白 星 周 嬌 杜少蕊 田 昕

骨肉瘤是一種復(fù)雜的基因性疾病[1]，其轉(zhuǎn)移率和病死率很高，常規(guī)治療手段效果不佳[2]。既往研究結(jié)果顯示，骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展與Survivin基因密切相關(guān)，抑制 Survivin 基因可影響骨肉瘤的細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡以及侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。我們構(gòu)建了重組腺病毒載體Survivin-shRNA，并通過(guò)皮下異種移植法構(gòu)建裸鼠骨肉瘤模型，分析Survivin基因沉默對(duì)骨肉瘤裸鼠自噬相關(guān)蛋白LC3、P62與mTOR的表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

MG-63細(xì)胞株來(lái)源于上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；LC3、P62、mTOR試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，SPF級(jí)裸鼠共48只，購(gòu)自于西安交大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》(國(guó)家科學(xué)技術(shù)部，2006年頒布)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 裸鼠骨肉瘤模型的構(gòu)建

構(gòu)建Survivin-shRNA載體并轉(zhuǎn)染至MG-63細(xì)胞，挑選轉(zhuǎn)染穩(wěn)定的細(xì)胞用于下一步實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)將其分為3組：CON組、GFP組、Survivin-shRNA組。取1×107單細(xì)胞懸液，加入50 ml PBS，先在5只裸鼠皮下注射，當(dāng)裸鼠體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)達(dá)到長(zhǎng)徑5 mm時(shí)切除。然后將瘤體切碎，組織塊以1～2 mm3大小重新接種，即可獲得裸鼠骨肉瘤模型。

1.3 腫瘤生長(zhǎng)曲線的繪制

裸鼠腫瘤細(xì)胞接種完成后,逐日觀察接種部位有無(wú)感染,腫瘤生長(zhǎng)后有無(wú)自然消退，采用卡尺測(cè)定腫瘤體積，采用(長(zhǎng)×寬)2/2即可計(jì)算出腫瘤體積，并據(jù)此繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。

1.4 Western blot檢測(cè)LC3、P62及mTOR蛋白表達(dá)

將裸鼠骨肉瘤組織標(biāo)本切取后，機(jī)械研磨成細(xì)胞或組織碎片，PBS洗滌后離心沉淀，以5倍冰預(yù)冷的懸浮緩沖液分散細(xì)胞；離心10 min后吸出上清液移于試管中，沸水浴加熱3 min，提取骨肉瘤組織蛋白。蛋白的表達(dá)水平根據(jù)GAPDH標(biāo)化并通過(guò)軟件進(jìn)行灰度掃描、定量。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)LC3、P62及mTOR蛋白表達(dá)水平

標(biāo)本用4%多聚甲醛常規(guī)固定，蠟塊制作并切片；分別加0.3%過(guò)氧化氫甲醇溶液30 min、0.3%Triton X-100 30 min、血清稀釋液稀釋的一抗，4℃ 24～48 h，然后加PBS稀釋的二抗，室溫孵育2 h，加ABC復(fù)合物，沖洗后加顯色液進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色，裸鼠骨肉瘤組織標(biāo)本切取后，用4%多聚甲醛常規(guī)固定，取材并置20%蔗糖溶液中過(guò)夜。蠟塊制作、切片；加0.3%過(guò)氧化氫甲醇溶液30 min，PBS清洗；加配好的0.3%Triton X-100 30 min，PBS清洗；加血清稀釋液稀釋的一抗，4℃ 24～48 h，吸去抗體，PBS清洗；加PBS稀釋的二抗，室溫孵育2 h，PBS清洗；加ABC復(fù)合物，室溫孵育2 h，PBS沖洗5 min×3，蒸餾水沖洗3遍；加顯色液進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色，在顯微鏡下進(jìn)行觀察，待細(xì)胞著色而背底顏色較淡時(shí)馬上吸去顯色液，用蒸餾水迅速?zèng)_3遍，加PBS終止反應(yīng)；梯度酒精脫水之后，封片，在顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 腫瘤生長(zhǎng)曲線

用卡尺測(cè)定腫瘤體積，結(jié)果如圖1所示，與CON和GFP組相比，Survivin-shRNA組裸鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)速度較緩慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 裸鼠骨肉瘤生長(zhǎng)曲線

2.2 Western blot結(jié)果顯示各組裸鼠蛋白表達(dá)水平

Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與CON和GFP組相比，Survivin-shRNA組中LC3、P62蛋白表達(dá)水平升高，mTOR蛋白表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，如圖2所示。

圖2 Western blot分析各組蛋白表達(dá)水平

2.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示各組裸鼠蛋白表達(dá)水平

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，LC3與P62表達(dá)在治療組中明顯高于對(duì)照組，而mTOR表達(dá)相反，經(jīng)檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。如圖3所示。

圖3 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示各組蛋白表達(dá)水平

3 討論

骨肉瘤是青少年最常見的惡性骨腫瘤，病變來(lái)源于間充質(zhì)細(xì)胞，多發(fā)于四肢長(zhǎng)骨干骺端，以股骨遠(yuǎn)端最常見，以紡錘形的惡性腫瘤細(xì)胞形成不成熟的骨質(zhì)為特點(diǎn)[4]。近年來(lái)骨肉瘤發(fā)病率持續(xù)上升，轉(zhuǎn)移率和病死率很高，治療方法主要包括傳統(tǒng)手術(shù)切除、新輔助化療和放療，但患者預(yù)后未見明顯改善，治療效果往往不滿意[5]。在骨肉瘤患者中，1/5因初診時(shí)已遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療失敗和死亡[6]。近年來(lái)，基因干擾技術(shù)發(fā)展越來(lái)越成熟，大量研究表明，基因干擾可通過(guò)阻斷Survivin表達(dá)來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞[7]?；蛑委熍c傳統(tǒng)藥物相比，特異性強(qiáng)，效果較好，人體反應(yīng)較輕。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于Survivin基因與惡性腫瘤關(guān)系進(jìn)行了深入研究，我們前面的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，Survivin在骨肉瘤中特異高表達(dá)，因此Survivin靶向治療的嘗試將很有前途[8]。

骨肉瘤嚴(yán)重影響青少年的身體健康和生命安全，因此建立準(zhǔn)確的、具有骨肉瘤特性的動(dòng)物模型至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)采用皮下異種移植法，從整個(gè)實(shí)驗(yàn)的過(guò)程和結(jié)果來(lái)看，該方法造模成功率較高，值得推廣應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)卡尺測(cè)定并通過(guò)公式計(jì)算腫瘤體積，并且繪制了腫瘤生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示，Survivin-shRNA組的腫瘤體積增加的幅度明顯較對(duì)照組小，這表明Survivin-shRNA可抑制骨肉瘤的生長(zhǎng)。

細(xì)胞通過(guò)自身溶酶體清除受損的細(xì)胞器以及功能異常的蛋白質(zhì)的過(guò)程，我們稱之為細(xì)胞自噬。就本質(zhì)而言，自噬是一種保護(hù)機(jī)制，平時(shí)可使體內(nèi)細(xì)胞免受損傷。然而，過(guò)度的自噬效應(yīng)則會(huì)帶來(lái)細(xì)胞死亡的風(fēng)險(xiǎn)[9]。自噬相關(guān)蛋白中，LC3相當(dāng)重要，可分為Ⅰ型和Ⅱ型，LC Ⅰ存在于胞質(zhì)中，LC3Ⅱ存在于自噬體膜上，參與自噬機(jī)制[10]。本研究Western Blot法和免疫組織化學(xué)法結(jié)果均發(fā)現(xiàn)，與CON和GFP組相比，Survivin-shRNA組中LC3、P62蛋白表達(dá)水平升高，mTOR蛋白表達(dá)水平降低，表明Survivin基因沉默后，裸鼠骨肉瘤細(xì)胞自噬活性上升，這有利于殺滅腫瘤細(xì)胞。

綜上所述，Survivin-shRNA可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖能力，其機(jī)制可能是與調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白LC3、P62與mTOR的表達(dá)有關(guān)。