匡 爽,彭 靜,田 佳,吳明智,明 新

(成都醫(yī)學院藥學院,四川 成都 610500)

0 引言

天然修飾DNA不像天然修飾RNA那樣化學種類繁多、普遍存在.到目前為止，已發(fā)現的天然修飾DNA約有十幾種[1-2].在細菌中發(fā)現的硫代磷酸酯修飾的DNA骨架在不同的生物體中發(fā)揮著不同的功能[3-6].這些修飾的DNA似乎有特殊的標記，以避免被自身的酶系統(tǒng)降解，并可以在調節(jié)基因表達(如熱穩(wěn)定性和轉錄調節(jié)等)方面發(fā)揮關鍵作用[7].L.M. Iyer等[8]通過計算機預測，提出在細菌和噬菌體中有十幾種新型DNA修飾系統(tǒng),這表明DNA修飾的潛在多樣性和復雜性還有待檢測.7-脫氮嘌呤(7-deazapurine)作為微生物的代謝物天然存在于自然界中[9],由于其廣泛的生物活性而受到人們的關注[10].如7-脫氮-2′-脫氧鳥苷和7-脫氮-2′-脫氧腺苷是有效的端粒酶抑制劑[11],它們能被DNA聚合酶識別而鏈入DNA中，并被用于DNA測序[12-14].由于7-脫氮嘌呤與天然嘌呤結構相似，所以它們可與嘧啶形成穩(wěn)定的堿基對[15].7-氰基-7-脫氮-2′-脫氧鳥苷(dPreQ0)和7-氨基-7-脫氮-2′-脫氧鳥苷(dADG)首次在腸道沙門氏菌血清蒙得維的亞的DNA酶水解產物中被發(fā)現[16],最近又分別在噬菌體和細菌DNA中被發(fā)現[17].PreQ0是由GTP經合成酶(FolE、QueD、QueE和QueC)合成后再進行轉糖基化得到的，而dG+是由PreQ0在酶作用下轉化而來的.本文用化學方法制備天然修飾的7-甲脒基-7-脫氮-2′-脫氧鳥苷(2′-脫氧古鳥苷,dG+),以進一步研究這些修飾核苷在生物合成過程中以及在DNA和RNA之間的作用.優(yōu)化了dG+關鍵前體dPreQ0的合成,報道了dG+的化學合成,并通過核磁共振和HR-MS證實了其結構(見圖1).天然修飾DNA的合成將為生物技術的發(fā)展和新型抗菌劑的開發(fā)提供支持.

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

實驗所用儀器有:核磁共振波譜儀,Avance 400型(DMSO為溶劑,TMS為內標),瑞士布魯克公司;Agilent 6230B液質聯用儀,安捷倫科技(中國)有限公司.實驗所用試劑均為市售分析純.

1.2 合成方法

1.2.1 關鍵中間體dPreQ0(3)的合成 4-氯-5-碘-2-特戊酰氨基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(3)的合成:將5.00 g(29.66 mmol)2-氨基-4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶(1)溶解在100 mL吡啶中,在冰浴冷卻下緩慢滴加10.70 g(88.98 mmol)特戊酰氯，并使混合物在室溫下反應12 h.待反應結束后,在冰浴冷卻下向反應體系中添加250 mL飽和NaHCO3水溶液,并攪拌30 min.然后將混合物用二氯甲烷(60 mL×3)萃取，合并有機部分,用鹽水洗滌并用無水Na2SO4干燥.真空濃縮有機部分，得到化合物2,為黃色粉末.再將5.96 g(26.67 mmol)N-碘琥珀酰亞胺(NIS)加入攪拌的化合物2(6.11 g,25.71 mmol)的二氯甲烷(80 mL)溶液中,并在室溫下反應3 h.待反應完成后，將混合物用1 mol·L-1的H2SO3洗滌至無色.將有機部分濃縮至干，殘余物用乙醇重結晶即得黃色粉末狀的化合物3(7.97 g,產率70.98%,2步).Rf=0.80(V(CH2Cl2)∶V(MeOH)=20∶1);1H NMR(400 MHz,DMSO-d6):12.73(s,1H,NH),10.14(s,1H,CONH),7.79(s,1H,6H),1.24(s,9H,3CH3).該數據與文獻[18]相同.HR-MS:378.982 3([M+H]+,C11H13ClN4O+;cald 378.981 7).

圖1 dG+和dPreQ0的化學結構

圖2 dG+1H-NMR譜圖

圖3 dG+13C-NMR譜圖

圖4 dG+ MS譜圖

2 結果與討論

dPreQ0是2′-脫氧古鳥苷的關鍵中間體,dPreQ0的合成最早由文獻[20]報道,以2-氨基-4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶為底物(1),合成路線如圖5所示[21].每個化合物都用柱色譜法純化，耗費了大量的時間和溶劑.因此，本文對dPreQ0及其中間體的合成進行了優(yōu)化.

根據文獻[20]報道,化合物3由2-氨基-4-氯-吡咯并[2,3-d]嘧啶先經特戊酰氯?；俳汵-碘代琥珀酰亞胺碘化得到，2步反應均采用硅膠柱分離純化.由于碘代物溶解性差，用色譜法純化會消耗大量溶劑，因此本文采用工業(yè)上最常用的萃取和重結晶方法來分離純化.在酰化反應完成后用二氯甲烷萃取，有機相經蒸干后直接用于碘代反應,避免了過柱純化.在碘代反應完成后用稀亞硫酸鈉水溶液淬滅剩余的NIS，用甲醇重結晶，2步的產率為60.8%.若改用乙醇重結晶,則產率為70.9%，文獻[21]的產率為71.4%(化合物2的產率為84.0%，化合物3的產率為85.0%).本文通過萃取和乙醇重結晶得到目標產物，該純化方法減少了有機溶劑的使用和時間的消耗.

7-碘-2′-脫氧-7-脫氮鳥苷(6)是dPreQ0的前體.化合物6的合成路線(見圖6)主要有2條:(i)將化合物4與甲醇鈉進行親核取代反應，然后再與2 mol·L-1的NaOH進行反應[22];(ii)用Cs2CO3、三乙二胺(TED)和Et3N將化合物4的4位氯基變成羰基，然后在強堿條件下除去保護基[23].與路線(i)相比，路線(ii)所需試劑昂貴且合成時間更長,因此,本文采用合成路線(i)制備化合物6.將4-氯-5-碘-2-特戊酰基氨基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(3)與1-氯-3,5-二-(對-甲苯氧基)-2-脫氧核糖進行糖基化，得到β-D-核苷(4),將化合物4在0.03 mol·L-1的甲醇鈉中回流制備化合物5.對于這些化合物，在文獻[22]中每步都通過硅膠柱色譜法純化.本文實驗發(fā)現將糖苷化反應混合物pH值調節(jié)為7，并用二氯甲烷萃取可以得到粗產物4.它可以直接用于合成化合物5，并且化合物5可以用乙酸乙酯從反應液中萃取出來，直接用于化合物6的制備.由于化合物6的極性較高，用硅膠柱分離會消耗大量溶劑,所以本文選擇用樹脂AB-8代替硅膠色譜，以純水和乙醇為流動相.

注:試劑和條件為(a)PivCl,Py,0 ℃,12 h;(b)NIS,DCM,r.t.,3 h;(c)NaH,MeCN,r.t.,2 h;(d)NaOMe,MeOH,reflex,3 h;(e)2 mol·L-1 NaOH,reflux,2 h;(f)CuCN,Py,120 ℃,7 h.

圖6 7-碘-2′-脫氧-7-脫氮鳥苷的合成路線

在合成化合物dPreQ0時，考慮到氰化亞銅的毒性及其對環(huán)境的污染，決定減少它的用量，設置不同當量進行反應.實驗發(fā)現:將氰化亞銅的當量從7降低到5可以基本保持產率不變，合理減少了氰化亞銅的用量(見圖7).

為了將氰基轉變?yōu)榧纂呋苽?′-脫氧古鳥苷，首先想到Pinner反應.文獻[24]用該反應制備古鳥苷，得到古鳥苷和三乙胺醋酸(2∶1)的混合物，產率為30%.經典的Pinner反應是在HCl氣體催化下，腈基首先醇解得到亞胺酸酯中間體,然后氨解得到產物.但通HCl氣體，操作方法煩瑣，并對設備會造成很大的腐蝕.因此，筆者嘗試用甲醇鈉作堿來催化制備亞胺酸酯中間體.實驗發(fā)現用堿催化反應條件雖然溫和，但是原料在室溫下4 d也不能反應完全.因此，對通HCl氣體催化的方法進行了優(yōu)化,其過程如下:在冰浴冷卻下，將乙酰氯滴加至甲醇中產生HCl催化氰基轉化為亞胺酸甲酯，然后該中間體在3.5 mol·L-1氨甲醇中反應過夜，在反應結束后，揮去氨氣，2′-脫氧古鳥苷直接從甲醇中析出得到目標化合物2′-脫氧古鳥苷，產率為92.59%.合成路線如圖8所示.

3 結論

本文用簡單有效的方法成功合成了天然核苷dG+，并對關鍵中間體dPreQ0的合成工藝進行了優(yōu)化.以2-氨基-4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶為起始物，經7個步驟合成dG+的總產率為33%,并以更環(huán)保的方式獲得了中間體.dPreQ0和dG+的合成為天然修飾DNA的合成提供了一條有價值的途徑.

圖7 氰化亞銅當量對dPreQ0產率的影響

注:試劑和條件為(a)AcCl,MeOH,r.t.,6 h;3.5 mol·L-1 NH3/MeOH,r.t.,overnight.