吳一凡，張瑋，劉昊林，謝錦忠，陳勝

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州，311400)

大球蓋菇(Strophariarugoso-annulata)又名赤松茸、皺環(huán)球蓋菇，是國(guó)際菇類交易市場(chǎng)十大菇種之一，同時(shí)也是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(Food and Agriculture Organization,FAO)和世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)向發(fā)展中國(guó)家推薦栽培的食用菌之一[1-2]。大球蓋菇含有豐富的多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸和礦質(zhì)元素，且抗逆性強(qiáng)，生物學(xué)轉(zhuǎn)換效率高，是較適宜竹林下套種的品種[3]。我國(guó)竹資源豐富，竹林生境良好，是套種大球蓋菇的優(yōu)良場(chǎng)所。利用竹林砍伐廢棄物粉碎的竹屑或者竹材初加工廢棄物能夠栽培大球蓋菇等食用菌，是解決近年來(lái)純竹林經(jīng)營(yíng)效益下滑，竹林棄管問題的有效途徑[4]。

目前大球蓋菇的栽培方式主要以發(fā)酵料栽培為主[5]，將適宜食用菌栽培的碳源和氮源按合理的配比堆制發(fā)酵栽培食用菌，具有污染小、成本低、工藝簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì)效益高的優(yōu)點(diǎn)[6]。已有研究表明，氮添加是影響培養(yǎng)料發(fā)酵和食用菌生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵，培養(yǎng)料的含氮量直接影響了食用菌的產(chǎn)量與品質(zhì)[7]。竹屑富含纖維素和木質(zhì)素，是栽培食用菌的優(yōu)良碳源，麥麩富含蛋白質(zhì)，是優(yōu)良的有機(jī)氮源，培養(yǎng)料添加麥麩能提高大球蓋菇菌絲的長(zhǎng)勢(shì)與生長(zhǎng)速度[8]。目前針對(duì)氮添加對(duì)木屑發(fā)酵栽培金針菇、雞腿菇、豬肚菇等食用菌產(chǎn)量與營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響已有充分報(bào)道[9-10]，但氮添加對(duì)竹屑發(fā)酵及其栽培食用菌的品質(zhì)影響的研究還十分缺乏。為此，本研究以竹屑作為主要栽培基質(zhì)，以麥麩作為氮素補(bǔ)充，測(cè)定不同氮添加量下竹屑發(fā)酵前后的理化性質(zhì)，及其栽培大球蓋菇的菌絲生長(zhǎng)、生物學(xué)效率、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和重金屬殘留情況，探究氮添加對(duì)竹屑發(fā)酵及其栽培大球蓋菇的影響，確定竹屑發(fā)酵及其栽培大球蓋菇適宜的氮添加量。為大球蓋菇的栽培推廣提供理論依據(jù)，也為竹林經(jīng)營(yíng)與竹材廢棄物的資源化利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)樣地

供試大球蓋菇母種購(gòu)于福建省永安市西南真菌研究所，栽培種由中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所自主擴(kuò)繁。竹屑購(gòu)自杭州市富陽(yáng)區(qū)，為毛竹(Phyllostachysheterocycla)粗加工下腳料，含氮量為2.6 g/kg，麥麩購(gòu)于河南省永城市，含氮量為25.3 g/kg。

試驗(yàn)樣地位于浙江省杭州市富陽(yáng)區(qū)中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所(30°06′N，119°96′E)，屬亞熱帶季風(fēng)性氣候，極端低溫-9 ℃，試驗(yàn)地海拔120 m，坡向朝西，坡度約15°，郁閉度0.7，土壤為黃壤。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)4種氮量添加竹屑栽培基料，按質(zhì)量配比分別為：100%純竹屑，96%竹屑+4%麥麩(T1)，92%竹屑+8%麥麩(T2)，84%竹屑+16%麥麩(T3)。各栽培料添加0.5%石灰后拌勻補(bǔ)水至含水量70%，置于內(nèi)徑67.5 cm×48 cm×41 cm的泡沫箱內(nèi)進(jìn)行高溫發(fā)酵40 d，每10 d進(jìn)行1次翻堆?；|(zhì)發(fā)酵結(jié)束后，打開泡沫箱蓋透氣3 d。發(fā)酵前后取堆體中間層鮮樣，測(cè)定容重和孔隙度，并在26 ℃恒溫組培室內(nèi)測(cè)定不同基質(zhì)栽培大球蓋菇的菌絲生長(zhǎng)速度和菌絲長(zhǎng)勢(shì)。部分樣品風(fēng)干、磨細(xì)、過40目篩后用于pH、電導(dǎo)率(electrical conductiity,EC)、全氮和有機(jī)碳的測(cè)定。

2020年8月25日，選取立地條件和經(jīng)營(yíng)水平基本一致的試驗(yàn)樣地進(jìn)行林下種植穴套種，每個(gè)種植穴直徑30 cm，穴間距20 cm，每個(gè)種植穴內(nèi)播4 kg發(fā)酵料和200 g大球蓋菇栽培種，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。2020年11月～2021年3月以種植穴為單元進(jìn)行采收，統(tǒng)計(jì)各單元的鮮菇產(chǎn)量與出菇時(shí)間。清理菇表面的泥土與雜物后將鮮菇的菇蓋與菇柄分開，分別粉碎、勻漿用于蛋白質(zhì)、可溶性糖、多糖、總酚和金屬離子的測(cè)定，并取部分鮮樣對(duì)半切開于105 ℃的烘箱中烘至恒重測(cè)定其含水率。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 竹屑發(fā)酵后理化性質(zhì)的測(cè)定

竹屑的容重、孔隙度采用環(huán)刀法測(cè)定。將(樣品)∶(蒸餾水)=1∶5混合，再經(jīng)振蕩后用電導(dǎo)率儀測(cè)定EC值，測(cè)定pH值。全氮采用半微量凱氏法測(cè)定，有機(jī)碳采用重鉻酸鉀容量法測(cè)定。

1.3.2 菌絲生長(zhǎng)速度與生物學(xué)效率的測(cè)定

取各處理的等量發(fā)酵竹屑分別置于內(nèi)徑12 cm，高10 cm的培養(yǎng)瓶中，每瓶接種2 g大球蓋菇原種后置于26 ℃恒溫組培室培養(yǎng)。待菌絲萌動(dòng)后，每天觀察記載菌絲生長(zhǎng)速度及長(zhǎng)勢(shì)，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

出菇期間，當(dāng)菌蓋未展開呈鐘型時(shí)，對(duì)每個(gè)種植穴的大球蓋菇進(jìn)行采收稱質(zhì)量，生物學(xué)效率按公式(1)計(jì)算：

(1)

1.3.3 大球蓋菇營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的測(cè)定

大球蓋菇的粗蛋白測(cè)定參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》第一法；可溶性糖測(cè)定參照NY/T 1278—2007《蔬菜及其制品中可溶性糖的測(cè)定 銅還原碘量法》；多糖測(cè)定參照《中國(guó)藥典》；總酚測(cè)定參照T/AHFIA 005—2018《植物提取物及其制品中總多酚含量的測(cè)定 分光光度法》；硒、鎘、鉛、汞和砷測(cè)定參照GB 5009.268—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中多元素的測(cè)定》中的電感耦合等離子體質(zhì)譜法；鋅和鈣測(cè)定參照GB 5009.268—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中多元素的測(cè)定》中的電感耦合等離子體發(fā)射光譜法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)在Excel 2020和Origin 2019中進(jìn)行整理和圖表制作，在SPSS 21.0中對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，主成分評(píng)價(jià)時(shí)將有害元素(汞、鎘、鉛、砷)指標(biāo)取倒數(shù)進(jìn)行正向化處理。試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯著性水平為P<0.05，不同小寫字母表示差異性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮添加對(duì)竹屑堆肥理化性質(zhì)的影響

如表1所示，T1、T2、T3處理發(fā)酵后竹屑培養(yǎng)料的容重、EC值顯著增大，孔隙度、pH顯著減小，對(duì)照組在發(fā)酵前后無(wú)顯著差異。隨著氮添加量的增加，發(fā)酵后竹屑培養(yǎng)料的EC顯著增加。T1、T2和T3處理的容重顯著高于CK，它們之間無(wú)顯著差異。T1和T2處理的孔隙度顯著低于CK和T3處理。可見，適宜的氮添加會(huì)促進(jìn)竹屑發(fā)酵腐熟，改善竹屑的理化性質(zhì)，適宜大球蓋菇栽培。

表1 各處理基質(zhì)發(fā)酵前后理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of substrates before and after fermentation

2.2 氮添加對(duì)竹屑栽培大球蓋菇生長(zhǎng)的影響

如表2所示，隨著氮添加的增加，竹屑栽培大球蓋菇的菌絲生長(zhǎng)速度呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，生長(zhǎng)速度最高的T1處理與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異，均顯著高于其他處理。菌絲長(zhǎng)勢(shì)以T2處理為最佳，菌絲潔白粗壯且濃密。T1和T2處理之間的生物學(xué)效率無(wú)顯著差異，但均顯著高于其他處理，達(dá)到了84.25%和86.66%?？梢?，純竹屑栽培大球蓋菇菌絲生長(zhǎng)速度快，但菌絲纖細(xì)且生物學(xué)效率低，一定的氮添加可以提高竹屑栽培大球蓋菇的生長(zhǎng)勢(shì)，但過多的氮添加也會(huì)產(chǎn)生抑制作用。

表2 氮添加對(duì)大球蓋菇的生長(zhǎng)指標(biāo)的影響Table 2 Growth indexes of S. rugoso-annulata cultiated with nitrogen additions

2.3 氮添加對(duì)竹屑栽培大球蓋菇營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響

如表3所示，各處理菇柄的含水率均顯著高于菇蓋，蛋白質(zhì)、多糖、鋅、硒在菇蓋中含量顯著高于菇柄，總酚在菇蓋與菇柄之間無(wú)顯著差異。CK組菇蓋的可溶性糖顯著高于菇柄，T2處理菇蓋的鈣顯著高于菇柄，其他處理均呈現(xiàn)菇蓋高于菇柄的趨勢(shì)，但未達(dá)到顯著水平。隨著氮添加量的增加，大球蓋菇中蛋白質(zhì)含量也隨之增加，T3處理菇柄和菇蓋的蛋白質(zhì)含量最高，達(dá)到了1.89%和4.11%，顯著高于其他處理。含水率和總酚在各處理之間無(wú)顯著差異，可溶性糖和多糖隨著氮添加量的增加分別有減少和增加的趨勢(shì)，但均未達(dá)到顯著水平。含量硒隨著氮添加量的增加呈“”型趨勢(shì)。各處理中，T2處理菇蓋的鈣顯著高于其他處理，但菇柄的鈣在各處理間無(wú)顯著差異。可見，氮添加對(duì)竹屑栽培大球蓋菇的不同營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)有不同的影響。

表3 氮添加對(duì)栽培大球蓋菇的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響Table 3 Nutritional compositions of S. rugoso-annulata cultiated with nitrogen additions

2.4 氮添加對(duì)竹屑栽培大球蓋菇重金屬含量的影響

由圖1可知，大球蓋菇各處理菇蓋的鎘含量均顯著高于菇柄，CK和T3處理菇蓋的汞含量顯著高于菇柄，CK和T2處理菇蓋的鉛含量顯著高于菇柄，CK組菇蓋的砷含量顯著高于菇柄。隨著氮添加量的增加，各處理間汞和鎘的含量呈“”型趨勢(shì)，T1和T2處理顯著低于其他處理；各處理間鉛含量無(wú)顯著差異；砷含量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，CK組菇蓋顯著高于其他處理，但T1、T2、T3處理間無(wú)顯著差異。

a-汞；b-鎘；c-鉛；d-砷圖1 大球蓋菇重金屬的含量特征Fig.1 Content characteristics of heay metals in S. rugoso-annulata 注：不同小寫字母代表差異顯著(下同)

食用菌鮮品中的汞、鎘、鉛和砷的含量上限分別為0.1、0.5、1.0、0.5 mg/kg，對(duì)照組和T3處理的汞含量分別為0.133和0.104 mg/kg，超出國(guó)家食品安全限量。T2處理菇蓋的鎘含量最低，為0.49 mg/kg，接近安全限量臨界值，其他各處理菇蓋的鎘含量均超出國(guó)家食品安全限量，說明樣地大球蓋菇存在汞和鎘超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)。鉛和砷的殘留均在國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。T2處理菌蓋和菌柄的各項(xiàng)重金屬殘留均為最低，食用菌的安全品質(zhì)較好。

2.5 氮添加對(duì)竹屑栽培大球蓋菇的主成分評(píng)價(jià)

將4個(gè)處理菇柄和菇蓋的7個(gè)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)和4個(gè)重金屬殘留指標(biāo)經(jīng)過主成分分析(principal component analysis，PCA)提取，第1、2、3個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)到了88.45%，可基本反映4個(gè)處理菇柄和菇蓋成分指標(biāo)的大部分信息。第一主成分與汞的倒數(shù)高度正相關(guān)，第二主成分與鈣和可溶性糖高度正相關(guān)，第三主成分與多糖和總酚高度正相關(guān)?？梢?，鈣、汞的倒數(shù)、多糖、可溶性糖和總酚是評(píng)價(jià)大球蓋菇綜合品質(zhì)的重要指標(biāo)?？傻么笄蛏w菇綜合品質(zhì)得分計(jì)算公式如下：

F1=-0.048×ω(蛋白質(zhì))+0.183×ω(鈣)+0.376×ω(硒)+0.035×ω(鋅)+0.07/ω(砷)+0.212/ω(鎘)+0.157/ω(鉛)+0.435/ω(汞)+0.069/ω(多糖)+0.118×ω(總酚)+0.153×ω(可溶性糖)

F2=0.036×ω(蛋白質(zhì))+0.527×ω(鈣)-0.148×ω(硒)+0.117×ω(鋅)-0.18/ω(砷)-0.053/ω(鎘)-0.131/ω(鉛)+0.243/ω(汞)-0.045×ω(多糖)-0.246×ω(總酚)+0.34×ω(可溶性糖)

F3=0.174×ω(蛋白質(zhì))-0.239×ω(鈣)-0.082×ω(硒)+0.163×ω(鋅)+0.055/ω(砷)+0.072/ω(鎘)+0.097/ω(鉛)+0.061/ω(汞)+0.385×ω(多糖)+0.623×ω(總酚)-0.014×ω(可溶性糖)

FZ=32.501%×F1+29.966%×F2+23.078%×F3

大球蓋菇綜合品質(zhì)得分結(jié)果表明(表4)，各處理菇蓋與菇柄之間綜合品質(zhì)無(wú)顯著差異。隨著氮添加量的增加，各處理的綜合品質(zhì)呈現(xiàn)倒“”型趨勢(shì)，對(duì)照組的綜合品質(zhì)評(píng)分最低，T2處理的大球蓋菇綜合品質(zhì)表現(xiàn)最好。

表4 大球蓋菇綜合因子得分Table 4 S. rugoso-annulata comprehensie factor score

2.6 培養(yǎng)料理化性質(zhì)與大球蓋菇品質(zhì)的相關(guān)性分析

由圖2可知，氮添加與EC、多糖、鋅、蛋白質(zhì)呈顯著正相關(guān)，與菌絲生長(zhǎng)速度、可溶性糖呈顯著負(fù)相關(guān)。生物學(xué)效率與汞、鎘、硒、砷呈顯著負(fù)相關(guān)，與鈣呈顯著正相關(guān)。菌絲生長(zhǎng)速度和EC、容重呈顯著負(fù)相關(guān)。鎘、汞、鉛、硒、砷5種礦質(zhì)元素之間均呈顯著正相關(guān)。多糖和可溶性糖呈顯著負(fù)相關(guān)。

圖2 生物學(xué)效率與各營(yíng)養(yǎng)成分的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis between biological conersion rate and nutrients

3 結(jié)論與討論

對(duì)竹屑進(jìn)行適量的氮添加可以改善竹屑的理化性質(zhì)，提升大球蓋菇的生物學(xué)效率與營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。培養(yǎng)料發(fā)酵后的理化性質(zhì)直接決定著食用菌的生長(zhǎng)發(fā)育。本研究中，竹屑經(jīng)堆制發(fā)酵后，培養(yǎng)料的EC和容重增加，孔隙度、pH和C/N減小,這是因?yàn)橹裥冀?jīng)堆制發(fā)酵，有機(jī)物礦化，形成了可溶性鹽和有機(jī)酸[11]。

氮添加與大球蓋菇的生長(zhǎng)與品質(zhì)密切相關(guān)，T1和T2處理的配方均優(yōu)于前人的結(jié)果[12]。純竹屑缺少大球蓋菇生長(zhǎng)所需的氮，導(dǎo)致其生物學(xué)效率較低，生物學(xué)效率與氮添加呈倒“”型趨勢(shì)。隨著氮添加量的增加，培養(yǎng)料的容重和EC增加，大球蓋菇的生長(zhǎng)速度降低，菌絲生長(zhǎng)速度和培養(yǎng)料的EC、容重顯著負(fù)相關(guān)，這說明培養(yǎng)料的容重和鹽分過高會(huì)抑制大球蓋菇生長(zhǎng)。培養(yǎng)料的C/N是影響食用菌生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素，T2和T3處理的終止碳氮比相近，但最高氮添加量的T3處理的竹屑發(fā)酵前后C/N降低幅度小，菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲長(zhǎng)勢(shì)和生物學(xué)效率低，可能是因?yàn)榈砑舆^多產(chǎn)生過量的氨氣，會(huì)對(duì)微生物活動(dòng)不利，導(dǎo)致竹屑未完全腐熟[13]，從而影響大球蓋菇的生長(zhǎng)。

大球蓋菇子實(shí)體營(yíng)養(yǎng)豐富，各處理菇蓋的蛋白質(zhì)、多糖和礦質(zhì)元素均顯著高于菇柄，這可能是因?yàn)楣缴w負(fù)責(zé)食用菌孢子的生殖發(fā)育，其營(yíng)養(yǎng)富集能力較菇柄更強(qiáng)。總酚在各處理之間，菇蓋和菇柄之間均無(wú)顯著差異，這可能是因?yàn)榉宇愇镔|(zhì)不參與食用菌的生殖發(fā)育，且酚類物質(zhì)主要由碳?xì)溲鯓?gòu)成，氮添加并不影響其合成。氮素是蛋白質(zhì)重要的組成部分，大球蓋菇的蛋白質(zhì)隨著氮添加量的增加而顯著增加。但可溶性糖和多糖分別呈現(xiàn)下降和上升的趨勢(shì)，可溶性糖和多糖呈顯著負(fù)相關(guān)，這可能是因?yàn)槭秤镁?xì)胞壁內(nèi)廣泛存在的幾丁質(zhì)屬于含氮多糖[14]，氮添加會(huì)促使大球蓋菇中可溶性的氨基葡萄糖向其轉(zhuǎn)化。

硒是人體必須的微量元素之一，有較強(qiáng)的抗氧化活性[15]，竹子相對(duì)于其他樹木具有更強(qiáng)的硒富集能力，食用菌對(duì)硒也具有較強(qiáng)的生物富集與轉(zhuǎn)化能力[16]，本研究大球蓋菇中的硒含量均在安全限值內(nèi)達(dá)到了富硒食品(0.02 mg/kg)的標(biāo)準(zhǔn)，說明竹屑栽培大球蓋菇可以作為良好的富硒農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)途徑進(jìn)行推廣。鈣是信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵元素、酶的活化劑，在食用菌孢子的形成中起重要作用[17]。T2處理菇蓋的鈣含量顯著高于菇柄，菇蓋鈣含量在各處理中最高，菇柄鈣含量最低，富集系數(shù)達(dá)到了221%，生物學(xué)效率和鈣呈顯著正相關(guān)。這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)料添加石灰后鈣元素較富足，菌絲生長(zhǎng)勢(shì)最優(yōu)、生物學(xué)效率最高的T2處理具有更強(qiáng)的富集能力。

大球蓋菇雖然營(yíng)養(yǎng)成分豐富，但其含有的金屬硫蛋白對(duì)重金屬也有較強(qiáng)的富集特性[18]，其子實(shí)體中重金屬等危害物質(zhì)超標(biāo)風(fēng)險(xiǎn)也是食品質(zhì)量安全的關(guān)鍵問題[19]。本研究中，樣地大球蓋菇存在汞和鎘超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)，而其生物學(xué)效率和重金屬殘留顯著負(fù)相關(guān)，說明竹屑栽培大球蓋菇的蛋白質(zhì)和重金屬主要來(lái)自于竹屑培養(yǎng)料，這可能是因?yàn)槭秤镁母患饔?。?yīng)避免采用重金屬殘留較高的培養(yǎng)料，或采用蚯蚓堆肥和添加石膏等措施來(lái)防控食用菌重金屬污染[20-21]。T2處理的大球蓋菇各項(xiàng)重金屬殘留均未超標(biāo)，符合國(guó)家食品安全限量標(biāo)準(zhǔn)。通過PCA對(duì)多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合性評(píng)價(jià)[22]，得出T2處理的綜合品質(zhì)最佳。

綜上，竹屑栽培大球蓋菇時(shí)，進(jìn)行一定的氮添加，采用T2處理配方(92%竹屑+8%麥麩)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)料初始碳氮比為100，堆制發(fā)酵后進(jìn)行栽培，雖然生長(zhǎng)速度有所延緩，但可以顯著提高其生物學(xué)效率和綜合品質(zhì)，避免重金屬殘留超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)。