劉雪，張莉娟，趙廣榮

（1天津大學(xué)化工學(xué)院，教育部合成生物學(xué)前沿科學(xué)中心，系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津 300350；2天津大學(xué)佐治亞理工深圳學(xué)院，廣東 深圳 518055）

引 言

大豆苷元是大豆中最重要的異黃酮之一，具有抗氧化、抗炎等多種生物活性[1]。此外，大豆苷元在神經(jīng)保護[2]、腎臟保護[3]和改善肥胖相關(guān)炎癥[4]等方面均有助益，在醫(yī)藥和保健品等行業(yè)展現(xiàn)出巨大應(yīng)用潛力。然而，作為大豆苷元的主要來源，大豆生產(chǎn)的異黃酮含量非常低，而且植物提取方法獲得的產(chǎn)物往往純度低，過程耗時，生產(chǎn)效率低[5-6]。隨著合成生物學(xué)和代謝工程的快速發(fā)展，越來越多的高附加值天然產(chǎn)物可以用細胞工廠生產(chǎn)，如紫杉二烯[7]和青蒿酸[8]，為大豆苷元的綠色、高效合成提供了新思路。

大豆苷元的生物合成源自芳香氨基酸途徑，在工程大腸桿菌中，可分為對香豆酸、甘草素和大豆苷元三個模塊（圖1）。本實驗室在前期研究中完成了三個模塊的構(gòu)建。其中，對香豆酸模塊采用約氏黃桿菌（Flavobacterium johnsoniaeu）來源的酪氨酸解氨酶FjTAL，將酪氨酸轉(zhuǎn)化為對香豆酸。甘草素模塊由擬南芥（Arabidopsis thaliana）來源的對香豆酰-CoA 連接酶At4CL、燈盞花（Erigeron breviscapus）來源的查爾酮合成酶EbCHS、矮牽牛（Petunia hybrid）來源的查爾酮異構(gòu)酶類似蛋白PhCHIL、紫花苜蓿（Medicago sativa）來源的查爾酮還原酶MsCHR 和細枝真桿菌（Eubacterium ramulus）來源的查爾酮異構(gòu)酶ErCHI組成，將對香豆酸轉(zhuǎn)化為甘草素。PhCHIL 可以減少CHS的混雜性[9]，提高甘草素的產(chǎn)量。大豆苷元模塊由N端截短并添加親水序列KKK的甘草（Glycyrrhiza echinata）來源的IFS（KKK-GetIFS）[10]、N 端截短并添加疏水序列17A 后的百脈根（Lotus japonicus）來源的CPR（17A-LjtCPR）[10]和大豆（Glycine max）來源的GmHID 組成，將甘草素轉(zhuǎn)化為大豆苷元。由于CHR催化的低效性，產(chǎn)生柚皮素查爾酮，經(jīng)CHI、IFS 和CPR的催化生成副產(chǎn)物柚皮素和染料木素（圖1）。

圖1 代謝工程改造大腸桿菌從頭合成大豆苷元紅叉表示敲除的基因;實線箭頭表示一步反應(yīng),虛線箭頭表示多步反應(yīng),黑色箭頭表示大腸桿菌內(nèi)源途徑,彩色箭頭表示大豆苷元合成途徑,灰色箭頭表示副產(chǎn)物合成途徑;G6P—葡萄糖6-磷酸;E4P—赤蘚糖4-磷酸;PEP—磷酸烯醇式丙酮酸;DAHP—3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸Fig.1 Metabolic engineering E.coli for the de novo biosynthesis of daidzein

在釀酒酵母中構(gòu)建大豆苷元合成途徑，以葡萄糖為碳源實現(xiàn)了大豆苷元的合成[11]。但在重組大腸桿菌中，大豆苷元的合成鮮有報道，甚至前體甘草素的合成也進展緩慢。添加酪氨酸和對香豆酸前體，重組大腸桿菌分別合成1.84 和17.1 mg/L 甘草素[12-13]。多個外源基因引起代謝負擔過重可能是阻礙大腸桿菌中大豆苷元從頭合成的重要原因。大腸桿菌共培養(yǎng)系統(tǒng)因其模塊化的特點，在減輕代謝負擔、減少途徑間的相互干擾等方面具有獨特優(yōu)勢[14-15]，有望實現(xiàn)大豆苷元的從頭合成。但同時，共培養(yǎng)系統(tǒng)容易出現(xiàn)碳源競爭、生長拮抗等現(xiàn)象，引起菌群不穩(wěn)定，生長和生產(chǎn)不平衡[16]。將菌群間的競爭關(guān)系轉(zhuǎn)變?yōu)槠墓采P(guān)系，有助于維持共培養(yǎng)系統(tǒng)的穩(wěn)定和平衡。在偏利共生的共培養(yǎng)系統(tǒng)中，一種菌對另一種菌有利，而其本身不受另一種菌的影響。細胞代謝物如芳香酸或單糖可以作為構(gòu)建偏利共培養(yǎng)系統(tǒng)的橋梁。例如，大腸桿菌-谷氨酰胺谷桿菌雙菌系統(tǒng)合成賴氨酸時，以蔗糖為唯一碳源，大腸桿菌不能利用蔗糖，谷氨酰胺谷桿菌利用蔗糖并分泌果糖作為大腸桿菌的碳源，形成偏利共生的雙菌系統(tǒng)[17]。大腸桿菌三菌系統(tǒng)合成綠原酸時，將綠原酸合成途徑分為咖啡酸、奎寧酸和綠原酸三個模塊，奎寧酸合成菌株無法合成3-去氫莽草酸（DHS），通過表達轉(zhuǎn)運蛋白ShiA，轉(zhuǎn)運咖啡酸菌株生產(chǎn)的DHS而生存，形成偏利共生的三菌系統(tǒng)[18]。

本研究以苯丙氨酸營養(yǎng)供給為橋梁，構(gòu)建偏利的共培養(yǎng)系統(tǒng)從頭合成大豆苷元。首先，將對香豆酸模塊和甘草素模塊分配到兩株大腸桿菌中，構(gòu)建的雙菌系統(tǒng)合成甘草素。增加大豆苷元模塊，探索三種模塊的分配模式，從頭合成大豆苷元。對香豆酸合成菌株是苯丙氨酸缺陷型，強化前體酪氨酸的代謝途徑，增加對香豆酸的供給。在M9 培養(yǎng)基中，對香豆酸合成菌株依靠其他菌株提供的苯丙氨酸生長，形成偏利共生的菌群關(guān)系，平衡了代謝途徑。本研究構(gòu)建的偏利共培養(yǎng)系統(tǒng)可成為其他黃酮類化合物生物合成的平臺。

1 實驗材料和方法

1.1 工具酶與試劑

大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞購自博邁德生物技術(shù)有限公司，Phanta Super Fidelity 高保真DNA 聚合酶和Rapid Taq Master Mix 快速DNA 聚合酶購自南京諾維贊生物科技有限公司，限制性內(nèi)切酶購自Thermo Scientific，T4 DNA 連接酶購自NEB，質(zhì)粒小提試劑盒、普通DNA 產(chǎn)物純化回收試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購自天根生化科技有限公司，HPLC 純度的甲醇、乙腈、甲酸、乙酸和乙酸乙酯購自天津市康科德科技有限公司，對香豆酸、柚皮素、甘草素和大豆苷元標準品（純度≥98%）購自天津希恩思生化科技有限公司。

1.2 質(zhì)粒和菌株的構(gòu)建

本研究中所用外源基因，包括FjTAL，At4CL，EbCHS，PhCHIL，MsCHR，ErCHI，GeIFS，LjCPR和GmHID經(jīng)大腸桿菌密碼子優(yōu)化后，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。mCherry 和EGFP 基因為實驗室保存。為了構(gòu)建pLLQ4R，利用Cherry-CDF-F/Cherry-CDF-R 引物對將編碼紅色熒光蛋白mCherry的基因，擴增下來利用同源重組試劑盒連接到pLLQ4 上；為了構(gòu)建pLDZ3，利用(KKK) GetIFS-F/GetIFS-R 引物和GmHID-F/GmHID-R 引物對將KKKGetIFS 和 GmHID 通過雙酶切連接在pCDFDuet-1 的NdeI、XhoI 和EcoRI、HindIII 位點；為了構(gòu)建pLDZ5，將KKK-GetIFS和GmHID基因序列從pLDZ3 上擴增下來，通過雙酶切連接在pLCA1 的BglII 和XhoI 位點。本研究所用菌株及質(zhì)粒見表1，所用引物見表2。

表1 本研究所用菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)

本研究中所有大腸桿菌種子液的培養(yǎng)均使用LB 培養(yǎng)基。1 L LB 液體培養(yǎng)基含有10 g 胰蛋白胨、10 g 氯化鈉和5 g 酵母粉。LB 固體培養(yǎng)基需額外添加15 g/L 瓊脂粉。除非特別說明，本研究中單培養(yǎng)系統(tǒng)的發(fā)酵使用M9Y 培養(yǎng)基，偏利共生的共培養(yǎng)系統(tǒng)發(fā)酵使用M9 培養(yǎng)基。1 L M9 培養(yǎng)基含有17.1 g Na2HPO4·12H2O、3 g KH2PO4、0.5 g NaCl、1 g NH4Cl、5 mmol/L MgSO4和0.1 mmol/L CaCl2。向M9 培養(yǎng)基中加入1 g/L酵母粉，配制M9Y培養(yǎng)基。

挑取平板上的單菌落或吸取冷凍保存的甘油菌，按1%比例接種至4 ml 新鮮LB 液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min 過夜培養(yǎng)，復(fù)蘇活化。按1%接種量轉(zhuǎn)接至100 ml 新鮮LB 液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min 培養(yǎng)8～10 h 后，轉(zhuǎn)移至50 ml 離心管中于4500 r/min下離心5 min，收集菌體。用5 ml M9培養(yǎng)基清洗菌體，以去除殘留的LB培養(yǎng)基。將清洗后的菌體懸浮，接種至含發(fā)酵培養(yǎng)基的250 ml 搖瓶中，并控制每瓶初始生物量相同，一般初始OD 為1。共培養(yǎng)時將各菌株的種子液按比例接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，并控制每瓶總初始生物量相同。添加10 g/L 葡萄糖作碳源。發(fā)酵開始時添加0.1 mmol/L IPTG 及相應(yīng)的抗生素，抗生素的工作濃度為：50 μg/L 硫酸鏈霉素，50 μg/L 氯霉素，100 μg/L 氨芐青霉素，50 μg/L硫酸卡那霉素。

1.4 代謝物檢測

發(fā)酵液中菌體的生物量通過TU-1810 紫外-可見分光光度計在600 nm 下的光吸收強度來表征（即OD600）。發(fā)酵液中殘余的葡萄糖用S-10生物傳感器分析儀測定。對香豆酸、柚皮素、甘草素和大豆苷元使用高效液相色譜（HPLC）定量分析。樣品處理過程：取3 ml 菌液，與3 ml 乙酸乙酯混合，振蕩2 h，離心取1 ml 上清，旋蒸至乙酸乙酯完全蒸發(fā)，取500 μl 甲醇溶解產(chǎn)物，過0.22 μm 有機系濾膜。樣品 用PDA 檢 測 器（HITACHI 1410 UV detector,Japan）檢 測，使 用Thermo Scientific C18色 譜 柱（150 mm×4.6 mm，孔徑5 μm），上樣量10 μl。檢測柚皮素和甘草素流動相為30%乙腈，70%水，0.5%乙酸，流速1 ml/min，波長為290 nm；檢測染料木素和大豆苷元流動相為40%甲醇，60%水，0.1%甲酸，流速1 ml/min,波長250 nm。

1.5 共培養(yǎng)系統(tǒng)群體比例的測定

為了測定共培養(yǎng)系統(tǒng)的群體比例，用綠色熒光蛋白EGFP 標記LCA2 菌株，紅色熒光蛋白mCherry標記LLQ4 菌株，通過流式細胞儀（BD AriaⅢ）檢測確定菌株比例。具體操作過程：取1 ml 發(fā)酵液，離心去除上清，用PBS 清洗菌體后重新懸浮，稀釋

100 倍后用于檢測。將LCA2G 和LLQ4R 的單培養(yǎng)發(fā)酵液樣品作為陽性對照，LDZ11 的單培養(yǎng)發(fā)酵液樣品作為陰性對照。每個樣品取50000 個事件，結(jié)果用FlowJo(Treestar)分析。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 構(gòu)建共培養(yǎng)系統(tǒng)從頭合成甘草素

甘草素是合成大豆苷元的重要前體。為了確保甘草素的充足供應(yīng)，本研究首先嘗試從頭合成甘草素。將甘草素模塊表達在高產(chǎn)對香豆酸底盤中，構(gòu)建甘草素從頭合成菌株LLQ5。如圖2(a)所示，LLQ5在M9Y 培養(yǎng)基中發(fā)酵72 h，可合成31.8 mg/L 甘草素。除了甘草素，培養(yǎng)基中還檢測到產(chǎn)量相當?shù)蔫制に?，這與現(xiàn)有報道一致，以釀酒酵母[21]或解脂耶氏酵母[22]為宿主合成甘草素時也出現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。有研究表明中間產(chǎn)物對香豆酰-CoA 對TAL 活性有抑制作用[23]。將對香豆酸模塊和柚皮素模塊分配到兩株大腸桿菌中，既可以減輕菌株的代謝負擔，又可以減少對香豆酰-CoA和TAL的接觸機會，最大限度地避免抑制作用，這種共培養(yǎng)策略已用在花青素、櫻花素和山柰素等黃酮類化合物的微生物合成中[24-26]。

本研究將表達對香豆酸模塊的菌株LCA2 與表達甘草素模塊的菌株LLQ4 在M9Y 培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，為了區(qū)分兩種菌株，將LCA2 用綠色熒光蛋白EGFP 標記，將LLQ4 用紅色熒光蛋白mCherry 標記，從而構(gòu)建LCA2G-LLQ4R 共培養(yǎng)系統(tǒng)。其中，LCA2G 負責從葡萄糖合成對香豆酸，LLQ4R 負責將對香豆酸轉(zhuǎn)化成甘草素[圖2(b)]。在不同的接種比例條件下測試了LCA2G-LLQ4R 共培養(yǎng)系統(tǒng)從頭合成甘草素的能力，如圖2(c)所示，在LCA2G與LLQ4R比例為1∶4 時，甘草素產(chǎn)量最高，達到57.5 mg/L，比LLQ5單培養(yǎng)系統(tǒng)的產(chǎn)量提高80.8%。

圖2 構(gòu)建LCA2G-LLQ4R共培養(yǎng)系統(tǒng)在M9Y培養(yǎng)基中從頭合成甘草素(a)LLQ5單培養(yǎng)系統(tǒng)從頭合成甘草素的動態(tài)曲線;(b)LCA2G-LLQ4R共培養(yǎng)系統(tǒng)的設(shè)計;(c)LCA2G-LLQ4R共培養(yǎng)系統(tǒng)接種比例優(yōu)化Fig.2 Engineering of LCA2G-LLQ4R coculture for de novo biosynthesis of liquiritigenin in M9Y medium

但是，共培養(yǎng)系統(tǒng)還帶來了對香豆酸的大量積累。雖然隨著LLQ4R 接種比例的提高，對香豆酸逐漸減少，但在最佳比例1∶4時，仍有279.2 mg/L，說明對香豆酸模塊的合成能力要強于甘草素模塊，并且這種途徑的不平衡無法通過接種比例的優(yōu)化來解決。

2.2 構(gòu)建偏利共培養(yǎng)系統(tǒng)從頭合成甘草素

生態(tài)學(xué)上，想要一個菌群穩(wěn)定，需要強者依靠弱者生存，而不是要弱者依靠強者[27]。類似地，在LCA2G-LLQ4R 共培養(yǎng)系統(tǒng)中，如果合成能力強的LCA2G 菌株需要依靠合成能力弱的LLQ4R 菌株生長，或許能夠?qū)崿F(xiàn)途徑的平衡。為了驗證這種猜想，本研究構(gòu)建了偏利共生的LCA2G-LLQ4R 雙菌系統(tǒng)。為了高產(chǎn)酪氨酸和對香豆酸，LCA2G 基因組上的pheA基因被敲除，是苯丙氨酸缺陷型[19]。因此LCA2G 在M9 培養(yǎng)基中無法獨立生長，需要依靠LLQ4R產(chǎn)生的苯丙氨酸生長[圖3(a)]。

本研究探索了不同的接種比例對LCA2GLLQ4R 共培養(yǎng)系統(tǒng)在M9 培養(yǎng)基中合成甘草素的影響。如圖3(b)所示，隨著接種時LCA2G∶LLQ4R的比例由4∶1 逐漸向1∶4 轉(zhuǎn)變，即LLQ4R 比例逐漸增高，共培養(yǎng)系統(tǒng)中對香豆酸的積累逐漸減少，說明高比例的LLQ4R菌株有利于對香豆酸的轉(zhuǎn)化。甘草素的產(chǎn)量在接種比例為2∶1 時達到最高的55.4 mg/L，與前述的傳統(tǒng)的雙菌系統(tǒng)產(chǎn)量相當，但在偏利共生的雙菌系統(tǒng)中，對香豆酸一直維持在較低的水平，不高于50 mg/L。在最佳接種比例2∶1 的條件下，對香豆酸在12～36 h 出現(xiàn)少量積累，之后被迅速轉(zhuǎn)化，到發(fā)酵結(jié)束時，發(fā)酵液中僅剩余9.6 mg/L 對香豆酸[圖3(c)]。LCA2G的比例從接種時的66.7%在前36 h內(nèi)逐漸降低到49.5%，而后有所恢復(fù)，在48 h 提高到59.0%后基本保持穩(wěn)定，說明LCA2G 依靠LLQ4R 提供的苯丙氨酸確實可以維持菌體的生長[圖3(d)]。這種人工構(gòu)建的偏利共生關(guān)系有利于穩(wěn)定群體比例，平衡代謝強度，實現(xiàn)了甘草素的從頭合成。

圖3 構(gòu)建LCA2G-LLQ4R偏利雙菌共培養(yǎng)系統(tǒng)在M9培養(yǎng)基中從頭合成甘草素(a)LCA2G-LLQ4R偏利共生共培養(yǎng)系統(tǒng)的設(shè)計;(b)LCA2G-LLQ4R共培養(yǎng)系統(tǒng)接種比例優(yōu)化(發(fā)酵72 h);(c)接種比例為2∶1時LCA2G-LLQ4R共培養(yǎng)系統(tǒng)中對香豆酸、柚皮素和甘草素產(chǎn)量的動力學(xué)曲線;(d)接種比例為2∶1時LCA2G-LLQ4R共培養(yǎng)系統(tǒng)中生物量及LCA2G群體比例的動力學(xué)曲線Fig.3 Commensalistic engineering of LCA2G-LLQ4R coculture for de novo biosynthesis of liquiritigenin in M9 medium

2.3 構(gòu)建偏利共培養(yǎng)系統(tǒng)從頭合成大豆苷元

在LCA2G-LLQ4R偏利雙菌的基礎(chǔ)上，嘗試不同的偏利共培養(yǎng)模式從頭合成大豆苷元。第一種策略是將大豆苷元模塊（KKK-GetIFS、17A-LjtCPR 和GmHID）轉(zhuǎn)化至LLQ4，和甘草素模塊共用一個宿主，得到菌株LDZ10。將LDZ10 與LCA2G 在M9 培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，構(gòu)建偏利共生LCA2G-LDZ10 共培養(yǎng)系統(tǒng)，其中LCA2G負責合成對香豆酸，LDZ10將對香豆酸轉(zhuǎn)化為甘草素，繼而轉(zhuǎn)化為大豆苷元[圖4(a)]。

圖4 構(gòu)建LCA2G-LDZ10偏利雙菌共培養(yǎng)系統(tǒng)在M9培養(yǎng)基中從頭合成大豆苷元(a)LCA2G-LDZ10共培養(yǎng)系統(tǒng)的設(shè)計;(b)LCA2G-LDZ10共培養(yǎng)系統(tǒng)接種比例優(yōu)化Fig.4 Commensalistic engineering of LCA2G-LDZ10 coculture for de novo biosynthesis of daidzein in M9 medium

如圖4(b)所示，LCA2G-LDZ10 共培養(yǎng)系統(tǒng)成功實現(xiàn)了大豆苷元的從頭合成。當LCA2G 與LDZ10接種比例由4∶1逐漸變化到1∶4，即LDZ10比例逐漸提高時，對香豆酸的積累逐漸減少，大豆苷元的產(chǎn)量逐漸提高，在1∶2 時達到最高的12.2 mg/L。在最優(yōu)接種比例1∶2時，對香豆酸積累很少，但甘草素積累達到44.7 mg/L，說明相對于甘草素模塊，大豆苷元模塊的表達強度需要進一步增強，以實現(xiàn)更平衡、高效的生產(chǎn)。這需要將大豆苷元模塊從甘草素合成菌株中獨立出來。

于是，本研究設(shè)計了第二種共培養(yǎng)策略，將大豆苷元模塊（KKK-GetIFS、17A-LjtCPR 和GmHID）轉(zhuǎn)化進入LCA2G，和對香豆酸模塊共用一個宿主，得到菌株LDZ12。這種U 型共培養(yǎng)系統(tǒng)曾被用來高效合成山柰素[26]。將LDZ12 與LLQ4R 在M9 培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，構(gòu)建偏利LDZ12-LLQ4R 共培養(yǎng)系統(tǒng)，其中LDZ12 負責合成對香豆酸，并將LLQ4R 合成的甘草素轉(zhuǎn)化為大豆苷元[圖5(a)]。在LDZ12和LLQ4R接種比例由4∶1變化到1∶4的過程中，對香豆酸和甘草素的積累一直保持在較低的水平，大豆苷元的產(chǎn)量在接種比例為2∶1時達到最高的16.9 mg/L[圖5(b)]，比第一種LCA2G-LDZ10 共培養(yǎng)系統(tǒng)的產(chǎn)量高38.5%，說明高比例的大豆苷元生產(chǎn)菌株確實有利于產(chǎn)量的提高。

圖5 構(gòu)建LDZ12-LLQ4R偏利雙菌共培養(yǎng)系統(tǒng)在M9培養(yǎng)基中從頭合成大豆苷元(a)LDZ12-LLQ4R共培養(yǎng)系統(tǒng)的設(shè)計;(b)LDZ12-LLQ4R共培養(yǎng)系統(tǒng)接種比例優(yōu)化Fig.5 Commensalistic engineering of LDZ12-LLQ4R coculture for de novo biosynthesis of daidzein in M9 medium

除了上述兩種雙菌共培養(yǎng)策略，本研究還設(shè)計了另一種共培養(yǎng)策略。將大豆苷元模塊（KKKGetIFS、17A-LjtCPR 和GmHID）獨立出來，轉(zhuǎn)化進入另一株BL21(DE3)菌株，得到大豆苷元生產(chǎn)菌株LDZ11。將LDZ11 與LCA2G、LLQ4R 在M9 培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，構(gòu)建偏利LCA2G-LLQ4R-LDZ11 三菌共培養(yǎng)系統(tǒng)從頭合成大豆苷元。這種包含兩株以上不同菌株的多菌共培養(yǎng)系統(tǒng)可以使各模塊免于其他模塊的干擾，更獨立地調(diào)控各個模塊。在化合物的合成途徑冗長復(fù)雜時，多菌共培養(yǎng)系統(tǒng)往往具有靈活、高效的優(yōu)勢，如大腸桿菌三菌共培養(yǎng)系統(tǒng)合成迷迭香酸[28]、綠原酸[18]和水飛薊賓[29]以及大腸桿菌四菌共培養(yǎng)系統(tǒng)合成花青素[30]。

在LCA2G-LLQ4R-LDZ11 共培養(yǎng)系統(tǒng)中，LCA2G 負責合成對香豆酸，LLQ4R 將對香豆酸轉(zhuǎn)化為甘草素，LDZ11 最后將甘草素轉(zhuǎn)化為大豆苷元。LLQ4R 和LDZ11 將共同為LCA2G 提供生長所需的苯丙氨酸[圖6(a)]。LCA2G-LLQ4R 共培養(yǎng)系統(tǒng)在合成甘草素時的最佳接種比例為2∶1，在此基礎(chǔ)上，探索了LDZ11 菌株的接種比例對大豆苷元產(chǎn)量的影響。如圖6(b)所示，當接種比例LCA2G∶LLQ4R∶LDZ11由2∶1∶1逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)?∶1∶8時，即LDZ11的比例逐漸增大時，甘草素的積累逐漸減少，說明更多的LDZ11 菌株更有利于甘草素的轉(zhuǎn)化。大豆苷元在接種比例為2∶1∶2 時達到最高的27.8 mg/L，比LCA2G-LDZ10 和LDZ12-LLQ4R 雙菌共培養(yǎng)系統(tǒng)的產(chǎn)量分別高127.9%和64.5%。

圖6 構(gòu)建LCA2G-LLQ4R-LDZ11偏利三菌共培養(yǎng)系統(tǒng)在M9培養(yǎng)基中從頭合成大豆苷元(a)LCA2G-LLQ4R-LDZ11共培養(yǎng)系統(tǒng)的設(shè)計;(b)LCA2G-LLQ4RLDZ11共培養(yǎng)系統(tǒng)接種比例優(yōu)化Fig.6 Commensalistic engineering of LCA2G-LLQ4R-LDZ11 coculture for de novo biosynthesis of daidzein in M9 medium

2.4 偏利三菌共培養(yǎng)系統(tǒng)合成大豆苷元

三種模式的偏利共培養(yǎng)系統(tǒng)中，LCA2GLLQ4R-LDZ11 三菌共培養(yǎng)系統(tǒng)是最有效的。如圖7(a)、(b)所示，在最佳接種比例2∶1∶2，LCA2GLLQ4R-LDZ11 共培養(yǎng)系統(tǒng)在M9 培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h，大豆苷元持續(xù)增加到24.1 mg/L 后維持穩(wěn)定，甘草素一直維持在很低的水平（20 mg/L 以下）。共培養(yǎng)系統(tǒng)的生物量從開始的OD 為1 到48 h 增長到5.7，其中對香豆酸生產(chǎn)菌株LCA2G 的群體比例穩(wěn)中有降，從開始時的40%到48 h 時逐漸減少為21.3%；大豆苷元生產(chǎn)菌株LDZ11 的群體比例穩(wěn)中有升，從開始的40%到48 h時逐漸增加到68.6%；甘草素生產(chǎn)菌株LLQ4R 的群體比例基本維持穩(wěn)定，在20%左右。將甘草素和大豆苷元模塊表達在對香豆酸底盤中，構(gòu)建大豆苷元從頭合成菌株LDZ8，在M9Y 培養(yǎng)基中發(fā)酵72 h，LDZ8 單培養(yǎng)系統(tǒng)合成2.7 mg/L 大豆苷元[圖7(c)]。與之相比，LCA2GLLQ4R-LDZ11 偏利三菌系統(tǒng)將大豆苷元的產(chǎn)量提高了8 倍，說明了共培養(yǎng)系統(tǒng)更適合用于大豆苷元的生物合成。

圖7 LCA2G-LLQ4R-LDZ11偏利三菌共培養(yǎng)系統(tǒng)在M9培養(yǎng)基中合成大豆苷元的動態(tài)曲線(a)接種比例2∶1∶2時LCA2G-LLQ4R-LDZ11共培養(yǎng)系統(tǒng)在M9培養(yǎng)基中合成的對香豆酸、柚皮素、甘草素和大豆苷元產(chǎn)量的動力學(xué)曲線;(b)接種比例2∶1∶2時LCA2G-LLQ4R-LDZ11共培養(yǎng)系統(tǒng)在M9培養(yǎng)基中的生物量和群體比例的動力學(xué)曲線;(c)LDZ8單培養(yǎng)系統(tǒng)在M9Y培養(yǎng)基中合成大豆苷元Fig.7 The time profile of commensalistic LCA2G-LLQ4RLDZ11 coculture for biosynthesis of daidzein in M9 medium

相較于LCA2G-LLQ4R 偏利雙菌系統(tǒng)，此三菌體系中菌群變化更為劇烈，可能是因為菌群間相互作用的減少。其中LDZ11 的群體比例增長幅度較大，LCA2G-LLQ4R-LDZ11 三菌系統(tǒng)中大豆苷元產(chǎn)量的提高，很大一部分歸功于LDZ11 較高的群體比例，使甘草素得到了更有效的轉(zhuǎn)化。除了偏利共生的菌群關(guān)系，以后的研究可以利用碳源代謝[31]、能量代謝[29]或群體感應(yīng)[32]增加菌群間的相互作用，實現(xiàn)群體比例的動態(tài)調(diào)控，增強共培養(yǎng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

此前，Nielsen 等[11]在釀酒酵母中表達大豆來源的CHS、CHR、CHI 和HID 以及甘草來源的IFS 構(gòu)建大豆苷元合成途徑，達到了目前報道的最高產(chǎn)量85.4 mg/L。它的高產(chǎn)一部分得益于甘草素底盤菌株較高的甘草素供給（77.7 mg/L）和較低的柚皮素副產(chǎn)物積累（約11.5 mg/L），在其他研究中，柚皮素和甘草素的比例在1∶1 左右[22]。本研究中的主要副產(chǎn)物也是柚皮素，幾乎沒有染料木素。大豆來源的CHS、CHR 和CHI 在釀酒酵母中會和大豆植物中一樣，通過相互作用形成酶復(fù)合物[33]，提高底物的傳遞效率，減少柚皮素的合成。增強細胞中丙二酰-CoA的供給也有助于大豆苷元的合成[11]，后續(xù)可以在共培養(yǎng)系統(tǒng)中使用丙二酰-CoA的調(diào)控策略，進一步提高大豆苷元的產(chǎn)量。此外，大豆苷元的7-O-葡萄糖苷和8-C-葡萄糖苷葛根素具有多種生物活性[34-35]。利用共培養(yǎng)系統(tǒng)即插即用的特點，可在偏利三菌的基礎(chǔ)上增加糖基供體模塊，探索適配的共培養(yǎng)系統(tǒng)模式合成大豆苷元的糖苷，并使用碳源分配策略，來減少苷元和糖基供體合成途徑對葡萄糖的競爭[36]。構(gòu)建互利共生的菌群關(guān)系也有望提高共培養(yǎng)系統(tǒng)穩(wěn)定性和高效性。

3 結(jié) 論

人工大腸桿菌共培養(yǎng)系統(tǒng)由于其模塊化的優(yōu)勢，在合成化學(xué)品、生物燃料和天然產(chǎn)物等眾多領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用[37]。本研究構(gòu)建了LLQ5 單菌和LCA2G-LLQ4R 雙菌系統(tǒng)從頭合成甘草素，雙菌系統(tǒng)合成57.5 mg/L 甘草素，比單菌系統(tǒng)的產(chǎn)量高80.8%。LCA2G-LLQ4R 雙菌系統(tǒng)在M9 培養(yǎng)基中通過苯丙氨酸的單向流動形成了偏利共生的菌群關(guān)系，平衡了代謝途徑，大幅降低了中間產(chǎn)物對香豆酸的積累。在LCA2G-LLQ4R 偏利雙菌系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了兩種雙菌系統(tǒng)和一種三菌系統(tǒng)來從頭合成大豆苷元。其中，三菌系統(tǒng)的大豆苷元產(chǎn)量最高，達到27.8 mg/L。各自獨立的模塊更有利于代謝途徑靈活的調(diào)控，從而提高大豆苷元的產(chǎn)量，是單培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)量的9 倍。本文構(gòu)建的共培養(yǎng)系統(tǒng)可通過模塊間的替換或增加實現(xiàn)即插即用的靈活組裝，可用于更多黃酮或其他復(fù)雜化合物的生物合成。