劉雪，張莉娟，趙廣榮

（1天津大學(xué)化工學(xué)院，教育部合成生物學(xué)前沿科學(xué)中心，系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津 300350；2天津大學(xué)佐治亞理工深圳學(xué)院，廣東 深圳 518055）

引 言

大豆苷元是大豆中最重要的異黃酮之一，具有抗氧化、抗炎等多種生物活性[1]。此外，大豆苷元在神經(jīng)保護[2]、腎臟保護[3]和改善肥胖相關(guān)炎癥[4]等方面均有助益，在醫(yī)藥和保健品等行業(yè)展現(xiàn)出巨大應(yīng)用潛力。然而，作為大豆苷元的主要來源，大豆生產(chǎn)的異黃酮含量非常低，而且植物提取方法獲得的產(chǎn)物往往純度低，過程耗時，生產(chǎn)效率低[5-6]。隨著合成生物學(xué)和代謝工程的快速發(fā)展，越來越多的高附加值天然產(chǎn)物可以用細胞工廠生產(chǎn)，如紫杉二烯[7]和青蒿酸[8]，為大豆苷元的綠色、高效合成提供了新思路。

大豆苷元的生物合成源自芳香氨基酸途徑，在工程大腸桿菌中，可分為對香豆酸、甘草素和大豆苷元三個模塊（圖1）。本實驗室在前期研究中完成了三個模塊的構(gòu)建。其中，對香豆酸模塊采用約氏黃桿菌（Flavobacterium johnsoniaeu）來源的酪氨酸解氨酶FjTAL，將酪氨酸轉(zhuǎn)化為對香豆酸。甘草素模塊由擬南芥（Arabidopsis thaliana）來源的對香豆酰-CoA 連接酶At4CL、燈盞花（Erigeron breviscapus）來源的查爾酮合成酶EbCHS、矮牽牛（Petunia hybrid）來源的查爾酮異構(gòu)酶類似蛋白PhCHIL、紫花苜蓿（Medicago sativa）來源的查爾酮還原酶MsCHR 和細枝真桿菌（Eubacterium ramulus）來源的查爾酮異構(gòu)酶ErCHI組成，將對香豆酸轉(zhuǎn)化為甘草素。PhCHIL 可以減少CHS的混雜性[9]，提高甘草素的產(chǎn)量。大豆苷元模塊由N端截短并添加親水序列KKK的甘草（Glycyrrhiza echinata）來源的IFS（KKK-GetIFS）[10]、N 端截短并添加疏水序列17A 后的百脈根（Lotus japonicus）來源的CPR（17A-LjtCPR）[10]和大豆（Glycine max）來源的GmHID 組成，將甘草素轉(zhuǎn)化為大豆苷元。由于CHR催化的低效性，產(chǎn)生柚皮素查爾酮，經(jīng)CHI、IFS 和CPR的催化生成副產(chǎn)物柚皮素和染料木素（圖1）。

圖1 代謝工程改造大腸桿菌從頭合成大豆苷元紅叉表示敲除的基因;實線箭頭表示一步反應(yīng),虛線箭頭表示多步反應(yīng),黑色箭頭表示大腸桿菌內(nèi)源途徑,彩色箭頭表示大豆苷元合成途徑,灰色箭頭表示副產(chǎn)物合成途徑;G6P—葡萄糖6-磷酸;E4P—赤蘚糖4-磷酸;PEP—磷酸烯醇式丙酮酸;DAHP—3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸Fig.1 Metabolic engineering E.coli for the de novo biosynthesis of daidzein

在釀酒酵母中構(gòu)建大豆苷元合成途徑，以葡萄糖為碳源實現(xiàn)了大豆苷元的合成[11]。但在重組大腸桿菌中，大豆苷元的合成鮮有報道，甚至前體甘草素的合成也進展緩慢。添加酪氨酸和對香豆酸前體，重組大腸桿菌分別合成1.84 和17.1 mg/L 甘草素[12-13]。多個外源基因引起代謝負擔(dān)過重可能是阻礙大腸桿菌中大豆苷元從頭合成的重要原因。大腸桿菌共培養(yǎng)系統(tǒng)因其模塊化的特點，在減輕代謝負擔(dān)、減少途徑間的相互干擾等方面具有獨特優(yōu)勢[14-15]，有望實現(xiàn)大豆苷元的從頭合成。但同時，共培養(yǎng)系統(tǒng)容易出現(xiàn)碳源競爭、生長拮抗等現(xiàn)象，引起菌群不穩(wěn)定，生長和生產(chǎn)不平衡[16]。將菌群間的競爭關(guān)系轉(zhuǎn)變?yōu)槠墓采P(guān)系，有助于維持共培養(yǎng)系統(tǒng)的穩(wěn)定和平衡。在偏利共生的共培養(yǎng)系統(tǒng)中，一種菌對另一種菌有利，而其本身不受另一種菌的影響。細胞代謝物如芳香酸或單糖可以作為構(gòu)建偏利共培養(yǎng)系統(tǒng)的橋梁。例如，大腸桿菌-谷氨酰胺谷桿菌雙菌系統(tǒng)合成賴氨酸時，以蔗糖為唯一碳源，大腸桿菌不能利用蔗糖，谷氨酰胺谷桿菌利用蔗糖并分泌果糖作為大腸桿菌的碳源，形成偏利共生的雙菌系統(tǒng)[17]。大腸桿菌三菌系統(tǒng)合成綠原酸時，將綠原酸合成途徑分為咖啡酸、奎寧酸和綠原酸三個模塊，奎寧酸合成菌株無法合成3-去氫莽草酸（DHS），通過表達轉(zhuǎn)運蛋白ShiA，轉(zhuǎn)運咖啡酸菌株生產(chǎn)的DHS而生存，形成偏利共生的三菌系統(tǒng)[18]。

本研究以苯丙氨酸營養(yǎng)供給為橋梁，構(gòu)建偏利的共培養(yǎng)系統(tǒng)從頭合成大豆苷元。首先，將對香豆酸模塊和甘草素模塊分配到兩株大腸桿菌中，構(gòu)建的雙菌系統(tǒng)合成甘草素。增加大豆苷元模塊，探索三種模塊的分配模式，從頭合成大豆苷元。對香豆酸合成菌株是苯丙氨酸缺陷型，強化前體酪氨酸的代謝途徑，增加對香豆酸的供給。在M9 培養(yǎng)基中，對香豆酸合成菌株依靠其他菌株提供的苯丙氨酸生長，形成偏利共生的菌群關(guān)系，平衡了代謝途徑。本研究構(gòu)建的偏利共培養(yǎng)系統(tǒng)可成為其他黃酮類化合物生物合成的平臺。

1 實驗材料和方法

1.1 工具酶與試劑

大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞購自博邁德生物技術(shù)有限公司，Phanta Super Fidelity 高保真DNA 聚合酶和Rapid Taq Master Mix 快速DNA 聚合酶購自南京諾維贊生物科技有限公司，限制性內(nèi)切酶購自Thermo Scientific，T4 DNA 連接酶購自NEB，質(zhì)粒小提試劑盒、普通DNA 產(chǎn)物純化回收試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購自天根生化科技有限公司，HPLC 純度的甲醇、乙腈、甲酸、乙酸和乙酸乙酯購自天津市康科德科技有限公司，對香豆酸、柚皮素、甘草素和大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）購自天津希恩思生化科技有限公司。

1.2 質(zhì)粒和菌株的構(gòu)建

本研究中所用外源基因，包括FjTAL，At4CL，EbCHS，PhCHIL，MsCHR，ErCHI，GeIFS，LjCPR和GmHID經(jīng)大腸桿菌密碼子優(yōu)化后，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。mCherry 和EGFP 基因為實驗室保存。為了構(gòu)建pLLQ4R，利用Cherry-CDF-F/Cherry-CDF-R 引物對將編碼紅色熒光蛋白mCherry的基因，擴增下來利用同源重組試劑盒連接到pLLQ4 上；為了構(gòu)建pLDZ3，利用(KKK) GetIFS-F/GetIFS-R 引物和GmHID-F/GmHID-R 引物對將KKKGetIFS 和 GmHID 通過雙酶切連接在pCDFDuet-1 的NdeI、XhoI 和EcoRI、HindIII 位點；為了構(gòu)建pLDZ5，將KKK-GetIFS和GmHID基因序列從pLDZ3 上擴增下來，通過雙酶切連接在pLCA1 的BglII 和XhoI 位點。本研究所用菌株及質(zhì)粒見表1，所用引物見表2。

表1 本研究所用菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)

本研究中所有大腸桿菌種子液的培養(yǎng)均使用LB 培養(yǎng)基。1 L LB 液體培養(yǎng)基含有10 g 胰蛋白胨、10 g 氯化鈉和5 g 酵母粉。LB 固體培養(yǎng)基需額外添加15 g/L 瓊脂粉。除非特別說明，本研究中單培養(yǎng)系統(tǒng)的發(fā)酵使用M9Y 培養(yǎng)基，偏利共生的共培養(yǎng)系統(tǒng)發(fā)酵使用M9 培養(yǎng)基。1 L M9 培養(yǎng)基含有17.1 g Na2HPO4·12H2O、3 g KH2PO4、0.5 g NaCl、1 g NH4Cl、5 mmol/L MgSO4和0.1 mmol/L CaCl2。向M9 培養(yǎng)基中加入1 g/L酵母粉，配制M9Y培養(yǎng)基。

挑取平板上的單菌落或吸取冷凍保存的甘油菌，按1%比例接種至4 ml 新鮮LB 液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min 過夜培養(yǎng)，復(fù)蘇活化。按1%接種量轉(zhuǎn)接至100 ml 新鮮LB 液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min 培養(yǎng)8～10 h 后，轉(zhuǎn)移至50 ml 離心管中于4500 r/min下離心5 min，收集菌體。用5 ml M9培養(yǎng)基清洗菌體，以去除殘留的LB培養(yǎng)基。將清洗后的菌體懸浮，接種至含發(fā)酵培養(yǎng)基的250 ml 搖瓶中，并控制每瓶初始生物量相同，一般初始OD 為1。共培養(yǎng)時將各菌株的種子液按比例接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，并控制每瓶總初始生物量相同。添加10 g/L 葡萄糖作碳源。發(fā)酵開始時添加0.1 mmol/L IPTG 及相應(yīng)的抗生素，抗生素的工作濃度為：50 μg/L 硫酸鏈霉素，50 μg/L 氯霉素，100 μg/L 氨芐青霉素，50 μg/L硫酸卡那霉素。

1.4 代謝物檢測

發(fā)酵液中菌體的生物量通過TU-1810 紫外-可見分光光度計在600 nm 下的光吸收強度來表征（即OD600）。發(fā)酵液中殘余的葡萄糖用S-10生物傳感器分析儀測定。對香豆酸、柚皮素、甘草素和大豆苷元使用高效液相色譜（HPLC）定量分析。樣品處理過程：取3 ml 菌液，與3 ml 乙酸乙酯混合，振蕩2 h，離心取1 ml 上清，旋蒸至乙酸乙酯完全蒸發(fā)，取500 μl 甲醇溶解產(chǎn)物，過0.22 μm 有機系濾膜。樣品 用PDA 檢 測 器（HITACHI 1410 UV detector,Japan）檢 測，使 用Thermo Scientific C18色 譜 柱（150 mm×4.6 mm，孔徑5 μm），上樣量10 μl。檢測柚皮素和甘草素流動相為30%乙腈，70%水，0.5%乙酸，流速1 ml/min，波長為290 nm；檢測染料木素和大豆苷元流動相為40%甲醇，60%水，0.1%甲酸，流速1 ml/min,波長250 nm。

1.5 共培養(yǎng)系統(tǒng)群體比例的測定

為了測定共培養(yǎng)系統(tǒng)的群體比例，用綠色熒光蛋白EGFP 標(biāo)記LCA2 菌株，紅色熒光蛋白mCherry標(biāo)記LLQ4 菌株，通過流式細胞儀（BD AriaⅢ）檢測確定菌株比例。具體操作過程：取1 ml 發(fā)酵液，離心去除上清，用PBS 清洗菌體后重新懸浮，稀釋

100 倍后用于檢測。將LCA2G 和LLQ4R 的單培養(yǎng)發(fā)酵液樣品作為陽性對照，LDZ11 的單培養(yǎng)發(fā)酵液樣品作為陰性對照。每個樣品取50000 個事件，結(jié)果用FlowJo(Treestar)分析。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 構(gòu)建共培養(yǎng)系統(tǒng)從頭合成甘草素

甘草素是合成大豆苷元的重要前體。為了確保甘草素的充足供應(yīng)，本研究首先嘗試從頭合成甘草素。將甘草素模塊表達在高產(chǎn)對香豆酸底盤中，構(gòu)建甘草素從頭合成菌株LLQ5。如圖2(a)所示，LLQ5在M9Y 培養(yǎng)基中發(fā)酵72 h，可合成31.8 mg/L 甘草素。除了甘草素，培養(yǎng)基中還檢測到產(chǎn)量相當(dāng)?shù)蔫制に?，這與現(xiàn)有報道一致，以釀酒酵母[21]或解脂耶氏酵母[22]為宿主合成甘草素時也出現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。有研究表明中間產(chǎn)物對香豆酰-CoA 對TAL 活性有抑制作用[23]。將對香豆酸模塊和柚皮素模塊分配到兩株大腸桿菌中，既可以減輕菌株的代謝負擔(dān)，又可以減少對香豆酰-CoA和TAL的接觸機會，最大限度地避免抑制作用，這種共培養(yǎng)策略已用在花青素、櫻花素和山柰素等黃酮類化合物的微生物合成中[24-26]。

本研究將表達對香豆酸模塊的菌株LCA2 與表達甘草素模塊的菌株LLQ4 在M9Y 培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，為了區(qū)分兩種菌株，將LCA2 用綠色熒光蛋白EGFP 標(biāo)記，將LLQ4 用紅色熒光蛋白mCherry 標(biāo)記，從而構(gòu)建LCA2G-LLQ4R 共培養(yǎng)系統(tǒng)。其中，LCA2G 負責(zé)從葡萄糖合成對香豆酸，LLQ4R 負責(zé)將對香豆酸轉(zhuǎn)化成甘草素[圖2(b)]。在不同的接種比例條件下測試了LCA2G-LLQ4R 共培養(yǎng)系統(tǒng)從頭合成甘草素的能力，如圖2(c)所示，在LCA2G與LLQ4R比例為1∶4 時，甘草素產(chǎn)量最高，達到57.5 mg/L，比LLQ5單培養(yǎng)系統(tǒng)的產(chǎn)量提高80.8%。

圖2 構(gòu)建LCA2G-LLQ4R共培養(yǎng)系統(tǒng)在M9Y培養(yǎng)基中從頭合成甘草素(a)LLQ5單培養(yǎng)系統(tǒng)從頭合成甘草素的動態(tài)曲線;(b)LCA2G-LLQ4R共培養(yǎng)系統(tǒng)的設(shè)計;(c)LCA2G-LLQ4R共培養(yǎng)系統(tǒng)接種比例優(yōu)化Fig.2 Engineering of LCA2G-LLQ4R coculture for de novo biosynthesis of liquiritigenin in M9Y medium

但是，共培養(yǎng)系統(tǒng)還帶來了對香豆酸的大量積累。雖然隨著LLQ4R 接種比例的提高，對香豆酸逐漸減少，但在最佳比例1∶4時，仍有279.2 mg/L，說明對香豆酸模塊的合成能力要強于甘草素模塊，并且這種途徑的不平衡無法通過接種比例的優(yōu)化來解決。

2.2 構(gòu)建偏利共培養(yǎng)系統(tǒng)從頭合成甘草素

生態(tài)學(xué)上，想要一個菌群穩(wěn)定，需要強者依靠弱者生存，而不是要弱者依靠強者[27]。類似地，在LCA2G-LLQ4R 共培養(yǎng)系統(tǒng)中，如果合成能力強的LCA2G 菌株需要依靠合成能力弱的LLQ4R 菌株生長，或許能夠?qū)崿F(xiàn)途徑的平衡。為了驗證這種猜想，本研究構(gòu)建了偏利共生的LCA2G-LLQ4R 雙菌系統(tǒng)。為了高產(chǎn)酪氨酸和對香豆酸，LCA2G 基因組上的pheA基因被敲除，是苯丙氨酸缺陷型[19]。因此LCA2G 在M9 培養(yǎng)基中無法獨立生長，需要依靠LLQ4R產(chǎn)生的苯丙氨酸生長[圖3(a)]。

本研究探索了不同的接種比例對LCA2GLLQ4R 共培養(yǎng)系統(tǒng)在M9 培養(yǎng)基中合成甘草素的影響。如圖3(b)所示，隨著接種時LCA2G∶LLQ4R的比例由4∶1 逐漸向1∶4 轉(zhuǎn)變，即LLQ4R 比例逐漸增高，共培養(yǎng)系統(tǒng)中對香豆酸的積累逐漸減少，說明高比例的LLQ4R菌株有利于對香豆酸的轉(zhuǎn)化。甘草素的產(chǎn)量在接種比例為2∶1 時達到最高的55.4 mg/L，與前述的傳統(tǒng)的雙菌系統(tǒng)產(chǎn)量相當(dāng)，但在偏利共生的雙菌系統(tǒng)中，對香豆酸一直維持在較低的水平，不高于50 mg/L。在最佳接種比例2∶1 的條件下，對香豆酸在12～36 h 出現(xiàn)少量積累，之后被迅速轉(zhuǎn)化，到發(fā)酵結(jié)束時，發(fā)酵液中僅剩余9.6 mg/L 對香豆酸[圖3(c)]。LCA2G的比例從接種時的66.7%在前36 h內(nèi)逐漸降低到49.5%，而后有所恢復(fù)，在48 h 提高到59.0%后基本保持穩(wěn)定，說明LCA2G 依靠LLQ4R 提供的苯丙氨酸確實可以維持菌體的生長[圖3(d)]。這種人工構(gòu)建的偏利共生關(guān)系有利于穩(wěn)定群體比例，平衡代謝強度，實現(xiàn)了甘草素的從頭合成。

圖3 構(gòu)建LCA2G-LLQ4R偏利雙菌共培養(yǎng)系統(tǒng)在M9培養(yǎng)基中從頭合成甘草素(a)LCA2G-LLQ4R偏利共生共培養(yǎng)系統(tǒng)的設(shè)計;(b)LCA2G-LLQ4R共培養(yǎng)系統(tǒng)接種比例優(yōu)化(發(fā)酵72 h);(c)接種比例為2∶1時LCA2G-LLQ4R共培養(yǎng)系統(tǒng)中對香豆酸、柚皮素和甘草素產(chǎn)量的動力學(xué)曲線;(d)接種比例為2∶1時LCA2G-LLQ4R共培養(yǎng)系統(tǒng)中生物量及LCA2G群體比例的動力學(xué)曲線Fig.3 Commensalistic engineering of LCA2G-LLQ4R coculture for de novo biosynthesis of liquiritigenin in M9 medium

2.3 構(gòu)建偏利共培養(yǎng)系統(tǒng)從頭合成大豆苷元

在LCA2G-LLQ4R偏利雙菌的基礎(chǔ)上，嘗試不同的偏利共培養(yǎng)模式從頭合成大豆苷元。第一種策略是將大豆苷元模塊（KKK-GetIFS、17A-LjtCPR 和GmHID）轉(zhuǎn)化至LLQ4，和甘草素模塊共用一個宿主，得到菌株LDZ10。將LDZ10 與LCA2G 在M9 培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，構(gòu)建偏利共生LCA2G-LDZ10 共培養(yǎng)系統(tǒng)，其中LCA2G負責(zé)合成對香豆酸，LDZ10將對香豆酸轉(zhuǎn)化為甘草素，繼而轉(zhuǎn)化為大豆苷元[圖4(a)]。

圖4 構(gòu)建LCA2G-LDZ10偏利雙菌共培養(yǎng)系統(tǒng)在M9培養(yǎng)基中從頭合成大豆苷元(a)LCA2G-LDZ10共培養(yǎng)系統(tǒng)的設(shè)計;(b)LCA2G-LDZ10共培養(yǎng)系統(tǒng)接種比例優(yōu)化Fig.4 Commensalistic engineering of LCA2G-LDZ10 coculture for de novo biosynthesis of daidzein in M9 medium

如圖4(b)所示，LCA2G-LDZ10 共培養(yǎng)系統(tǒng)成功實現(xiàn)了大豆苷元的從頭合成。當(dāng)LCA2G 與LDZ10接種比例由4∶1逐漸變化到1∶4，即LDZ10比例逐漸提高時，對香豆酸的積累逐漸減少，大豆苷元的產(chǎn)量逐漸提高，在1∶2 時達到最高的12.2 mg/L。在最優(yōu)接種比例1∶2時，對香豆酸積累很少，但甘草素積累達到44.7 mg/L，說明相對于甘草素模塊，大豆苷元模塊的表達強度需要進一步增強，以實現(xiàn)更平衡、高效的生產(chǎn)。這需要將大豆苷元模塊從甘草素合成菌株中獨立出來。

于是，本研究設(shè)計了第二種共培養(yǎng)策略，將大豆苷元模塊（KKK-GetIFS、17A-LjtCPR 和GmHID）轉(zhuǎn)化進入LCA2G，和對香豆酸模塊共用一個宿主，得到菌株LDZ12。這種U 型共培養(yǎng)系統(tǒng)曾被用來高效合成山柰素[26]。將LDZ12 與LLQ4R 在M9 培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，構(gòu)建偏利LDZ12-LLQ4R 共培養(yǎng)系統(tǒng)，其中LDZ12 負責(zé)合成對香豆酸，并將LLQ4R 合成的甘草素轉(zhuǎn)化為大豆苷元[圖5(a)]。在LDZ12和LLQ4R接種比例由4∶1變化到1∶4的過程中，對香豆酸和甘草素的積累一直保持在較低的水平，大豆苷元的產(chǎn)量在接種比例為2∶1時達到最高的16.9 mg/L[圖5(b)]，比第一種LCA2G-LDZ10 共培養(yǎng)系統(tǒng)的產(chǎn)量高38.5%，說明高比例的大豆苷元生產(chǎn)菌株確實有利于產(chǎn)量的提高。

圖5 構(gòu)建LDZ12-LLQ4R偏利雙菌共培養(yǎng)系統(tǒng)在M9培養(yǎng)基中從頭合成大豆苷元(a)LDZ12-LLQ4R共培養(yǎng)系統(tǒng)的設(shè)計;(b)LDZ12-LLQ4R共培養(yǎng)系統(tǒng)接種比例優(yōu)化Fig.5 Commensalistic engineering of LDZ12-LLQ4R coculture for de novo biosynthesis of daidzein in M9 medium

除了上述兩種雙菌共培養(yǎng)策略，本研究還設(shè)計了另一種共培養(yǎng)策略。將大豆苷元模塊（KKKGetIFS、17A-LjtCPR 和GmHID）獨立出來，轉(zhuǎn)化進入另一株BL21(DE3)菌株，得到大豆苷元生產(chǎn)菌株LDZ11。將LDZ11 與LCA2G、LLQ4R 在M9 培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，構(gòu)建偏利LCA2G-LLQ4R-LDZ11 三菌共培養(yǎng)系統(tǒng)從頭合成大豆苷元。這種包含兩株以上不同菌株的多菌共培養(yǎng)系統(tǒng)可以使各模塊免于其他模塊的干擾，更獨立地調(diào)控各個模塊。在化合物的合成途徑冗長復(fù)雜時，多菌共培養(yǎng)系統(tǒng)往往具有靈活、高效的優(yōu)勢，如大腸桿菌三菌共培養(yǎng)系統(tǒng)合成迷迭香酸[28]、綠原酸[18]和水飛薊賓[29]以及大腸桿菌四菌共培養(yǎng)系統(tǒng)合成花青素[30]。

在LCA2G-LLQ4R-LDZ11 共培養(yǎng)系統(tǒng)中，LCA2G 負責(zé)合成對香豆酸，LLQ4R 將對香豆酸轉(zhuǎn)化為甘草素，LDZ11 最后將甘草素轉(zhuǎn)化為大豆苷元。LLQ4R 和LDZ11 將共同為LCA2G 提供生長所需的苯丙氨酸[圖6(a)]。LCA2G-LLQ4R 共培養(yǎng)系統(tǒng)在合成甘草素時的最佳接種比例為2∶1，在此基礎(chǔ)上，探索了LDZ11 菌株的接種比例對大豆苷元產(chǎn)量的影響。如圖6(b)所示，當(dāng)接種比例LCA2G∶LLQ4R∶LDZ11由2∶1∶1逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)?∶1∶8時，即LDZ11的比例逐漸增大時，甘草素的積累逐漸減少，說明更多的LDZ11 菌株更有利于甘草素的轉(zhuǎn)化。大豆苷元在接種比例為2∶1∶2 時達到最高的27.8 mg/L，比LCA2G-LDZ10 和LDZ12-LLQ4R 雙菌共培養(yǎng)系統(tǒng)的產(chǎn)量分別高127.9%和64.5%。

圖6 構(gòu)建LCA2G-LLQ4R-LDZ11偏利三菌共培養(yǎng)系統(tǒng)在M9培養(yǎng)基中從頭合成大豆苷元(a)LCA2G-LLQ4R-LDZ11共培養(yǎng)系統(tǒng)的設(shè)計;(b)LCA2G-LLQ4RLDZ11共培養(yǎng)系統(tǒng)接種比例優(yōu)化Fig.6 Commensalistic engineering of LCA2G-LLQ4R-LDZ11 coculture for de novo biosynthesis of daidzein in M9 medium

2.4 偏利三菌共培養(yǎng)系統(tǒng)合成大豆苷元

三種模式的偏利共培養(yǎng)系統(tǒng)中，LCA2GLLQ4R-LDZ11 三菌共培養(yǎng)系統(tǒng)是最有效的。如圖7(a)、(b)所示，在最佳接種比例2∶1∶2，LCA2GLLQ4R-LDZ11 共培養(yǎng)系統(tǒng)在M9 培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h，大豆苷元持續(xù)增加到24.1 mg/L 后維持穩(wěn)定，甘草素一直維持在很低的水平（20 mg/L 以下）。共培養(yǎng)系統(tǒng)的生物量從開始的OD 為1 到48 h 增長到5.7，其中對香豆酸生產(chǎn)菌株LCA2G 的群體比例穩(wěn)中有降，從開始時的40%到48 h 時逐漸減少為21.3%；大豆苷元生產(chǎn)菌株LDZ11 的群體比例穩(wěn)中有升，從開始的40%到48 h時逐漸增加到68.6%；甘草素生產(chǎn)菌株LLQ4R 的群體比例基本維持穩(wěn)定，在20%左右。將甘草素和大豆苷元模塊表達在對香豆酸底盤中，構(gòu)建大豆苷元從頭合成菌株LDZ8，在M9Y 培養(yǎng)基中發(fā)酵72 h，LDZ8 單培養(yǎng)系統(tǒng)合成2.7 mg/L 大豆苷元[圖7(c)]。與之相比，LCA2GLLQ4R-LDZ11 偏利三菌系統(tǒng)將大豆苷元的產(chǎn)量提高了8 倍，說明了共培養(yǎng)系統(tǒng)更適合用于大豆苷元的生物合成。

圖7 LCA2G-LLQ4R-LDZ11偏利三菌共培養(yǎng)系統(tǒng)在M9培養(yǎng)基中合成大豆苷元的動態(tài)曲線(a)接種比例2∶1∶2時LCA2G-LLQ4R-LDZ11共培養(yǎng)系統(tǒng)在M9培養(yǎng)基中合成的對香豆酸、柚皮素、甘草素和大豆苷元產(chǎn)量的動力學(xué)曲線;(b)接種比例2∶1∶2時LCA2G-LLQ4R-LDZ11共培養(yǎng)系統(tǒng)在M9培養(yǎng)基中的生物量和群體比例的動力學(xué)曲線;(c)LDZ8單培養(yǎng)系統(tǒng)在M9Y培養(yǎng)基中合成大豆苷元Fig.7 The time profile of commensalistic LCA2G-LLQ4RLDZ11 coculture for biosynthesis of daidzein in M9 medium

相較于LCA2G-LLQ4R 偏利雙菌系統(tǒng)，此三菌體系中菌群變化更為劇烈，可能是因為菌群間相互作用的減少。其中LDZ11 的群體比例增長幅度較大，LCA2G-LLQ4R-LDZ11 三菌系統(tǒng)中大豆苷元產(chǎn)量的提高，很大一部分歸功于LDZ11 較高的群體比例，使甘草素得到了更有效的轉(zhuǎn)化。除了偏利共生的菌群關(guān)系，以后的研究可以利用碳源代謝[31]、能量代謝[29]或群體感應(yīng)[32]增加菌群間的相互作用，實現(xiàn)群體比例的動態(tài)調(diào)控，增強共培養(yǎng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

此前，Nielsen 等[11]在釀酒酵母中表達大豆來源的CHS、CHR、CHI 和HID 以及甘草來源的IFS 構(gòu)建大豆苷元合成途徑，達到了目前報道的最高產(chǎn)量85.4 mg/L。它的高產(chǎn)一部分得益于甘草素底盤菌株較高的甘草素供給（77.7 mg/L）和較低的柚皮素副產(chǎn)物積累（約11.5 mg/L），在其他研究中，柚皮素和甘草素的比例在1∶1 左右[22]。本研究中的主要副產(chǎn)物也是柚皮素，幾乎沒有染料木素。大豆來源的CHS、CHR 和CHI 在釀酒酵母中會和大豆植物中一樣，通過相互作用形成酶復(fù)合物[33]，提高底物的傳遞效率，減少柚皮素的合成。增強細胞中丙二酰-CoA的供給也有助于大豆苷元的合成[11]，后續(xù)可以在共培養(yǎng)系統(tǒng)中使用丙二酰-CoA的調(diào)控策略，進一步提高大豆苷元的產(chǎn)量。此外，大豆苷元的7-O-葡萄糖苷和8-C-葡萄糖苷葛根素具有多種生物活性[34-35]。利用共培養(yǎng)系統(tǒng)即插即用的特點，可在偏利三菌的基礎(chǔ)上增加糖基供體模塊，探索適配的共培養(yǎng)系統(tǒng)模式合成大豆苷元的糖苷，并使用碳源分配策略，來減少苷元和糖基供體合成途徑對葡萄糖的競爭[36]。構(gòu)建互利共生的菌群關(guān)系也有望提高共培養(yǎng)系統(tǒng)穩(wěn)定性和高效性。

3 結(jié) 論

人工大腸桿菌共培養(yǎng)系統(tǒng)由于其模塊化的優(yōu)勢，在合成化學(xué)品、生物燃料和天然產(chǎn)物等眾多領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用[37]。本研究構(gòu)建了LLQ5 單菌和LCA2G-LLQ4R 雙菌系統(tǒng)從頭合成甘草素，雙菌系統(tǒng)合成57.5 mg/L 甘草素，比單菌系統(tǒng)的產(chǎn)量高80.8%。LCA2G-LLQ4R 雙菌系統(tǒng)在M9 培養(yǎng)基中通過苯丙氨酸的單向流動形成了偏利共生的菌群關(guān)系，平衡了代謝途徑，大幅降低了中間產(chǎn)物對香豆酸的積累。在LCA2G-LLQ4R 偏利雙菌系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了兩種雙菌系統(tǒng)和一種三菌系統(tǒng)來從頭合成大豆苷元。其中，三菌系統(tǒng)的大豆苷元產(chǎn)量最高，達到27.8 mg/L。各自獨立的模塊更有利于代謝途徑靈活的調(diào)控，從而提高大豆苷元的產(chǎn)量，是單培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)量的9 倍。本文構(gòu)建的共培養(yǎng)系統(tǒng)可通過模塊間的替換或增加實現(xiàn)即插即用的靈活組裝，可用于更多黃酮或其他復(fù)雜化合物的生物合成。