周子墨 柳達(dá) 陳森相 覃森

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院骨科，遼寧 沈陽(yáng) 110004

骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞，根據(jù)誘導(dǎo)方式的不同，可以分化為神經(jīng)元、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等[1-3]。當(dāng)骨組織發(fā)生損傷后，損傷部位釋放的因子誘導(dǎo)遠(yuǎn)處的BMSCs向損傷部位遷移，發(fā)生歸巢效應(yīng)，并定植于損傷部位。同時(shí)，BMSCs不斷分化為成骨細(xì)胞，并釋放多種細(xì)胞因子，促進(jìn)新的骨組織生成，這一過(guò)程也被稱為成骨分化(osteogenesis differentiation)[4]。因此，BMSCs的骨組織修復(fù)作用機(jī)制可分為3個(gè)方面：①多向分化；②旁分泌；③歸巢效應(yīng)。近年來(lái)，BMSCs的成骨分化在骨質(zhì)疏松癥、骨折、骨肉瘤等多種疾病中發(fā)揮重要作用，其相關(guān)的多種分子機(jī)制也不斷被闡述[5-6]。

隨著對(duì)干細(xì)胞研究的不斷深入，大量研究已經(jīng)證明干細(xì)胞可以沿著特定的組織譜進(jìn)行自我增殖和分化。此外，從體內(nèi)分離并在體外培養(yǎng)的干細(xì)胞在誘導(dǎo)下可以分化為特定的細(xì)胞，這為體外器官的構(gòu)建提供了基礎(chǔ)。近年來(lái)，3D培養(yǎng)技術(shù)的不斷成熟，使得多種干細(xì)胞及腫瘤相關(guān)類器官模型被構(gòu)建，這些模型具有構(gòu)建所需時(shí)間短、遺傳學(xué)穩(wěn)定等特點(diǎn)，可以很好地還原相關(guān)疾病在體內(nèi)的發(fā)生發(fā)展和分子遺傳學(xué)特性，為研究疾病發(fā)病及其相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制提供了很好的基礎(chǔ)[7]。BMSCs作為一類多能分化干細(xì)胞，其潛在的體外增殖和分化能力受到關(guān)注。目前，對(duì)BMSCs的成骨分化研究主要集中在2D細(xì)胞培養(yǎng)，而這種簡(jiǎn)單的體外培養(yǎng)方式無(wú)法構(gòu)建骨組織及機(jī)體內(nèi)環(huán)境，極大限制了BMSCs的成骨分化研究。3D培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展使得BMSCs成骨分化相關(guān)類器官的構(gòu)建成為可能，這一技術(shù)有望在骨質(zhì)疏松癥等骨代謝性疾病的發(fā)病機(jī)制研究、分子治療、藥物研發(fā)及組織工程等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

1 類器官定義及發(fā)展

1.1 類器官的定義

早在1975年，Rheinwald等[8]通過(guò)角化細(xì)胞和3T3成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)，構(gòu)建了類似于表皮的分層鱗狀上皮細(xì)胞集落。近年來(lái)，隨著3D培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，類器官也被進(jìn)一步描述為模仿哺乳動(dòng)物原始組織的體內(nèi)結(jié)構(gòu)和多譜系分化干細(xì)胞形成的具有一定組織形態(tài)的三維結(jié)構(gòu)[9]。3D培養(yǎng)技術(shù)模擬了干細(xì)胞生長(zhǎng)所需的細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境并提供了懸浮細(xì)胞培養(yǎng)條件，這一人工構(gòu)建的微環(huán)境與體內(nèi)微環(huán)境相似，包含多種與干細(xì)胞生物學(xué)行為相關(guān)的細(xì)胞及細(xì)胞因子等。干細(xì)胞在這一環(huán)境中受到微環(huán)境的調(diào)控，模擬在機(jī)體內(nèi)發(fā)生的一系列生物學(xué)過(guò)程，并逐漸被誘導(dǎo)分化形成特定的、能夠自組織的三維結(jié)構(gòu)，這一特定組織結(jié)構(gòu)也被稱為干細(xì)胞龕(stem cell niche)，即類器官。類器官的構(gòu)建及相關(guān)實(shí)驗(yàn)方式兼?zhèn)淞似胀?xì)胞培養(yǎng)、干細(xì)胞異體輸注培養(yǎng)和自體組織切片的優(yōu)點(diǎn)，為干細(xì)胞及腫瘤研究提供了更加靈活的手段。

1.2 類器官的發(fā)展

類器官在多種干細(xì)胞及腫瘤研究中發(fā)揮了重要的作用。Sato等[10]第一次通過(guò)在體外構(gòu)建類器官培養(yǎng)環(huán)境，使得腸成體干細(xì)胞(ASCs)在類器官中穩(wěn)定并自組織的形成隱絨毛類器官。在此基礎(chǔ)上，研究人員制備出了多種組織的類器官，包括腸道、腎臟、肝臟、胃、肺等[7,11-14]。這些類器官均由不同類型的干細(xì)胞分化而來(lái)，如2013年，Takebe等[15]誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)分化為肝臟類器官并移植入腸系膜，極大緩解了肝衰竭的進(jìn)程。此外，胚胎干細(xì)胞(ESCs)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生肺和腦等類器官[9,16]。干細(xì)胞的多能分化作用還體現(xiàn)在同種多能干細(xì)胞可分化為不同的類器官，如ASCs不僅可以分化為腸道類器官，還可以分化為肝臟、胰腺、肺等[17-19]。這也提示類器官的構(gòu)建對(duì)3D培養(yǎng)環(huán)境的要求較高，適合的培養(yǎng)條件及環(huán)境對(duì)干細(xì)胞誘導(dǎo)極其重要。2005年，Braccini等[20]第一次描述了一種針對(duì)BMSCs的3D培養(yǎng)系統(tǒng)，可直接在3D環(huán)境中種植和分化BMSCs，其成骨效果較2D培養(yǎng)的BMSCs更好。

目前，除了構(gòu)建不同組織的類器官，與類器官培養(yǎng)相關(guān)的技術(shù)也在不斷發(fā)展。針對(duì)不同細(xì)胞類型的不同組織類器官，培養(yǎng)方案均有較大差異。針對(duì)乳腺癌的類器官培養(yǎng)，研究者將組織樣本進(jìn)行機(jī)械破壞和酶消化結(jié)合方法，制定了基礎(chǔ)的培養(yǎng)方案。在此基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)方案不斷被優(yōu)化，多種生物制劑被應(yīng)用于乳腺癌的類器官的構(gòu)建，大大提高了培養(yǎng)的成功率[21]。Wu等[22]發(fā)現(xiàn)在3D培養(yǎng)系統(tǒng)中提供合適的軟骨微環(huán)境，如軟骨細(xì)胞外基質(zhì)后可以促進(jìn)BMSCs的軟骨分化。此外，對(duì)于3D培養(yǎng)使用的材料，也在不斷發(fā)展。一種基于骨骼肌袋的生物材料培養(yǎng)系統(tǒng)被開(kāi)發(fā)，用來(lái)支持干細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)，并構(gòu)成了一種新的類器官模型，為骨組織移植提供了可能[23]。

2 BMSCs成骨分化相關(guān)類器官的培養(yǎng)

類器官的3D培養(yǎng)環(huán)境對(duì)于其模型構(gòu)建至關(guān)重要。類器官的自組織指干細(xì)胞在3D培養(yǎng)環(huán)境中從最初一個(gè)缺乏有序的結(jié)構(gòu)，在系統(tǒng)性自主調(diào)控機(jī)制的指導(dǎo)下，進(jìn)行空間重新排列的過(guò)程。自組織過(guò)程可分為兩個(gè)階段，一個(gè)是包括反應(yīng)擴(kuò)散機(jī)制、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的雙穩(wěn)定性機(jī)制和不對(duì)稱細(xì)胞分裂機(jī)制構(gòu)成的自我模式(self-patterning)，主要由局部細(xì)胞間通訊介導(dǎo)；另一個(gè)是包括組織內(nèi)不同類型細(xì)胞的聚類和更高層次的結(jié)構(gòu)重組導(dǎo)致的類器官形態(tài)重排。自組織中，細(xì)胞的粘附作用、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞間信號(hào)串?dāng)_(crosstalk)均發(fā)揮了重要的作用[24]。這一過(guò)程的影響因素可以概括為：①培養(yǎng)環(huán)境的理化特性；②系統(tǒng)內(nèi)源和外源信號(hào)。

2.1 培養(yǎng)環(huán)境的理化特性

類器官的3D培養(yǎng)所需要的容器必須能支持細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)，一種從Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤中提純獲得的基質(zhì)膠(Matrigel)被作為細(xì)胞外基質(zhì)廣泛應(yīng)用于3D培養(yǎng)中[9]。對(duì)于BMSCs的分化培養(yǎng)，有研究表明，相比于單純涂有細(xì)胞外基質(zhì)的藻酸鹽微珠培養(yǎng)系統(tǒng)，添加有硫酸軟骨素 (CS) 和 Col 2的培養(yǎng)體系可以更好的促進(jìn)BMSCs的軟骨分化[22]。

水凝膠作為一種新的生物材料，也被認(rèn)為是Matrigel的替代品，其可以控制培養(yǎng)環(huán)境的理化特性及力學(xué)特性，并在BMSCs的成骨分化和類骨組織形成中發(fā)揮作用[25-27]。但水凝膠對(duì)于BMSCs的內(nèi)器官形成作用依然有爭(zhēng)議。傳統(tǒng)基質(zhì)中含有IGF、TGF/組織纖溶酶原激活物等復(fù)雜的生長(zhǎng)因子，而水凝膠中則缺乏這些天然含有的生長(zhǎng)因子[14]。Jaramillo等[28]將BMSCs加入合成水凝膠基質(zhì) (PEGDA)并植入成年雄性Lewis大鼠的回腸系膜，以期形成類牙齒器官，但由于缺乏基質(zhì)相互作用，BMSCs無(wú)法和PEGDA相容。

此外，還有多種生物3D支架也被廣泛開(kāi)發(fā)用于BMSCs的體外3D培養(yǎng)[29-30]。Lastra等[31]開(kāi)發(fā)了一種全新的由富馬酸-醋酸乙烯酯共聚物和殼聚糖制備的微球環(huán)境，不僅可以促進(jìn)BMSCs增殖，還可以促進(jìn)其重新排列成簇生長(zhǎng)，表明出良好的類骨組織生長(zhǎng)。Abbasi等[32]構(gòu)建了一種機(jī)械調(diào)節(jié)劑聚合物微粒MP，這種微粒使得人間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cell，hMSCs)球體不斷增殖和成骨分化，成為一類成骨分化類器官建模的新工具。

2.2 系統(tǒng)內(nèi)源和外源信號(hào)

類器官的自組織需要多種細(xì)胞因子及信號(hào)的刺激。首先是由干細(xì)胞自分泌和旁分泌產(chǎn)生的內(nèi)源信號(hào)，如外泌體、生長(zhǎng)因子等。當(dāng)干細(xì)胞聚集生長(zhǎng)時(shí)，這些干細(xì)胞分泌出多種因子，激活并刺激更多干細(xì)胞的分化過(guò)程。一些類器官的產(chǎn)生幾乎完全依賴于內(nèi)源信號(hào)，例如，小鼠PSCs培養(yǎng)而來(lái)的小鼠視杯類器官需要在低生長(zhǎng)因子水平的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，而PSCs自己產(chǎn)生的內(nèi)源信號(hào)對(duì)視杯類器官的產(chǎn)生起到?jīng)Q定作用[33]。對(duì)于BMSCs的研究中我們發(fā)現(xiàn)，3D培養(yǎng)時(shí)，BMSCs分泌的外泌體可以激活周圍BMSCs的HMGB1/AKT通路，從而對(duì)BMSCs的增殖、遷移影響較2D培養(yǎng)更強(qiáng)[34]。

其次，類器官自組織所需的外源信號(hào)包括外界給予的多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子。在3D培養(yǎng)所提供的血清中，已含有一定量的生長(zhǎng)因子，此外，BMSCs成骨分化所需要的抗壞血酸、β-磷酸甘油及一定劑量地塞米松等也會(huì)被添加入培養(yǎng)基中。Petrigliano等[35]在涂有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (bFGF)的3D支架上培養(yǎng)BMSCs。實(shí)驗(yàn)表明，額外提供bFGF可以很好的促進(jìn)BMSCs的生長(zhǎng)分化。此外，一些研究通過(guò)在基質(zhì)膠中加入Col I等促成骨分化因子，以進(jìn)一步促進(jìn)成骨分化的發(fā)生[36]。

在最初的增殖與分化中，外源信號(hào)發(fā)揮著重要作用，通過(guò)外源信號(hào)的刺激，內(nèi)源性信號(hào)被激活，并發(fā)揮調(diào)控作用。因此，內(nèi)源信號(hào)與外源信號(hào)在類器官的構(gòu)建中均發(fā)揮了不可或缺的作用，這也為BMSCs成骨分化類器官提供了更多的研究方向，如改變外源信號(hào)的水平或者使用藥物干擾內(nèi)源信號(hào)的表達(dá)對(duì)類器官模型的影響及其相關(guān)分子機(jī)制[37]。

3 BMSCs成骨分化相關(guān)類器官的應(yīng)用

目前，針對(duì)BMSCs的類器官構(gòu)建依然較少。BMSCs的3D培養(yǎng)主要應(yīng)用于組織工程和植入材料的開(kāi)發(fā)，如優(yōu)化的絲素蛋白明膠支架、透明質(zhì)酸水凝膠支架等在BMSCs的軟骨分化中可以起到促進(jìn)作用，為軟骨原位修復(fù)提供更多可能[26,38]。目前一些研究已經(jīng)證實(shí)這些無(wú)機(jī)或有機(jī)材料制備的3D支架可以通過(guò)自身的特性，如接近機(jī)體骨骼的礦物質(zhì)百分比、組成、結(jié)構(gòu)以及力學(xué)性能，提供適合BMSCs生長(zhǎng)的理化特性，以促進(jìn)BMSCs的增殖、分化，這也為類器官的構(gòu)建提供了很好的基礎(chǔ)[39]。

臨床上，已有研究通過(guò)3D培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建牙齒及顱面骨的類器官，使得移植物在受損的顱面組織上移植后，能促進(jìn)牙槽骨再生和頜骨重建，這種類器官的移植最適合由創(chuàng)傷、疾病或出生缺陷引起的口腔骨、皮膚和牙齦嚴(yán)重缺損，并在臨床治療中得到了較好的預(yù)后[40]。

而在其他如藥物篩選和骨質(zhì)疏松癥疾病的基礎(chǔ)研究等領(lǐng)域，3D培養(yǎng)更體現(xiàn)出優(yōu)于2D細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)。有研究通過(guò)3D培養(yǎng)構(gòu)建牙周韌帶間充質(zhì)干細(xì)胞 (PDLSCs)團(tuán)塊，討論脂多糖(LPS)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨潛能的影響研究。結(jié)果表明，相較于2D平面培養(yǎng)的3D PDLSCs，3D培養(yǎng)的PDLSCs團(tuán)塊更能抵抗LPS的作用，降低炎癥反應(yīng)的發(fā)生[41]。此外，與2D塑料板上培養(yǎng)的MSCs相比，3D浮動(dòng)培養(yǎng)的MSCs團(tuán)塊中環(huán)氧合酶2 (COX2)介導(dǎo)的PGE2產(chǎn)生顯著增加，并且顯著抑制了細(xì)胞的凋亡[42]。目前，針對(duì)MSCs的3D培養(yǎng)構(gòu)建肝臟類器官模型并進(jìn)行藥物篩選及移植的研究已被廣泛開(kāi)展，但對(duì)于BMSCs成骨分化類器官的研究，依然十分有限。

4 總結(jié)與展望

3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)作為一種新的細(xì)胞培養(yǎng)手段，由于可以提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境及懸浮細(xì)胞培養(yǎng)條件，使得其能更接近于人體的微環(huán)境。而干細(xì)胞的多向分化能力、旁分泌和歸巢效應(yīng)，則為3D培養(yǎng)及類器官模型的建立成為可能。因此，類器官模型的建立在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。盡管BMSCs成骨分化的類器官模型已被構(gòu)建并不斷優(yōu)化，且被應(yīng)用于臨床，但其依然存在許多限制。首先是與傳統(tǒng)BMSCs培養(yǎng)相比，3D細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程較復(fù)雜，所需耗材昂貴，且技術(shù)不成熟等因素導(dǎo)致類器官構(gòu)建成功率較低。此外，人體BMSCs的獲得和擴(kuò)大培養(yǎng)較困難，其涉及到的倫理問(wèn)題也使得這一技術(shù)無(wú)法在大規(guī)模的藥物篩查及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中被利用。解決以上問(wèn)題，還需要更深入的研究。

綜上所述，BMSCs成骨分化的3D細(xì)胞培養(yǎng)及類器官的構(gòu)建可以應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥等多種疾病的藥物篩查、基礎(chǔ)研究及臨床治療相關(guān)的組織工程中。其特有的優(yōu)勢(shì)可以幫助研究人員更深層次的探討B(tài)MSCs成骨分化相關(guān)機(jī)制與藥物治療，使骨代謝疾病的個(gè)體化治療成為可能。