李文超

（方正縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，黑龍江 方正 150800）

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)迅速蔓延全球，目前已超出500個變種，頻繁出現(xiàn)在人類和動物臨床腸桿菌科分離株中。ESBLs菌株的典型特征是能水解羥亞氨基-頭孢菌素類，對β內(nèi)酰胺抑制劑敏感的ESBLs，尤其是TEM，SHV和CTX-M酶表現(xiàn)高度多樣性。因此，本研究主要針對TEM，SHV和CTX-M這三種耐藥基因進(jìn)行檢測，以了解黑龍江地區(qū)流行的基因型和分子特征。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 從黑龍江省15個不同雞場，以無菌器皿操作采集55只疑似大腸桿菌病病死雞肝臟樣品，并且均來源于剛剛病死雞。通過分離培養(yǎng)得到55株病原菌。經(jīng)PCR擴(kuò)增測序，BLAST比對，結(jié)果顯示全部為大腸桿菌。

1.1.2 藥物及培養(yǎng)基Mueller-Hinton Broth(MH)瓊脂粉、培養(yǎng)基購自杭州天和微生物試劑有限公司；頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松和氨曲南藥敏片購自杭州天和微生物試劑有限公司；頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟和慶大霉素抗生素干粉購自哈藥集團(tuán)制藥總廠；質(zhì)粒提取試劑盒（TaKaRa Mini BEST Plasmid Purification kit）購自QIAGEN公司；核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)品購自TIANGEN生化科技有限公司；Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs購自TaKaRa公司；DNA凝膠回收、純化試劑盒購自長春百奧生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖購自Spanish公司；溴化乙錠（EB）購自北京愛普華美生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)ESBL菌株的鑒定 根據(jù)CLSI(CLSI，2012)推薦使用的ESBLs初篩實驗方法進(jìn)行，MH瓊脂培養(yǎng)基接種待測大腸桿菌，選用頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松和氨曲南按照標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法進(jìn)行操作，記錄各紙片抑菌環(huán)直徑與標(biāo)準(zhǔn)對比進(jìn)行初篩（見表1）。

表1 初篩ESBL表型解釋標(biāo)準(zhǔn)

只要其中有一種或一種以上抗生素紙片抑菌直徑符合上述標(biāo)準(zhǔn)可視為ESBLs可疑株。將可疑菌株按0.5麥?zhǔn)蠞岫仍俅瓮坎糓H平板上，按照標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法進(jìn)行操作，選用頭孢他啶、頭孢他啶／克拉維酸、頭孢噻肟、頭孢噻肟／克拉維酸進(jìn)行ESBL表型確證實驗（見表2）。

表2 確證ESBL表型解釋標(biāo)準(zhǔn)

1.2.2 ESBLs耐藥基因的擴(kuò)增 由于大多數(shù)的ESBL基因被證實是定位在質(zhì)粒上，使用質(zhì)粒提取試劑盒（TaKaRa Mini BEST Plasmid Purification kit）提取確認(rèn)為ESBLs的大腸桿菌的質(zhì)粒并純化，然后PCR擴(kuò)增blaTEM，blaSHV和blaCTX-M，引物由invitrogen公司合成（見表3）。

表3 本實驗使用的引物

反應(yīng)條件分別為：

SHV和TEM；94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s、48℃退火30s、72℃延伸1min，共30個循環(huán)；72℃再延伸10min。

CTX-M：94℃預(yù)變性7min；94℃變性50s、50℃退火40s、68℃延伸1min，共35個循環(huán)；68℃再延伸5min。

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色（0.5μg/mL），觀察結(jié)果。

對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后連接至T載體(Promega)，測序。通過BLAST進(jìn)行網(wǎng)上序列分析。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)ESBL大腸桿菌的鑒定 經(jīng)鑒定，確認(rèn)55個分離株中有46株大腸桿菌呈ESBLs表型。

2.2 ESBLs耐藥基因的擴(kuò)增 經(jīng)測序，比對分析，在46株呈ESBLs表型的大腸桿菌中，37株攜帶至少一種bla基因。26株攜帶TEM-1基因；32個分離株攜帶CTX-M基因，其中16株攜帶CTX-M-15，10株攜帶CTX-M-55，6株攜帶CTX-M-3基因（見圖1）。沒有分離到攜帶blaSHV基因的大腸桿菌。

圖1 病雞大腸桿菌CTX-M和TEM基因的檢測（部分結(jié)果）a泳道1-4：CTX-M；b泳道5-7：TEM

3 討論

隨著家禽的β-內(nèi)酰胺類抗生素如阿莫西林和頭孢菌素類，尤其是超廣譜頭孢菌素類的廣泛使用，在革蘭氏陰性桿菌由ESBL介導(dǎo)的耐藥性越來越危險，這類感染的治療選擇變得受限。為了了解ESBL在動物相關(guān)細(xì)菌中的流行，限制這些MDR生物在獸醫(yī)環(huán)境中的傳播，對產(chǎn)ESBL細(xì)菌進(jìn)行檢測很重要。在本研究中，83.64 %(46/55)的分離株為產(chǎn)ESBLs大腸桿菌。46個ESBL表型陽性的大腸桿菌中有37株(80.43%)攜帶bla基因。在這37個分離株中，檢測到32株(69.57%)攜帶bla CTX-M，26株(56.52 %)攜帶blaTEM基因。37個分離株中有21株菌同時攜帶2種bla基因(blaTEM和blaCTX-M)。沒有分離到攜帶blaSHV基因的菌株。這些研究結(jié)果表明，在雞大腸桿菌分離株中，blaTEM和blaCTX-M基因為兩種主要的ESBL類型，CTX-M型的β-內(nèi)酰胺酶正在中國抗生素耐藥中發(fā)揮越來越重要的作用。此外，這些研究結(jié)果還表明TEM-1是在中國雞大腸桿菌中最常見的β-內(nèi)酰胺酶。

研究還表明，在46個產(chǎn)ESBL的大腸桿菌分離株中，blaCTX-M基因編碼CTX-M-15、CTX-M-55和CTX-M-3的檢出率分別為34.78%、21.74%和13.04%，表明在不同CTX-M-型β-內(nèi)酰胺酶廣泛地分布于黑龍江的雞大腸桿菌分離株。