龔詩媚，鄧雅妮，張曼，王東偉，王凱，趙雷，胡卓炎

(華南農業(yè)大學 食品學院，廣東 廣州，510642)

貝氏酵母(Saccharomycesbayanus)是一種常用于發(fā)酵西打果酒的酵母菌，已在蘋果西打果酒商業(yè)中得以應用。研究顯示，貝氏酵母在果酒發(fā)酵過程中能產生豐富的揮發(fā)性風味物質，增加酒體的香氣[1]。JANUSZEK等[1]將貝氏酵母發(fā)酵的蘋果白蘭地與釀酒酵母(Saccharomycescereisiae)發(fā)酵的果酒進行比較，結果表明前者中的香氣成分(包括醋酸酯、乙酸異戊酯、棕櫚酸乙酯)濃度明顯增加。EGLINTON等[2]將貝氏酵母應用于葡萄酒發(fā)酵，結果顯示在發(fā)酵過程中產生了更多的甘油、乙醛和較少的乙酸、蘋果酸等物質，并在感官方面，賦予了果酒“熟橘皮”、“堅果”等風味。此外，有研究人員為使酒體的揮發(fā)性物質更加豐富，將貝氏酵母與其他菌株混合應用到獼猴桃酒的發(fā)酵[3]?？梢娎秘愂辖湍赴l(fā)酵的果酒具有更高的風味強度，增加果酒風味的豐富性。

荔枝(LitchichinensisSonn.)屬于無患子科熱帶和亞熱帶水果，因其誘人的顏色、獨特的風味、豐富的營養(yǎng)和保健作用而受到人們的喜愛[4]。荔枝果肉含有多種營養(yǎng)成分，如碳水化合物、蛋白質、必需氨基酸、維生素和礦物質，其含量因荔枝品種而異[5]。由于新鮮荔枝采后壽命短，貯藏時間過久會導致其中的活性成分迅速流失，極大地影響其貯藏性和市場價值[6]。釀酒是荔枝深加工的重要途徑，通過發(fā)酵不僅可以保留原始果汁中的大部分營養(yǎng)成分，還可產生包含氨基酸在內的其他營養(yǎng)物質[7]，在合理利用荔枝資源的同時提高荔枝產業(yè)的經濟效益。

目前已有研究者探討荔枝果酒和啤酒的風味成分和抗氧化特性[8-10]，但將貝氏酵母應用于荔枝酒發(fā)酵的研究還鮮見報道，因而研究貝氏酵母對荔枝酒揮發(fā)性風味物質的影響對提高荔枝果酒的品質有重要意義。采用電子鼻和氣相色譜-離子遷移譜(gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS)等技術分析食品的揮發(fā)性成分特征備受重視[11-12]。故本文采用貝氏酵母發(fā)酵制備荔枝果酒，利用電子鼻和GC-IMS技術對其發(fā)酵過程中揮發(fā)性風味成分的變化進行分析，以期為荔枝酒的開發(fā)利用及其品質的控制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荔枝，品種為妃子笑 (LitchichinensisSonn c.Feizixiao)，產地為海南，鮮果當天運回實驗室進行處理，并于-20 ℃以下凍藏備用；貝氏酵母(商品名SafCider)，法國Fermentis酵母公司。

PEN3電子鼻系統(tǒng)，德國Airsense公司；LHS-HC-250恒溫恒濕培養(yǎng)箱，廣州市深華生物技術有限公司；BS110S電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；Flaour Spec 1H1-00053型風味分析儀，配有分析軟件包括LA(Laboratory Analytical iewer)、Reporter 插件、Gallery Plot插件以及GC×IMS Library Search)，德國G.A.S公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

選擇充分成熟，無腐爛變質的荔枝去皮去核后打漿處理并過濾，隨后離心得荔枝清汁。發(fā)酵條件參照文獻[1,8-9]，為抑制雜菌繁殖，加入120 mg/L偏重亞硫酸鉀，調整糖度為20°Brix，加入0.3 g/L貝氏酵母于20 ℃條件下進行發(fā)酵。于0、2、4、6、8、10 d采集發(fā)酵液，制備分析樣品，立即于-80 ℃下保存，待分析。

1.2.2 電子鼻分析

表1為PEN3型電子鼻10個金屬傳感器的陣列及性能描述。參照CAO等[11]方法，稍作修改。準確量取5 mL樣品于30 mL樣品瓶中，加密封蓋，室溫富集30 min后將進樣針插入樣品瓶采用頂空吸氣法進行電子鼻分析試驗。測試前對電子鼻參數(shù)進行設置，傳感器清洗時間100 s，傳感器歸零時間5 s，樣品準備時間5 s，進樣流量 150 mL/min，檢測時間120 s。完成每次檢測系統(tǒng)進行清零和標準化后再測試下一個樣品，每種樣品重復3次測定，采用電子鼻軟件WinMuster對所測數(shù)據(jù)進行主成分分析(principal component analysis，PCA)和載荷分析。

表1 PEN3傳感器陣列及性能描述Table 1 Sensor arrays and performance specification of electronic nose PEN3

1.2.3 氣相色譜-離子遷移譜分析

參考陳小愛等[12]的方法，并稍加修改。

制樣方法：稱取1 mL樣品，置于20 mL頂空瓶中待分析；頂空孵化溫度70 ℃，孵化時間15 min，孵化轉速500 r/min，進樣體積200 μL，進樣針溫度85 ℃。

GC條件：MXT-WAX(30 m×0.53 mm，1 μm)色譜柱，色譜柱溫60 ℃，運行時間30 min，載氣為高純度N2；載氣流速：起始2 mL/min保持2 min，在2～20 min線性增加至100 mL/min，保持10 min。

IMS條件：在500 /cm的電場下施加氚源，漂移管長度為9.8 cm，漂移氣為高純度N2，流速150 mL/min，漂移管溫度45 ℃。

揮發(fā)性風味物質的相對百分含量測定：運用GC-IMS內置的數(shù)據(jù)庫進行二維定性，根據(jù)定性物質峰面積計算相對百分含量，應用于相對活度值(relatie odor actiity alue，ROA) 計算。

1.2.4 ROA分析

參考劉登勇等[13]的方法，計算ROA，考察樣品總體風味貢獻最大的組分：ROAstan=100，對其他組分活度值按公式(1)計算：

(1)

式中：CA，各風味組分的相對百分含量，%；TA,各風味組分的感覺閾值；Cstan,樣品風味貢獻最大成分的相對百分含量，%；Tstan，風味貢獻最大組分的感覺閾值。其中風味物質的相對百分含量均由GC-IMS測定得出。ROA≥1的組分為所分析樣品的關鍵風味化合物，0.1≤ROA<1的組分對樣品的總體風味具有重要的修飾作用。

1.2.5 感官評定

參考秦獻泉等[14]對荔枝果酒的模糊綜合評判法進行研究，評價指標包括色澤、香氣、口味和風格4項，總分值為100，各項權重分別為0.1、0.4、0.3和0.2，各項評價分5個等級：很好、較好、一般、較差和差。評定人員由8名經過培訓的具有食品專業(yè)背景的人員組成。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 2018統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)并作圖，采用SPSS Statistics 25軟件進行鄧肯單因素方差分析(P<0.05)；采用GC-IMS自帶儀器分析軟件，包括LA、Reporter和Gallery plot對樣品揮發(fā)性成分進行采集和分析，通過保留指數(shù)(retention index，RI)和漂移時間與GC-IMS文庫以及峰面積歸一化處理進行化合物定性定量分析。

2 結果與分析

2.1 電子鼻對荔枝酒發(fā)酵過程中揮發(fā)性風味物質的特征分析

電子鼻技術是基于氣體傳感陣列響應圖譜識別氣體的電子系統(tǒng)，是一種用途廣泛、實時無損的揮發(fā)性風味物質分析檢測方法[15]。荔枝酒發(fā)酵過程中揮發(fā)性風味物質在電子鼻傳感器響應信號強度如圖1所示，樣品響應強度較突出的傳感器有W1C、W5S、W5C、W1W和W2S，它們分別對芳香成分、氮氧化合物、烷烴、萜烯類、硫化物、醇類和醛酮類物質靈敏。其中W5S傳感器響應值最高，并且荔枝酒在發(fā)酵期間該傳感器上的響應值有較大差異，表明傳感器W5S對荔枝酒的發(fā)酵程度可較好地區(qū)分。其次W1W(硫化物)響應值呈現(xiàn)降低的趨勢，由于硫化物具有臭雞蛋味，對樣品氣味起負面作用，因此樣品的硫化物響應值越低越好。結果表明，經過貝氏酵母發(fā)酵的荔枝酒主要揮發(fā)性風味物質為氮氧化合物、烷烴、醇類及醛酮類，可根據(jù)對應傳感器的響應值大小判定荔枝酒的發(fā)酵程度。

圖1 荔枝酒發(fā)酵過程中電子鼻響應雷達圖Fig.1 Radar diagram of electronic nose response during litchi wine fermentation

2.2 GC-IMS對荔枝酒發(fā)酵過程中揮發(fā)性風味物質的特征分析

電子鼻測定結果僅能得到樣品揮發(fā)性風味物質的整體輪廓，顯示發(fā)酵過程中荔枝酒響應信號的差異。為了更全面且細致的分析荔枝酒發(fā)酵過程中揮發(fā)性風味物質變化，采用氣相色譜-離子遷移譜技術進行分析，結果如圖2所示，縱坐標表示GC保留時間，橫坐標代表反應離子峰遷移時間。在1.0～1.8 ms的遷移時間內，200～1 200 s的保留時間內，有效的揮發(fā)性風味物質較多。運用GC-IMS內置的數(shù)據(jù)庫進行二維定性，共檢出60種化合物，其中定性出41種揮發(fā)性風味物質。圖中藍色背景上每個亮點代表一種揮發(fā)性物質，由白到紅，濃度升高。由圖2可知，發(fā)酵過程揮發(fā)性風味化合物的含量和種類在2 d后明顯增加，而發(fā)酵后期揮發(fā)性風味物質的含量和種類差異較小，與電子鼻分析的測定結果相符。

圖2 荔枝酒發(fā)酵過程揮發(fā)性風味化合物 GC-IMS二維俯視圖Fig.2 Two-dimensional GC-IMS top iew of olatile flaor compounds during litchi wine fermentation

圖3是運用LA軟件與插件“Gallery plot”選取每種樣本譜圖中揮發(fā)性物質信號峰進行排序形成指紋圖，橫軸為一個樣品檢測出的所有揮發(fā)性成分，縱軸為不同發(fā)酵時間的樣品。顏色深淺程度代表揮發(fā)性化合物的含量，含量越高的顏色越亮。

圖3 荔枝酒發(fā)酵過程揮發(fā)性風味成分GC-IMS指紋圖譜Fig.3 GC-IMS fingerprint of olatile flaor compounds in the fermentation process of litchi wine

由于單體離子和中性分子可能在漂移區(qū)形成附屬物，因此可能產生單倍體(M)、二聚體(D)和三聚體(T)[16]，未經鑒定的揮發(fā)性風味化合物用數(shù)字進行標識。其中A區(qū)為荔枝汁(0 d)與發(fā)酵后荔枝酒共有的揮發(fā)性成分，分別為2-甲基丙醛(M)、正丙醇和丁酸乙酯(M)。B區(qū)為僅在發(fā)酵第2 天時大量存在的揮發(fā)性物質，且隨著發(fā)酵時間的增加迅速降低，分別為2-甲基丁醛、丙醛(M/D)、3-羥基-2-丁酮(M/D)、2-甲基丙醛(D)、甲酸乙硫醚和正丁醇。C區(qū)為發(fā)酵過程新產生且含量較高的揮發(fā)性物質，以乙酸酯類為主，包括乙酸丁酯(D)、乙酸丙酯(M)、乙酸異戊酯(M)等，該結果與JANUSZEK等[1]使用貝氏酵母發(fā)酵蘋果白蘭地的香氣成分相似。這是由于釀酒酵母有2種AAT酶(ATF1和ATF2)，而在貝氏酵母中存在另一種AAT酶(Lg-ATF1)，并且ATF1是合成乙酸酯類重要的酯合酶，醇乙酰基轉移酶(AATase)主要由基因ATF1、ATF2和Lg-ATF1編碼，催化酵母中乙酰輔酶A(acetyl-CoA)和乙醇結合，生成乙酸酯類[17]。

對GC-IMS測定的荔枝酒發(fā)酵過程中揮發(fā)性風味化合物進行PCA載荷分析，結果如圖4所示。

圖4 不同發(fā)酵時間樣品中揮發(fā)性風味化合物PCA載荷圖Fig.4 PCA loading plots of olatile flaor compounds in samples at different fermentation times

第一主成分的貢獻率為66.98%，第二主成分的貢獻率為22.25%，總貢獻率為89.23%，具有較好的代表性。與電子鼻結果一致，PCA結果可較好地將原汁和發(fā)酵后期的荔枝酒區(qū)分開來，且在發(fā)酵后的第6、8、10天較為接近。其中在發(fā)酵第2天，起到主要作用的揮發(fā)性物質分別是丙醛M/D、2-甲基正丁醛、2-甲基丙醛M/D、3-羥基-2-丁酮、甲酸乙硫醚。隨著發(fā)酵時間的增加，在第6、8和10天起主要作用的揮發(fā)性物質以酯類物質為主，主要包括乙酸丁酯M、乙酸乙酯、乙酸丙酯D、乙酸異戊酯T、丁酸乙酯T等揮發(fā)性風味物質，其中丁酸乙酯和乙酸丁酯賦予荔枝酒甜香、果香，乙酸異戊酯具有強烈的水果香氣，似香蕉味，且癸酸乙酯具有新鮮的水果香味和酒香味[18]。

2.3 荔枝酒發(fā)酵過程揮發(fā)性風味物質的ROA

采用ROA法確定GC-IMS測定的荔枝酒發(fā)酵過程中關鍵揮發(fā)性風味化合物，以此進一步評價揮發(fā)性物質對總體風味的貢獻?；谇叭说难芯抗ぷ?，已表明揮發(fā)性風味物質的含量與特征香氣并非呈直接的比例關系，由于不同物質的閾值差異大，起到的嗅覺反應也不同，揮發(fā)性風味化合物對食品總體風味的貢獻由其濃度和感覺閾值共同決定[19]。按照公式(1)計算獲得的揮發(fā)性風味物質的ROA如表2所示。荔枝原汁中有4種關鍵風味化合物，分別為丁酸乙酯(甜香、蘋果香)、異丁醛(草香、麥芽香)、己醛(青草、脂肪氣味)和丙醛。而經貝氏酵母發(fā)酵后荔枝酒的關鍵風味化合物主要有丁酸乙酯、二氫草莓酸乙酯、異丁醛(草香、麥芽香)、乙酸異戊酯(果香、香蕉味)、己酸乙酯(香蕉味、菠蘿味)、辛酸乙酯(果香、脂香)。有研究者也證實采用酵母(D10，Lallemand Co，F(xiàn)rance)發(fā)酵的荔枝酒中揮發(fā)性組分對總體氣味有直接影響的物質包括丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯等[20]。除了關鍵風味化合物還有其他的起修飾作用的揮發(fā)性物質，主要包括乙酸丁酯(水果香)、丙酸乙酯(菠蘿香)和丙醛，這些揮發(fā)性風味物質共同賦予了荔枝酒果香、甜香。

表2 荔枝酒發(fā)酵過程中揮發(fā)性風味物質的相對風味活度值Table 2 ROA of olatile flaor compounds in the fermentation process of litchi wine

2.4 感官評價

采用模糊評判法對發(fā)酵終了的荔枝果酒樣品進行感官評定，結果如圖5所示。色澤、香氣、口味和風格的評分分別為81.25、77.5、71.25、77.5，由權重算出感官綜合評價分數(shù)為76。各指標均位于較好水平，樣品色澤略帶微黃，澄清，無懸浮物，具有果香和酒香。

圖5 荔枝果酒樣品感官評價雷達圖Fig.5 Sensory ealuation radar diagram of litchi wine samples

3 結論

貝氏酵母常被用于改善發(fā)酵果酒的風味，采用電子鼻和GC-IMS技術結合分析了經貝氏酵母發(fā)酵的荔枝酒揮發(fā)性風味成分的變化，結果表明，電子鼻可以根據(jù)對應傳感器的響應值大小對荔枝酒發(fā)酵程度進行判定，較好地區(qū)分不同發(fā)酵階段的荔枝酒，其差異主要集中在W5S(氮氧化合物)和W2S(醇類、醛酮類)2個傳感器的響應值。GC-IMS同樣測定出發(fā)酵過程醇類和醛酮類物質發(fā)生了顯著變化，此外，GC-IMS分析結果表明酯類物質在發(fā)酵過程中變化明顯，以乙酸酯類為主，并且貝氏酵母是一種很好的乙酸酯類生產者。ROA顯示發(fā)酵過程的差異主要來源于關鍵性風味化合物貢獻度的不同，發(fā)酵后期的關鍵風味化合物主要有丁酸乙酯、二氫草莓酸乙酯、異丁醛、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯，其在總體風味上起關鍵性作用。對貝氏酵母發(fā)酵終點的荔枝果酒進行感官評價，綜合感官評分為76，樣品具有果香和酒香。本研究分析了貝氏酵母發(fā)酵荔枝果酒揮發(fā)性風味物質的變化，為貝氏酵母應用于荔枝果酒的發(fā)酵提供一定的理論與實踐依據(jù)。此外，在揮發(fā)性成分的測定方法上還可利用氣相色譜-質譜聯(lián)用和氣相色譜嗅覺測量技術測定分析，進一步分析貝氏酵母對荔枝酒揮發(fā)性風味物質的影響，便于更全面的探究貝氏酵母的發(fā)酵特征。