擴(kuò)增結(jié)果表明，該方法對DAdV-2和DuCV的DNA最小檢出量分別為0.67 pg和5.2 pg。

2.2 雙重PCR臨床應(yīng)用

臨床樣本檢測結(jié)果見表2，由表2 可知，本試驗(yàn)雙重PCR 檢測結(jié)果與單一PCR 檢測結(jié)果的吻合率達(dá)到100%。對擴(kuò)增出DAdV-2的陽性產(chǎn)物進(jìn)行基因測序，并與參考引物序列進(jìn)行生物信息學(xué)軟件分析，兩者核苷酸同源性達(dá)到98%以上，分析結(jié)果證實(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為DAdV-2病毒。

表2 臨床樣品檢測結(jié)果

3 討論

PCR是實(shí)驗(yàn)室常用檢測方法之一，其具有快速、靈敏、成本低、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)；該方法不僅能快速確定病毒種類，還能檢測病毒的早期感染和潛伏感染。但是檢測時(shí)如果使用擴(kuò)增單種病毒的引物對待測樣品進(jìn)行鑒別，則可能需要準(zhǔn)備多份樣品擴(kuò)增多次才能確定感染的病毒類型，不僅在實(shí)際操作中需要增加檢測次數(shù)，另外還會(huì)引起交叉感染。雙重PCR 是在單一PCR 基礎(chǔ)上建立起來的，其優(yōu)點(diǎn)在于通過一次PCR 的反應(yīng)，可以同時(shí)檢測并鑒別兩種病原，在臨床中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

該試驗(yàn)建立的同時(shí)檢測DAdV-2 和DuCV 雙重PCR方法，通過一系列的試驗(yàn)驗(yàn)證，對DAdV-2和DuCV的核酸最小檢出量分別為0.67 pg 和5.2 pg。對臨床樣品的檢出率與單一PCR方法吻合度達(dá)到了100%。

該試驗(yàn)建立的同時(shí)檢測DAdV-2 和DuCV 雙重PCR方法具有方便、快捷、敏感、特異性強(qiáng)及可重復(fù)性等特點(diǎn)，可大大節(jié)省兩種病原的檢測時(shí)間，對PRRSV和GETV的檢測、混合感染的診斷、公共衛(wèi)生及流行病學(xué)調(diào)查等具有重要學(xué)術(shù)意義和應(yīng)用價(jià)值?！?/p>