潘 輝 劉 芳 曾志浩 周麗麗 袁宗勝

（1. 閩江學(xué)院海洋研究院，福建 福州 350108；2. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

植物內(nèi)生細菌是指生活史的一定階段或全部階段均生活在健康植物的各種組織和器官內(nèi)部，并且與植物建立了和諧共關(guān)系的細菌[1]。內(nèi)生細菌通過自身產(chǎn)生代謝產(chǎn)物或借助信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對宿主植物生長發(fā)育產(chǎn)生重要影響，主要在促進宿主植物生長、增強宿主植物抗性及提高植物修復(fù)能力等方面[2]，如Microbacterium具有促進植物生長的作用[3]，Bacillus具有良好的生防潛力[4]，Sphingomonas對植物自我修復(fù)功能[5]等。相思類樹種屬含羞草科（Mimosaceae）金合歡屬（Acacia）的常綠喬木。研究表明，相思類樹種生長迅速、萌生能力強、根系發(fā)達，耐貧瘠、鹽堿和干旱，是沿海地區(qū)沙質(zhì)土壤更新造林的理想樹種[6]。圍繞相思類樹引種、栽培技術(shù)及經(jīng)營管理等方面已經(jīng)開展了系列研究[7-8]，關(guān)于相思樹根際與內(nèi)生微生物群落結(jié)構(gòu)差異性及關(guān)鍵微生物功能的研究鮮有報道，而這些方面的研究可為充分發(fā)揮相思樹種土壤改良、維持地力、水土保持功能等生態(tài)效益功能提供科學(xué)依據(jù)。本研究基于 Illumina NovaSeq 測序平臺，對不同種相思樹根內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)特征及差異性進行分析，并根據(jù)它們的分類預(yù)測內(nèi)生細菌種群的功能，為揭示相思樹內(nèi)生功能菌株的挖掘和利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

采樣地設(shè)在中國福建省漳浦中西國有林場，該區(qū)屬亞熱帶季風(fēng)氣候，地理座標(biāo)為117°56′ E，24°28′ N，年平均氣溫21.8 ℃，年降水量1 600 mm，地形為低山丘陵，土壤為沙質(zhì)頁巖發(fā)育的紅壤。2019年11月，分別采集厚莢相思（Acacia crassicarpa）、卷莢相思（A. cincinnata）、黑木相思（A. melanoxylon）、直 干 相 思（A. mearnsil）、馬占相思（A. mangium）等樹種（樹齡為8～10 a）的根部樣本。

樣本采集：隨機選取健壯植株，在距樹干1 m左右的位置用鐵鏟挖取50～60 cm深的樹根，將樹根取出作為根部樣本，樣本采集后立即放入無菌樣本袋中，24 h 內(nèi)放入 -20 ℃保存。本研究共采集樣本15個，每個植物種類3個重復(fù)樣本，每個植物種類樣本編號分別為厚莢相思的根（HJ.A）、卷莢相思的根（JJ.A）、黑木相思的根（HM.A）、直干相思的根（ZZ.A）、馬占相思的根（MZ.A）。

1.2 樣本基因組DNA提取及高通量測序

采用試劑盒TIANGEN Plant Genomic DNA kit并按照其說明書的步驟提取樣本基因組DNA。采用瓊脂糖電泳檢測基因組 DNA 的濃度和純度，將檢測合格的DNA進行PCR擴增形成測序文庫[9]，并將質(zhì)檢合格的文庫在Illumina NovaSeq PE250測序平臺進行16Sr RNA V5-V7區(qū)高通量測序。

1.3 分析方法

通過對測序得到的雙端 Reads（PE Reads）進行拼接、過濾、除去嵌合體序列，最終得到有效數(shù)據(jù)；在對有效數(shù)據(jù)進行在 97%相似度水平下的聚類后，獲得分類操作單元（OTU）。采用RDP Naive Bayesian Classifier分類算法進行注釋。使用BioVenn在線軟件進行Venn 圖繪制；使用Qiime 軟件計算觀測物種數(shù)、豐富度指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)等，分析不同種相思樹根內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)特征及差異[10-12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果及OUT分析

經(jīng)測序分析，5個相思樹種的15個樣本共獲得1 197 357 條clean tags，各樣本clean tags在69 799～86 919 之間。根據(jù)相似度在97%以上的序列聚類為一個 OTU原則進行有效OTUs統(tǒng)計，從圖1稀釋曲線可以看出，當(dāng)樣本測序深度達15 000條時，稀釋曲線都趨于平緩，表明本次測序深度足以可靠地描述與樣本相關(guān)的細菌群落。

圖 1 相似度為97%水平下的稀釋曲線Fig. 1 Rarefaction curves at 97% sequence similarity

圖2為不同種相思樹根內(nèi)生細菌 OTUs Venn圖。從不同樣本來源來看，不同種相思樹根部樣本 OTU 數(shù)目表現(xiàn)為直干相思 ＞ 厚莢相思 ＞ 馬占相思 ＞ 卷莢相思 ＞ 黑木相思。5種不同種相思樹根部樣本有365個共有OTUs，厚莢相思、卷莢相思、黑木相思、直干相思及馬占相思獨有的OTUs分別為282、110、100、341個及288個。

圖 2 OTU數(shù)量與分布Fig. 2 OTU distribution and Venn graphs

2.2 根內(nèi)生細菌多樣性分析

由表1可知，不同種相思樹根內(nèi)生細菌數(shù)量排序分別為：直干相思 ＞ 厚莢相思 ＞ 馬占相思 ＞卷莢相思 ＞ 黑木相思；不同種相思樹根內(nèi)生細菌多樣性排序分別為：直干相思 ＞ 厚莢相思 ＞ 馬占相思 ＞ 卷莢相思 ＞ 黑木相思。由此可知，不同種相思樹根內(nèi)生細菌的豐富度和多樣性的差異較大，直干相思根內(nèi)生細菌的豐富度和多樣性最高。

表 1 不同種相思樹根內(nèi)生細菌多樣性和物種豐富度Table 1 Diversity and relative abundance of endophytic bacterial community in root of Acacia species

2.3 細菌群落結(jié)構(gòu)分析

比較了綱水平上的根內(nèi)生細菌群落的相對豐度，如圖3a所示，在綱水平占據(jù)主導(dǎo)地位的主要包括Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria和Unidentified_Actinobacteria。在厚莢相思、卷莢相思的根內(nèi)生細菌中Alphaproteobacteria占主導(dǎo)地位，其次為Gammaproteobacteria和Unidentified_Actinobacteria；黑木相思和直干相思的根內(nèi)生細菌中Alphaproteobacteria占主導(dǎo)地位，其次為Unidentified_Actinobacteria和Gammaproteobacteria；而馬占相思的根內(nèi)生細菌中，則以Gammaproteobacteria為主導(dǎo)地位，其次為Alphaproteobacteria和Unidentified_Actinobacteria。在綱水平，不同種相思樹根內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)存在差異。

在目水平上，如圖3b所示，不同種相思樹樣本優(yōu)勢菌群存在較大差異。在厚莢相思、卷莢相思和直干相思的根內(nèi)生細菌中Rhizobiales占主導(dǎo)地位，其次為unidentified_Gammaproteobacteria和Pseudonocardiales；黑木相思的根內(nèi)生細菌中Rhizobiales占主導(dǎo)地位，其次為unidentified_Gammaproteobacteria和Frankiales；而馬占相思的根內(nèi)生細菌中，則以Rhizobiales、Enterobacteriales和Unidentified_Gammaproteobacteria為主導(dǎo)地位，不同種相思樹根內(nèi)生細菌群落在目水平相對豐度存在較大差異，其中馬占相思樹種根內(nèi)生細菌群落中Enterobacteriales相對豐度最高。

在科水平上如圖3c所示，5 組樣本豐度前10的細菌包括Xanthobacteraceae、Beijerinckiaceae、Enterobacteriaceae、Pseudonocardiaceae、Burkholderiaceae、unidentified_Gammaproteobacteria、Pseudomonadaceae、unidentified_Acidobacteriales、Caulobacteraceae、Acidothermaceae。 通過比較不同種相思樹根內(nèi)生細菌群落豐度比例可知，在厚莢相思和直干相思的根內(nèi)生細菌中Xanthobacteraceae占主導(dǎo)地位，其次為unidentified_Acidobacteriales；卷莢相思和黑木相思的根內(nèi)生細菌中Xanthobacteraceae占主導(dǎo)地位，其次為Beijerinckiaceae；而馬占相思的根內(nèi)生細菌中，則以Enterobacteriaceae為主導(dǎo)地位，其次為Burkholderiaceae、Xanthobacteraceae、Pseudonocardiaceae、Pseudomonadaceae等。Beijerinckiaceae在卷莢相思和黑木相思細菌群落豐度比例較大；unidentified_Acidobacteriales在厚莢相思和直干相思樹種中群落豐度比例較大；Enterobacteriaceae在馬占相思樹種中所占豐度比例最大。不同種相思樹根內(nèi)生細菌群落在科水平相對豐度存在較大差異。

圖 3 不同種相思樹根內(nèi)生細菌群落的相對豐度Fig. 3 Relative abundance of endophytic bacterial community in root of Acacia species

3 結(jié)論與討論

根部是植物的重要組織，是植物主要的營養(yǎng)和水份的吸收組織，內(nèi)生細菌在植物組織內(nèi)，依賴植物提供的有機物質(zhì)和其他衍生物而存活，其活動產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對植物的生長也起著重要的作用。植物根的分泌物和粘液衍生的營養(yǎng)物質(zhì)吸引了無數(shù)的有機體到根際環(huán)境中，但植物相關(guān)的細菌必須高度競爭才能成功地在根內(nèi)定殖[13-16]，而不同樹種根部可能存在著不同的營養(yǎng)吸收和分泌物的能力，可能導(dǎo)致了定殖在根內(nèi)的細菌群落的差異性[17-22]。

本研究中發(fā)現(xiàn)，大部分相思樹綱水平上占優(yōu)勢的根際細菌是Alphaproteobacteria，目水平上占優(yōu)勢的是Rhizobiales。這不僅表明相思樹根際細菌群落的建立有一定的細菌菌群建立規(guī)律；而且Rhizobiales目的菌尤其是根瘤菌屬的菌能與豆科植物共生固氮，對豆科植物及種植地土壤都有良好作用[23-24]，如根瘤菌屬和慢性根瘤菌屬都能從豆科植物根毛侵入根內(nèi)形成根瘤，并在根瘤內(nèi)成為分枝的類菌體，類菌體將分子氮還原成NH3，分泌至根瘤細胞內(nèi)，并合成酰胺類或酰尿類化合物，輸出根瘤，由根的傳導(dǎo)組織運輸至宿主地上部分供利用。宿主為根瘤菌提供碳源和能源以及其他必需營養(yǎng)，而根瘤菌則為宿主提供氮素營養(yǎng)[25-26]。同時根菌瘤在生活過程中可利用多種碳水化合物，并分泌相當(dāng)量的胞外粘液把有機氮帶到土壤中，這樣就可以從環(huán)境中吸引了大量的根際微生物和生物從而大大提高了土壤的肥力[25]。這說明可通過人為選擇種植相思樹來“管理”土壤細菌群落，管理土壤肥力，從而改變和改善人工林的土壤養(yǎng)分和結(jié)構(gòu)，這對人工林具有長期良好的影響。

在科水平上，厚莢相思、卷莢相思、直干相思和黑木相思的根內(nèi)生細菌中優(yōu)勢菌為Xanthobacteraceae，該科的細菌多為無動力、氧化酶陽性的革蘭陰性桿菌，主要存在于有水的環(huán)境和潮濕的環(huán)境里[11]。而在馬占相思的根內(nèi)生細菌中，則以Enterobacteriaceae占主導(dǎo)地位，該科的多數(shù)細菌有周身鞭毛，能運動，可在土壤或水中生存[11]。馬占相思與其他幾種相思樹相比，其生長速度較快，涵養(yǎng)水源，木質(zhì)均勻，葉蛋白質(zhì)和氨基酸含量豐富。黃維南等[27]報道按每株馬占相思的干葉狀柄平均按26.1 kg計算，則其含有14.44 g尿囊素。尿囊素是一種脈類植物生長調(diào)節(jié)劑，可增強光合能力，提高根際微生物活性。

植物與內(nèi)生細菌在長期的共同進化中已經(jīng)建立了一種和諧聯(lián)合的共生關(guān)系[1]?，F(xiàn)有研究表明，植物內(nèi)生細菌可以通過自身的代謝或借助于信號傳導(dǎo)作用對植物體施加影響[2-5]。目前微生物菌劑或生物菌肥等受到人們的重視，其目標(biāo)菌種多為從土壤中篩選得到，而內(nèi)生菌可以從植物體表進入植物體內(nèi)，并能夠在植物體內(nèi)定殖[28]，因此，內(nèi)生細菌作為重要的微生物資源在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有良好的研究和開發(fā)潛力。加強植物內(nèi)生細菌資源的研究，加強內(nèi)生細菌與植物之間生態(tài)關(guān)系的研究，以及建立各種功能內(nèi)生細菌的資源庫具有重要的意義。