楊智軍 楊文龍 夏漢庭 李威羅云豐劉江源楊鳳云*

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004 2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006

骨質(zhì)疏松癥 (osteoporosis, OP) 是一種以骨量減少、骨強(qiáng)度下降、易發(fā)生脆性骨折為特征的代謝性疾病[1]。隨著我國(guó)人口老齡化程度的不斷加劇，OP患者逐年增加，已成為較常見的健康問題之一[2]。

骨重建過程中，破骨細(xì)胞(osteoclast, OC)介導(dǎo)的骨吸收大于成骨細(xì)胞(osteoblast, OB)的骨形成，兩者的動(dòng)態(tài)平衡被打破，骨量丟失過多，易發(fā)生OP[3-4]。OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路對(duì)骨代謝的動(dòng)態(tài)平衡發(fā)揮著重要作用，近年來被廣泛用于OP的研究[5-8]。課題組前期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[9]發(fā)現(xiàn)，加味陽(yáng)和湯對(duì)OP腎陽(yáng)虛證大鼠模型有較好治療作用，但分子作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究采用加味陽(yáng)和湯含藥血清與腎陽(yáng)虛大鼠血清體外干預(yù)RAW264.7 和MC3T3-E1細(xì)胞共育體系，觀察它們對(duì)護(hù)骨素(OPG)、核因子-κB(NF-κB)受體活化因子(RANK)、NF-κB受體活化因子配體(RANKL)蛋白表達(dá)的影響，探究此方對(duì)OP腎陽(yáng)虛證的可能作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取2月齡SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，由斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)43004700062023。將大鼠隨機(jī)分成加味陽(yáng)和湯組和生理鹽水組，每組15只。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：小鼠RAW264.7細(xì)胞株購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)(貨號(hào)SCSP-5036)，小鼠MC3T3-E1 subclone 14細(xì)胞株購(gòu)自賽百慷生物公司(貨號(hào)iCell-m050)。

1.1.3主要藥物：加味陽(yáng)和湯由鹿角膠、熟地黃、雞血藤等10味中藥組成，每劑中藥總量為100 g，購(gòu)自江西省中醫(yī)院。中藥煎煮后，將藥液蒸發(fā)濃縮至每毫升含生藥1 g，保存于4 ℃。

1.1.4試劑：抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)檢測(cè)試劑盒，堿性磷酸酶(ALP)顯色試劑盒(碧云天生物研究所，批號(hào)P0332，C3206)；TRAP染色試劑盒(貝博公司，批號(hào)BB-44212)；一抗OPG，RANKL抗體(Bioss 公司，批號(hào)bs-0431R，bs-20647R)；一抗RANK抗體(ABclonal公司，批號(hào)A12997)；β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體，細(xì)胞因子RANKL，M-CSF(Proteintech公司，批號(hào)51067-2-AP，315-11，315-02)。

1.2 方法

1.2.1加味陽(yáng)和湯含藥血清及腎陽(yáng)虛大鼠血清的制備：依據(jù)參考文獻(xiàn)[9]，按照體表面積換算公式，大鼠灌胃劑量為10 g/kg。連續(xù)灌胃7 d后采血，取上層血清，水浴滅活后保存于-20 ℃。課題組前期已制備腎陽(yáng)虛大鼠血清，保存于-80 ℃[10]。

1.2.2小鼠MC3T3-E1和RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)：將購(gòu)買的兩種細(xì)胞分別放于培養(yǎng)箱，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行換液、傳代及種板，ALP及茜素紅染色評(píng)估MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化及礦化能力。此外，M-CSF、RANKL對(duì)RAW264.7細(xì)胞行破骨誘導(dǎo)，TRAP染色評(píng)估破骨分化能力。

1.2.3共育體系的建立及分組：依據(jù)參考文獻(xiàn)[11]，于Transwell 培養(yǎng)板建立MC3T3-E1與 RAW264.7細(xì)胞共育體系，加入M-CSF、RANKL 共同培養(yǎng)。共培養(yǎng)4 d后，除空白組外，設(shè)置腎陽(yáng)虛血清組、含藥血清+腎陽(yáng)虛血清組、含藥血清組，分別干預(yù)共育體系48 h，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。根據(jù)前期MTT和CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果[10,12]，各組血清質(zhì)量分?jǐn)?shù)均采用10 %。

1.2.4TRAP 及ALP活性的檢測(cè)：按照 TRAP 和ALP檢測(cè)試劑盒說明書分別進(jìn)行相關(guān)步驟，計(jì)算樣品TRAP和ALP活性[13]。

1.2.5TRAP 及ALP 染色：分別使用TRAP和ALP染色試劑盒進(jìn)行，鏡下隨機(jī)抽取4個(gè)視野，計(jì)數(shù)TRAP 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目和觀察ALP染色陽(yáng)性細(xì)胞，采用Image J軟件分析。

1.2.6WB檢測(cè)OPG、RANKL及RANK蛋白表達(dá)：提取總蛋白，BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，依次制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉，孵育一抗β-actin(1∶1 000)、OPG(1∶800)、RANKL(1∶800)及RANK(1∶1 000)，TBST 洗膜，孵育二抗(1∶5 000)，TBST再洗膜，ECL孵育，條帶顯影，Image Lab軟件分析灰度值，計(jì)算目的與內(nèi)參蛋白相對(duì)比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2. 1 小鼠MC3T3-E1細(xì)胞的形態(tài)觀察及成骨分化、礦化染色

MC3T3-E1細(xì)胞在培養(yǎng)過程中，其形態(tài)多由圓形變?yōu)殚L(zhǎng)梭形或多角形等，數(shù)量增多(圖1a)。培養(yǎng)6 d后，ALP染色可見較多陽(yáng)性細(xì)胞，胞質(zhì)為藍(lán)紫色(圖1b)。此外，培養(yǎng)20 d后，茜素紅染色見鈣化結(jié)節(jié)形成，呈橘紅色點(diǎn)狀或片狀分布(圖1c、圖1d)。這表明購(gòu)買的MC3T3-E1細(xì)胞狀態(tài)較好，可向OB分化。

注：a：MC3T3-E1細(xì)胞(×100) ; b：ALP染色(×100) ; c：茜素紅染色(×200) ; d：茜素紅染色(×200)。 圖1 小鼠MC3T3-E1細(xì)胞的形態(tài)觀察及成骨分化、礦化染色Fig.1 Morphological observation, osteogenic differentiation and mineralization staining of MC3T3-E1 cells

2. 2 小鼠RAW264.7細(xì)胞及破骨誘導(dǎo)的形態(tài)觀察

RAW264.7細(xì)胞形態(tài)較小，多為圓形，呈集落狀分布，增殖較快(圖2a)。加入 RANKL及 M-CSF 誘導(dǎo)6 d后，鏡下可見多核巨細(xì)胞形成(圖2b)。TRAP染色可見陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞核至少有3個(gè)及以上(圖2c、圖2d)。表明RAW264.7細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定，可向OC分化。

注：a：RAW264.7細(xì)胞(×100); b：RAW264.7細(xì)胞(×200); c：Trap染色(×100); d：Trap染色(×200)。圖2 小鼠RAW264.7細(xì)胞與破骨誘導(dǎo)的形態(tài)觀察及染色Fig.2 Morphological observation and staining of mouse RAW264.7 cells and osteoclast induction

2. 3 對(duì)共育體系中TRAP、ALP 活性的影響

與空白組比較，腎陽(yáng)虛血清組TRAP活性增加 (P<0.05)，ALP活性降低 (P<0.05)，而含藥血清組TRAP活性降低(P<0.05)，ALP活性增加(P<0.05)。與腎陽(yáng)虛血清組相比，含藥血清+腎陽(yáng)虛血清組TRAP活性降低(P<0.05)，ALP活性增加(P<0.05)。見表1。

表1 加味陽(yáng)和湯含藥血清對(duì)共育體系中TRAP、ALP 活性的影響

2. 4 對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞成骨分化的影響

對(duì)共育體系干預(yù)48 h后，觀察MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化情況，見圖3。與空白組比較，腎陽(yáng)虛血清組ALP染色陽(yáng)性細(xì)胞及藍(lán)紫色面積減少(P<0.05)，含藥血清組藍(lán)紫色面積增加(P<0.05)。與腎陽(yáng)虛血清組相比，含藥血清+腎陽(yáng)虛血清組藍(lán)紫色面積增加(P<0.05)。見表2。

2. 5 對(duì)RAW264.7細(xì)胞破骨分化的影響

干預(yù)48 h后，觀察RAW264.7細(xì)胞的破骨分化情況，見圖4。與空白組比較，腎陽(yáng)虛血清組OC數(shù)目增加(P<0.05)，含藥血清組OC數(shù)目減少(P<0.05)。與腎陽(yáng)虛血清組相比，含藥血清+腎陽(yáng)虛血清組OC數(shù)量減少(P<0.05)。見表3。

注：A：腎陽(yáng)虛血清組; B：空白組; C：含藥血清+腎陽(yáng)虛血清組; D：含藥血清組。圖4 加味陽(yáng)和湯含藥血清對(duì)RAW264.7細(xì)胞破骨分化的TRAP染色(×40)Fig.4 TRAP staining of RAW264.7 cell osteoclast differentiation with serum containing Jiawei Yanghe Decoction (×40)

表3 加味陽(yáng)和湯含藥血清對(duì)RAW264.7細(xì)胞破骨分化的影響

2. 6 對(duì)成骨細(xì)胞 OPG、RANKL蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，腎陽(yáng)虛血清組RANKL蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，OPG蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，而含藥血清組RANKL蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，OPG蛋白表達(dá)增加(P<0.05)。與腎陽(yáng)虛血清組比較，含藥血清+腎陽(yáng)虛血清組RANKL蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，OPG蛋白表達(dá)增加(P<0. 05)。見圖5，表4。

表4 加味陽(yáng)和湯含藥血清對(duì)OPG 、RANKL及RANK蛋白表達(dá)的影響

注：A：腎陽(yáng)虛血清組; B：空白組; C：含藥血清+腎陽(yáng)虛血清組; D：含藥血清組。圖5 加味陽(yáng)和湯含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞 OPG、RANKL蛋白表達(dá)的影響Fig.5 The effect of serum containing Jiawei Yanghe Decoction on the expression of OPG and RANKL proteins in osteoblasts

2. 7 對(duì)RAW264.7及破骨細(xì)胞RANK蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，腎陽(yáng)虛血清組RANK蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，含藥血清組RANK蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。與腎陽(yáng)虛血清組比較，含藥血清+腎陽(yáng)虛血清組RANK蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖6，表4。

注：A：腎陽(yáng)虛血清組; B：空白組; C：含藥血清+腎陽(yáng)虛血清組; D：含藥血清組。圖6 加味陽(yáng)和湯含藥血清對(duì)RAW264.7及破骨細(xì)胞RANK蛋白表達(dá)的影響Fig.6 The effect of serum containing Jiawei Yanghe Decoction on the expression of RAW264.7 and osteoclast RANK protein

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為OP多與腎陽(yáng)不足、肝腎虧虛、血瘀氣滯等有關(guān)[14]。加味陽(yáng)和湯由鹿角膠、熟地黃、肉桂、雞血藤等中藥配伍而成[15]，全方有溫補(bǔ)腎陽(yáng)、填精益髓、活血化瘀之功效，臨床上用于OP腎陽(yáng)虛證療效較好。

前期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[9]也表明，加味陽(yáng)和湯可改善OP腎陽(yáng)虛證大鼠模型的骨密度。為進(jìn)一步探究此方抗OP的分子作用機(jī)制，本研究予含藥血清體外干預(yù)RAW264.7與MC3T3-E1細(xì)胞共育體系。

RAW264.7細(xì)胞屬于OC前體細(xì)胞[16]，MC3T3-E1 subclone 14細(xì)胞屬于OB前體細(xì)胞[17]。與單獨(dú)培育RAW264.7或MC3T3-E1細(xì)胞相比，共育體系可更好模擬機(jī)體骨代謝微環(huán)境。

前期研究[10]還發(fā)現(xiàn)，腎陽(yáng)虛大鼠血清可下調(diào)共育體系中OPG 蛋白表達(dá)，上調(diào)RANKL 蛋白表達(dá)。因此，本研究設(shè)置腎陽(yáng)虛血清組和含藥血清+腎陽(yáng)虛血清組，觀察含藥血清能否改善腎陽(yáng)虛大鼠血清對(duì)共育體系的影響。

研究結(jié)果表明，與腎陽(yáng)虛血清組相比，含藥血清+腎陽(yáng)虛血清組可增加OPG并降低RANKL、RANK蛋白表達(dá)，抑制破骨分化，促進(jìn)骨形成。這在一定程度上證實(shí)了加味陽(yáng)和湯對(duì)OP腎陽(yáng)虛證的作用，為臨床運(yùn)用提供了相關(guān)藥理學(xué)依據(jù)。但中藥復(fù)方成分復(fù)雜，此方對(duì)OP腎陽(yáng)虛證的治療機(jī)制可能涉及其他靶點(diǎn)和途徑，均需課題組今后深入探究。