安雪菲 但漢龍 羅旭璐 劉 云 李永和 趙 平

（1. 西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)林業(yè)生物質(zhì)資源高效利用國家林業(yè)局重點實驗室，云南 昆明 650233；2. 云南林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650224）

貴州省特有植物無子刺梨（Rosa Sterills）與刺梨（R. roxburghii）同屬薔薇科（Rosaceae）薔薇屬多年生攀援灌木[1-3]，其成熟果實香甜爽口，酸味適中，加工鮮食均可[4]。有關(guān)刺梨的化學(xué)成分和生物活性的研究報道較多，研究表明多酚、黃酮和三萜是刺梨的主要有效成分，具有提高免疫功能、延緩衰老、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、預(yù)防癌癥、降血脂和抗糖尿病等生理活性[5-7]。自1985年時圣德[1]首次報道無子刺梨新分類群以來，國內(nèi)外對無子刺梨的研究主要集中在其形態(tài)分類[2-3]、親緣關(guān)系[8-9]、繁殖[10]、光合生理[11]和成分分析[2,12-14]等方面，而對無子刺梨果實的抗氧化活性及其主要化學(xué)成分含量分析研究至今未見報道。

活性篩選實驗方法分為體外與體內(nèi)實驗，體外實驗雖然具有快速高效的優(yōu)點，但不涉及被篩選物質(zhì)的吸收、分布和代謝等問題，其篩選結(jié)果往往與體內(nèi)實驗結(jié)果不符，而以斑馬魚（Danio rerio）建立的體內(nèi)實驗可以彌補體外實驗的不足。斑馬魚模型既具有體外實驗快速高效的優(yōu)勢，又具有哺乳類動物實驗預(yù)測性強、可比度高等優(yōu)點，加之其發(fā)育周期快、繁殖能力強、胚胎透明和易于觀察，近年來已發(fā)展成為國內(nèi)外高效篩選藥理活性的理想模式動物模型[15-17]。本實驗以貴州省興仁縣產(chǎn)無子刺梨新鮮成熟果實為原料，采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2′-連氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）自由基清除活性和活性氧簇（ROS）清除活性測試方法評價其果汁提取物和果渣提取物的體內(nèi)外抗氧化活性，并采用紫外分光光度法分別對果汁和果渣中總多酚、總黃酮和總?cè)频戎饕瘜W(xué)成分的含量進行測定，以期為無子刺梨進一步的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1）材料 無子刺梨新鮮成熟果實，于2014年10月采自貴州省興仁縣回龍鎮(zhèn)獅子村生長良好的植株。

2）試劑、藥品 對照品沒食子酸、蘆丁和齊墩果酸購自中國藥品生物制品檢定所，福林酚試劑、DPPH、ABTS、還原型谷胱甘肽（GSH）和ROS特異性熒光染料購自Sigma公司，AB-8大孔吸附樹脂購自北京慧德易科技有限責任公司，碳酸鈉、抗壞血酸鈉、果膠酶、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、香蘭醛、冰乙酸、高氯酸、維生素C（Vc）、二甲基亞砜（DMSO）、甲醇和乙醇均為分析純，水為重蒸餾水。

3）儀器 CP224C電子天平（奧豪斯儀器有限公司，美國），UV-2500紫外分光光度計（北京萊伯泰科儀器有限公司，中國），高速中藥粉碎機（浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司，中國），SG250HDT超聲波儀（上海冠特超聲儀器有限公司，中國），賽特路斯BT244S型萬分之一電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，中國），EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1001型（東京理化器械有限公司，日本），96孔酶標板（Costar Technologies Inc.，美國），Mithras LB940多功能酶標儀（Berthold Technologies Inc.，德國）。

1.2 供試樣品制備

無子刺梨果實經(jīng)榨汁過濾，果汁密封后冷凍備用。所得果渣置于50 ℃鼓風(fēng)烘箱烘干至恒質(zhì)量，粉碎過40目篩后于陰涼干燥處保存?zhèn)溆?。冷凍果汁解凍后量?00 mL置于燒杯中，加入抗壞血酸鈉12.5 mg和果膠酶25 mg，于50 ℃水浴上恒溫保持4 h，過濾備用；稱取無子刺梨干燥果渣粉末15 g，采用超聲輔助乙醇提取法[18]，在料液比1∶23、乙醇體積分數(shù)52%、提取時間70 min條件下提取4次，提取液于50 ℃減壓濃縮，得到剩余水溶液備用。上述所得的2種樣品溶液分別通過AB-8大孔樹脂層析柱（35 mm×550 mm）吸附，依次用1 000 mL蒸餾水洗脫、1 000 mL乙醇解吸附，收集乙醇洗脫液于50 ℃減壓濃縮干燥，得到果汁提取物和果渣提取物。

1.3 測定及分析方法

1.3.1 體外抗氧化活性的測定與分析

采用張鏡等[19]和Feng等[20]的方法，取不同質(zhì)量濃度的供試樣品溶液分別與DPPH工作液、ABTS工作液反應(yīng)，分別按下式計算供試樣品的自由基清除率。根據(jù)供試樣品溶液的DPPH和ABTS自由基清除曲線，分別計算半清除濃度（SC50值）。實驗重復(fù)3次，并以Vc作為陽性對照。

式中：Aa為樣品溶液和DPPH工作液反應(yīng)后的吸光值，Ab為乙醇和DPPH工作液的吸光值；Ax為樣品和ABTS工作液反應(yīng)后的吸光值，Ax0為乙醇和樣品溶液的吸光值，A0表示混合溶液為乙醇和ABTS工作液時的吸光值。

1.3.2 體內(nèi)抗氧化活性的測定與分析

實驗動物為成年野生型AB系斑馬魚，按照李美娟等[21]的方法進行培養(yǎng)。平均每對能產(chǎn)200～300個胚胎。在受精后6 h和24 h對胚胎進行清理（移除已死亡胚胎），并根據(jù)胚胎的發(fā)育階段挑選合適的胚胎。在28 ℃條件下用養(yǎng)魚用水孵育胚胎（養(yǎng)魚用水水質(zhì)：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導(dǎo)率為480～510 μS/cm；pH為6.9～7.2；硬度為53.7～71.6 mg/L CaCO3）。因為胚胎可以從自身的卵黃囊中獲取營養(yǎng)物質(zhì)，所以在受精后9 d不需要喂食。

樣品濃度在3.0 μg/mL時，實驗組斑馬魚沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，因此選擇3.0 μg/mL作為樣品的濃度。實驗在96孔板中進行，每板設(shè)計1個陰性對照組、1個模型組、1個溶劑組、1個陽性對照組和8個樣品檢測組，每樣品組8個孔；陰性對照組沒有斑馬魚，其他各組均每孔1尾魚?；钚匝跄Ｐ徒M為ROS特異性熒光染料處理的斑馬魚；陰性對照組只含ROS染料的養(yǎng)魚用水，不含斑馬魚；溶劑對照組為0.1% DMSO處理組；陽性對照組為GSH處理組；所有實驗組均含有相同濃度的溶劑?；衔锾幚斫Y(jié)束后，應(yīng)用多功能酶標儀對各實驗組進行熒光定量分析，取6孔斑馬魚熒光值作統(tǒng)計學(xué)處理。采用方差分析和Dunnett'st-檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05表明具有顯著性差異。統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果用± SE表示。樣品的ROS清除率按公式（3）計算。

1.3.3 3種主要化學(xué)成分含量的測定與分析

分別精密稱取4.0 mg果汁提取物和果渣提取物，用70%乙醇溶解后定容至10 mL，配制成0.4 mg/mL的溶液。按照Lee等[22]的方法進行操作，實驗重復(fù)3次，將測得的樣品吸光度值帶入本實驗室已建立的沒食子酸標準曲線的回歸方程（y=3.222 3x+0.034 1，R2=0.999 9）[23]，并結(jié)合稀釋倍數(shù)分別計算出果汁和果渣原料中總多酚的含量。

參考梁倩等[24]的方法，以蘆丁為標準品繪制其標準曲線，得線性回歸方程為：y=10.174x-0.021 6（R2=0.999 6），表明蘆丁在0.01～0.05 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密稱取10 mg果汁提取物和果渣提取物，用70%乙醇溶解后定容至100 mL，配制成0.1 mg/mL的溶液。之后按梁倩等[24]的方法進行操作，實驗重復(fù)3次，將測得的樣品吸光度值帶入上述回歸方程，并結(jié)合稀釋倍數(shù)分別計算出果汁和果渣原料中總黃酮的含量。

采用毛得獎等[25]的方法，以齊墩果酸為標準品繪制其標準曲線，得線性回歸方程為：y=5.782x+0.103（R2=0.999 9），表明齊墩果酸在0.06～0.42 mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。準確稱取10 mg提取樣品，用乙醇溶解后定容至10 mL，配制成1.0 mg/mL的溶液。之后按毛得獎等[25]的方法進行操作，實驗重復(fù)3次，將測得的樣品吸光度值帶入上述回歸方程，并結(jié)合稀釋倍數(shù)分別計算出果汁和果渣原料中總?cè)频暮俊?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 無子刺梨果汁和果渣提取物的體外抗氧化活性

由圖1可知，Vc對DPPH自由基的清除率在10～40 μg/mL濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系較好，SC50值為(18.23±1.73) μg/mL。Vc對ABTS自由基的清除率在50～150 μg/mL濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系較好，SC50值為(77.45±1.01) μg/mL。

圖 1 果汁和果渣提取物的DPPH和ABTS自由基清除率Fig. 1 DPPH and ABTS free radical scavenging rates of the juice and pomace extracts

由表1可知，果汁提取物對DPPH自由基的清除率在4～20 μg/mL濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系較好，SC50值為(17.58±0.48) μg/mL；對ABTS自由基的清除率在50～150 μg/mL濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系較好，SC50值為(56.26±3.07) μg/mL。與Vc清除DPPH和ABTS自由基的SC50相比，表明果汁提取物的抗氧化活性稍強于Vc。果渣提取物對DPPH自由基的清除率在4～40 μg/mL濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系較好，SC50值為(45.38±0.68) μg/mL；對ABTS自由基的清除率在50～150 μg/mL濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系較好，SC50值為(101.67±1.15) μg/mL，與Vc的SC50相比，表明果渣提取物的抗氧化活性弱于Vc。

表 1 無子刺梨果汁和果渣提取物對DPPH和ABTS自由基的半清除濃度Table 1 SC50 values of juice and pomace extracts of R. sterilis against DPPH and ABTS free radicals

2.2 無子刺梨果汁和果渣提取物的體內(nèi)抗氧化活性

由表2可知，ROS清除率分別為(84.8±3.4)%(P＜0.001)、(83.8±3.6)%和(52.2±6.7)%，表明無子刺梨果汁提取物和果渣提取物的ROS清除能力相當，且優(yōu)于陽性對照GSH。

表 2 果汁和果渣提取物的ROS清除率Table 2 ROS scavenging rates of fruit juice and pomace extracts %

2.3 無子刺梨果汁和果渣中3種主要化學(xué)成分的含量

由表3可知，無子刺梨果汁中總多酚、總黃酮和總?cè)频暮烤謩e高于果渣中的含量。其中，果汁總多酚達(32.81±0.19) mg/g，是果渣總多酚含量的1.51倍；果汁中的總黃酮含量為(29.62±0.06) mg/g，與果汁總多酚含量較為接近，是果渣總黃酮含量的2.45倍；果汁中的總?cè)坪扛哌_(61.88±0.62) mg/g，為果渣總?cè)坪康?.08倍。

表 3 果汁和果渣中3種主要化學(xué)成分的含量Table 3 Contents of total polyphenols, total flavonoids and total triterpenoids in the juice and pomace mg/g

3 結(jié)論與討論

本實驗采用DPPH、ABTS自由基清除活性和ROS清除活性測試方法評價了無子刺梨果汁提取物和果渣提取物的體內(nèi)外抗氧化活性，結(jié)果顯示，果汁提取物對DPPH和ABTS自由基的SC50分別 為(17.58±0.48) μg/mL和(56.26±3.07) μg/mL，果渣提取物對DPPH和ABTS自由基的SC50分別為(45.38±0.68) μg/mL和(101.67±1.15) μg/mL，果汁提取物和果渣提取物的ROS清除率分別為(84.80±3.40) %和(83.80±3.60) %，表明果汁提取物的體外抗氧化活性強于陽性對照Vc和果渣提取物。在DPPH自由基清除活性實驗中，發(fā)現(xiàn)果汁和果渣提取物的自由基清除率并未隨著樣品濃度的增加而遞增，可能是由于樣品溶液的顏色隨著濃度的增加而增加所致[20]。果汁提取物和果渣提取物的ROS清除率分別為(84.80±3.40)%和(83.80±3.60)%，表明2種提取物的體內(nèi)抗氧化活性相當，且均強于陽性對照GSH。同時，采用紫外分光光度法分別對果汁和果渣中主要有效成分總多酚、總黃酮和總?cè)频暮窟M行了測定，果汁中總多酚、總黃酮和總?cè)频暮糠?別 為(32.81±0.19)、(29.62±0.06)、(61.88±0.62)mg/g，果渣中總多酚、總黃酮和總?cè)频暮糠謩e為(21.66±0.29)、(12.11±0.05)、(15.16±0.22) mg/g，表明果汁中總多酚、總黃酮和總?cè)频戎饕瘜W(xué)成分的含量均高于果渣，并與其體外抗氧化能力呈正相關(guān)關(guān)系。

許多研究表明，多酚、黃酮及三萜類物質(zhì)是果蔬中主要的抗氧化物質(zhì)[26-29]，其抗氧化能力通常和這些物質(zhì)的含量呈正相關(guān)關(guān)系。如陳玉霞等[30]分析比較了常見25種蔬菜的體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)抗氧化活性與總多酚和總黃酮含量之間存在較大的相關(guān)性。在本研究中，無子刺梨果汁中總多酚、總黃酮和總?cè)频戎饕瘜W(xué)成分的含量均高于果渣中的含量，且果汁提取物的體外抗氧化能力也強于果渣，同樣也呈類似的正相關(guān)關(guān)系，說明這些物質(zhì)是無子刺梨體外抗氧化活性的主要化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，果汁提取物和果渣提取物中的總多酚、總黃酮和總?cè)频暮坎町愝^大，但二者的體內(nèi)抗氧化活性非常接近，推測可能是由于果渣提取物中含有其他的抗氧化物質(zhì)所致，值得進一步深入研究。本實驗僅對無子刺梨果汁提取物和果渣提取物的體內(nèi)外抗氧化活性及其主要化學(xué)成分含量進行了測定，其化學(xué)成分的分離鑒定和進一步的活性評價等值得深入研究，將為無子刺梨功能性產(chǎn)品進一步的開發(fā)利用等提供參考。