余政梁，丁光樹，蔡惠鞠，王佳欣，孫 輝，李萬水,*

（1. 公安部鑒定中心，北京 100038；2. 牡丹江市公安局，黑龍江 牡丹江 157000）

Y-STR因其男性遺傳特點，常用于父系家族及親緣關(guān)系排查，可為案件提供線索、確定偵查范圍，故現(xiàn)場生物檢材的Y-STR信息價值愈益受到重視并被挖掘[1-2]，圍繞Y-STR復(fù)合擴增檢測體系的研究亦成熱點。DYS460位于Y染色體q11位置，公開信息顯示其核心重復(fù)序列為[CTAT]n，是國內(nèi)確定的核心Y-STR基因座之一，現(xiàn)包含于多個復(fù)合擴增體系中[3-5]。DYS460基因座在不同體系中的片段長度及等位基因范圍見表1，在DNATyper17+28Y復(fù)合擴增體系中的等位基因范圍為7～14，原片段長度在514～545 bp之間。等位基因標準品是保證分型準確的關(guān)鍵，其制備過程包括篩選等位基因分型、質(zhì)粒與標準品制備等步驟[6-7]。對此，研究者首先要獲得該基因座的序列，對序列進行分析以確定核心序列（核心序列一般具有唯一性），再根據(jù)核心序列的重復(fù)次數(shù)，制備出包含不同大小片段的質(zhì)粒，通過擴增質(zhì)粒最終獲得基因座的等位基因標準品。當以不同體系進行分型驗證比較時，若出現(xiàn)分型不一致，就需要查找異常的原因，多由側(cè)翼序列改變及序列中包含兩段核心重復(fù)序列導(dǎo)致。本研究在對DNATyper17+28Y復(fù)合擴增體系進行準確性驗證時，發(fā)現(xiàn)部分樣本DYS460基因座的分型與其他體系不一致，故而對DYS460基因座分型異常進行了探究，結(jié)果顯示該基因座序列中有相鄰的兩段[CTAT]n重復(fù)序列，若選擇其中不同的重復(fù)序列擴增分型，就會產(chǎn)生不同的分型結(jié)果。這一發(fā)現(xiàn)可為因核心重復(fù)序列選擇差異所致分型異常的分析提供參考借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣本

標準品9948和2800（蘇州新海生物科技股份有限公司），兩名志愿者的血卡A與B及其用磁珠法提取的DNA；其中9948、血卡A的DYS460分型在DNATyper17+28Y體系和其他體系中一致，均為11；2800、血卡B的不一致，在DNATyper17+28Y體系中分別為10、12，而在其他體系中均為11。

1.2 DNA擴增與產(chǎn)物檢測

設(shè)計DYS460基因座無熒光標記通用引物，見表2，擴增產(chǎn)物大小約1 000 bp，包含原熒光產(chǎn)物片段。擴增體系為50 μL，熱啟動前程序為72 ℃、20 min，95 ℃、11 min；擴增程序為94 ℃、30 s，60 ℃、2 min，72 ℃、1 min，55個循環(huán)；60 ℃、1 h，4 ℃保存。上述4份DNA樣本用ProFlex PCR儀（Life Technologies , 美國）擴增。瓊脂糖凝膠電泳確定片段大小。

表1 不同體系中DYS460基因座片段長度及等位基因范圍Table 1 Amplicon sizes and alleles of DYS460 locus tested with different systems

表2 DYS460通用引物序列Table 2 Universal primers’ sequences for DYS460

1.3 DNA測序

對4個樣本進行Sanger測序（生工生物工程股份有限公司，上海）。

2 結(jié)果

2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

采用本研究設(shè)計的通用引物對4個樣本進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物（用于測序）經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果目的條帶單一、清晰，且與通用引物設(shè)計時所預(yù)判的片段大小相一致（圖1）。

2.2 測序結(jié)果

對標準品9948、2800、血卡A和B的擴增產(chǎn)物DNA進行測序，在DNATyper17+28Y復(fù)合體系中， DYS460原設(shè)計引物之間的序列如表3示，分析發(fā)現(xiàn)，該基因座中有相距107 bp的兩個數(shù)目可變的相同重復(fù)序列，其等位基因序列結(jié)構(gòu)為5’-287bp-[CTAT]n- 107bp-[CTAT]m-54bp-3’，其中[CTAT]n距引物起始端287 bp。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（從左到右依次為9948、2800、血卡A、血卡B）Fig. 1 The results of the amplified products of 9948, 2800, blood cards A and B (from left to right) to undergo agarose gel electrophoresis

表3 4個樣本的DNA測序結(jié)果Table 3 Sequencing results of four amplified products

對DNATyper17+28Y復(fù)合擴增體系中DYS460基因座的質(zhì)粒序列進行分析，發(fā)現(xiàn)其構(gòu)建的等位基因標準品是以[CTAT]n為核心重復(fù)序列命名，忽視了[CTAT]m，因而導(dǎo)致了分型異常。該體系DYS460基因座等位基因標準品核心序列重復(fù)數(shù)及對應(yīng)片段大小見表4。4個樣本其DYS460基因座[CTAT]n的重復(fù)次數(shù)分別為10、9、10、11，而[CTAT]m則均為11（比合成質(zhì)粒對應(yīng)位置增加了1次重復(fù)），導(dǎo)致它們DNATyper17+28Y體系所測最終分型為11、10、11、12。其他體系如DNATyperY36，因擴增片段短，僅包含[CTAT]m，4個樣本分型均為11。

表4 DNATyper17+28Y體系中DYS460基因座等位基因標準品核心重復(fù)數(shù)及片段大小Table 4 The core repeats and fragment size of standard alleles of the DYS460 contained with DNATyper17+28Y system

3 討論

構(gòu)建STR擴增體系，要保證建立的不同體系能得到一致的分型。因側(cè)翼序列改變造成分型不一致、等位基因丟失等情況已得到廣泛關(guān)注[8-12]，然而對于序列中包含兩段核心重復(fù)序列的情況報道較少，雖有關(guān)于DYS389Ⅰ和Ⅱ的研究[13]，但對DYS460則未見報道。對于DYS389基因座，設(shè)計一組引物，可同時擴增Ⅰ和Ⅱ（一般擴增的DYS389Ⅱ片段包含389Ⅰ），增加了其多態(tài)性。當序列中包含兩段相同核心重復(fù)序列，但所在體系無法同時獲得該兩個等位基因分型，而易造成該基因座分型錯誤時，研究人員需要對兩個核心重復(fù)序列進行甄別判斷，并同時與其他體系中的核心重復(fù)序列作比較，從而最終選擇確定一段核心重復(fù)序列用于等位基因的分型判定。以本研究為例，DYS460的目的片段中包含兩段相同的核心序列，而檢測時只能獲得1個等位基因分型，原因在于兩段可變序列造成的片段長度差異導(dǎo)致了個體分型的不同。為解決該問題，本研究對原引物序列進行了調(diào)整，使擴增片段中只包含一條核心序列，以此保證了DYS460分型的準確性。

綜上，在構(gòu)建STR擴增體系時，對于目的片段較大的基因座，有必要對序列進行比較分析，當該基因座序列中含有復(fù)雜重復(fù)序列時，如含有兩段相同核心重復(fù)序列或側(cè)翼區(qū)有固定的核心序列重復(fù)數(shù)時，應(yīng)當仔細甄別，確定該基因座核心重復(fù)序列是否具唯一性，并根據(jù)核心重復(fù)序列命名規(guī)則確定等位基因標準品的分型，設(shè)計不同的引物或簡并引物，且要與其他體系作比較驗證，以保證分型準確無誤。