林源，秦偉帥，王佳琳，張娜，石林，王岱杰，孟武*

1(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室，山東 濟南，250353) 2(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生物工程學(xué)院，山東 濟南，250353)3(泰山學(xué)院 生物與釀酒工程學(xué)院， 山東 泰安，271000)4(山東省分析測試中心，山東 濟南，250000)

玉米秸稈作為一種天然生物質(zhì)，其價格低廉、儲量巨大且對環(huán)境友好，可替代木材、炭等原料制備附加值更高的新型功能材料[1]。玉米秸稈富含半纖維素、纖維素和木質(zhì)素等木質(zhì)纖維素[2-3]。木質(zhì)纖維素作為一種極具發(fā)展?jié)摿Φ沫h(huán)境友好型資源，在制備生物質(zhì)材料、能源與化學(xué)品領(lǐng)域等方面引起了廣泛的關(guān)注，研發(fā)出高效益和高效率的生物質(zhì)水解方法可提高可再生木質(zhì)纖維素生物質(zhì)資源的利用和回收[4-5]。木質(zhì)纖維素的預(yù)處理方法中，稀酸水解具有腐蝕性小，pH回調(diào)試劑需求量少，低成本、高工業(yè)價值和環(huán)境友好等優(yōu)點，近年來一直是研究的熱點[6-7]。木質(zhì)纖維素被稀酸水解后，碳碳鍵裂開，被水解為木糖、葡萄糖、阿拉伯糖等糖類，可作為廉價原料生產(chǎn)生物質(zhì)材料。提高木質(zhì)纖維素的利用率，對生物質(zhì)能源的研究具有重要意義[8]。

玉米秸稈包含了纖維素、半纖維素及木質(zhì)素等纖維成分，是純天然的優(yōu)質(zhì)造紙原料，玉米秸皮的纖維素含量最高，有利于提高紙漿率和紙的強度，半纖維素含量適中，有利于紙漿的吸水，易于打漿，并且經(jīng)稀酸水解后的殘渣中木質(zhì)素含量較低，有利于蒸煮漂白，從而有利于紙張質(zhì)量的提高[9]。

乙偶姻即3-羥基-2-丁酮，存在于香蕉、芒果、橘子、可可等水果中，具有特殊的奶油香味，是一種應(yīng)用廣泛的食品添加劑，也是一種重要的化學(xué)工業(yè)的合成原料和醫(yī)藥中間體，具有較高的應(yīng)用價值[10]。目前，乙偶姻有酶法轉(zhuǎn)換法、化學(xué)合成法和生物發(fā)酵法3種主要的生產(chǎn)方法[11]。其中，生物發(fā)酵法因原料獲得途徑較多，產(chǎn)品綠色天然、條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)勢，應(yīng)用較為廣泛。而生產(chǎn)原料作為乙偶姻產(chǎn)量非常重要的一個因素，近年來對其研究甚多，木質(zhì)纖維素降解物則是一種工業(yè)生產(chǎn)乙偶姻的理想底物，具有很大的發(fā)展前景[12]。

本研究通過響應(yīng)面設(shè)計研究了稀硫酸水解時間、水解溫度和硫酸濃度對玉米秸稈水解液中木糖、葡萄糖和阿拉伯糖含量的影響。在最佳水解條件下預(yù)處理玉米秸稈，并將脫毒脫色后的水解液與培養(yǎng)基結(jié)合，利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻，并將水解后的秸稈殘渣預(yù)處理后用于造紙，實現(xiàn)玉米秸稈的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

1.1.1 菌株

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)BS2，由齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

根據(jù)秸稈水解液中碳源濃度(糖含量)，以LB培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分為標準(氮源為主)，配制發(fā)酵培養(yǎng)基。

LB固體培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10，瓊脂粉20，pH 7.2。

LB液體種子培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10，pH 7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10，(NH4)2SO48。

1.2 實驗試劑與儀器設(shè)備

硫酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氨水、(NH4)2SO4、NaCl，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖、木糖、阿拉伯糖，上海源葉生物科技有限公司。

LC-20AD高壓液相色譜儀、GC-2030氣相色譜儀，日本島津公司；MQD-B3R恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海旻泉儀器有限公司；BBS-SSC超凈工作臺，濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；U-6100紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；DK-8D電熱恒溫水浴槽，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；E200M電子顯微鏡，京尼康江南光學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料處理和水解方法

將玉米干秸稈用粉碎機磨碎成秸稈粉末，精確稱取102 g的玉米秸稈粉末(平均含水率11.8%)于高溫耐壓反應(yīng)釜中，按照固液比1∶10(g∶mL)的比例加入不同體積分數(shù)的稀硫酸[13-14]，在不同溫度下進行攪拌蒸煮(具體方案見表1)，冷水冷卻后經(jīng)真空過濾分離水解液和固體殘渣(含纖維素、半纖維素)[15-17]。

表1 玉米秸稈的稀硫酸水解方案Table 1 Dilute sulfuric acid hydrolysis scheme of corn stoer

1.3.2 水解液處理

對稀酸水解玉米秸稈所得水解液進行脫毒脫色處理。將水解液煮沸15 min，添加氨水中和至pH=10，過濾，再滴加硫酸將pH回調(diào)至適當值，二次過濾，于25 ℃下真空蒸發(fā)濃縮至適當濃度，添加3%(質(zhì)量分數(shù))的活性炭脫色，80 ℃水浴30 min，再經(jīng)抽濾后得到脫毒水解液，該方法可將水解液中的乙酸與糠醛全部除去。

1.3.3 發(fā)酵條件

菌株活化及種子液培養(yǎng)：用接種環(huán)取1環(huán)菌種接種到LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，挑取單菌落于50 mL LB液體種子培養(yǎng)基，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，按2%(體積分數(shù)，下同)接種量接到有50 mL LB液體種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)7 h，作為種子液。

搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵：將種子液按6%的接種量接種到裝有200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)8 d，發(fā)酵過程檢測各時間段的菌體生長特性和發(fā)酵表征。

發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵：按6%的接種量將種子液接種到5 L自動發(fā)酵罐，裝液量2 L，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)8 d，發(fā)酵過程檢測各時間段的菌體生長特性和發(fā)酵表征。

1.3.4 玉米秸稈水解殘渣造紙方法

稱取廢紙箱紙片2 g，高溫蒸煮后的玉米秸稈8 g。裝入纖維解離器的缸內(nèi)，加水至刻度線，于纖維解離器中纖維解離后，打開凱塞抄片器，安裝造紙網(wǎng)，原料缸在紙頁成型器水刻度至3時倒入，待水排出后，用滾筒壓剛成型，紙張兩側(cè)用布包好后于凱塞抄片器上的真空干燥器中干燥10 min，獲得紙張成品。

1.3.5 分析方法

玉米秸稈水解前后表皮及內(nèi)部結(jié)構(gòu)采用電子顯微鏡拍照對比；采用高壓液相色譜儀測定木糖、葡萄糖、阿拉伯糖的含量[18]，分離柱Shodex Packed Column for HPLC(SHODO.CO.LTD)，柱溫80 ℃，以水為流動相，流速1 mL/min；利用頂空-氣相色譜法(headspace-GC，HS-GC)測定乙偶姻濃度，使用火焰離子化檢測器，進樣口檢測器溫度240 ℃；采用紫外分光光度計測定細胞生長的OD600值，監(jiān)測細胞生長量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

以上實驗均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標準偏差表示，數(shù)據(jù)處理采用SPSS軟件處理，制圖采用Origin軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米秸稈酸水解的不同條件比較

2.1.1 水解條件對玉米秸稈表皮結(jié)構(gòu)的影響

在不同條件下水解玉米秸稈，秸稈殘渣的微觀結(jié)構(gòu)如圖1所示，圖1-a、圖1-e、圖1-c、圖1-f顯示出較高水解溫度對玉米秸稈纖維的破壞較為明顯，證明高溫可促進水解，但溫度>120 ℃時會破壞某些還原糖結(jié)構(gòu)；圖1-b～圖1-d、圖1-f顯示出相同條件下，水解1 h后玉米秸桿的纖維結(jié)構(gòu)變化不大，說明長時間水解不會對玉米秸稈纖維結(jié)構(gòu)有太大影響；圖1-d、圖1-e反映出較高酸濃度的水解液也可促進水解。研究表明，較高溫度和較高水解液酸濃度條件下，可能對半纖維素水解效果更好，纖維素水解更均勻，但溫度和酸濃度過高反而會降解木糖、葡萄糖等還原糖[13]。

a-110 ℃,1.0%,1 h;b-110 ℃,0.8%,2 h;c-110 ℃,0.8%,3 h; d-120 ℃,0.8%,1 h;e-120 ℃,1.0%,1 h;f-120 ℃,0.8%,3 h圖1 水解處理后玉米秸稈表皮結(jié)構(gòu)的電子顯微圖Fig.1 Electron micrograph of epidermal structure of corn stoer after hydrolysis treatment

2.1.2 水解條件對水解液中還原糖含量的影響

玉米秸稈水解液通過液相色譜法測定的葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的含量見表2。采用110 ℃水解時，各還原糖含量并不高，且水解后的秸稈干重較低高，說明較低溫度不能更有效地水解玉米秸稈的木質(zhì)纖維素。溫度到達120 ℃時，相同條件下比110 ℃得到的還原糖更多，當用1.0%(體積分數(shù)，下同)硫酸水解處理1 h，可獲得29.369 g/L木糖、14.316 g/L葡萄糖和48.631 g/L阿拉伯糖，且增加水解時間不能得到更多還原糖。

表2 水解液中各類還原糖含量Table 2 The content of arious reducing sugars in the hydrolyzate

對比本實驗設(shè)計的6個水解方案所獲得還原糖含量(圖2)，120 ℃、1.0%硫酸水解1 h時木糖、葡萄糖和阿拉伯糖產(chǎn)量均最多，總還原糖量同樣最多，并且水解秸稈干重也較高，說明秸稈中纖維素和半纖維素保留較好，水解殘渣經(jīng)脫毒脫色處理后，可以用作造紙原料，因此為最佳水解方案[19]。

圖2 玉米秸稈水解液中還原糖含量對比Fig.2 Comparison of reducing sugar content in corn stoer hydrolyzate

2.2 枯草芽孢桿菌利用水解液發(fā)酵產(chǎn)乙偶姻

將玉米秸稈水解液與培養(yǎng)基結(jié)合后作為發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，采用HS-GC測定發(fā)酵液中乙偶姻產(chǎn)量，如圖3和圖4所示。

圖3 枯草芽孢桿菌利用秸稈水解液發(fā)酵的乙偶姻產(chǎn)量、 發(fā)酵液pH、OD600和殘?zhí)菨舛菷ig.3 Acetoin yield, pH of fermentation broth, OD600 and residual sugar concentration of B. subtilis using corn stoer hydrolyzate

圖4 枯草芽孢桿菌利用秸稈水解液發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻 過程中糖類消耗情況Fig.4 Sugar consumption during fermentation of corn stoer hydrolyzate by B. subtilis to produce acetoin

初始pH值為5.5，發(fā)酵初期，枯草芽孢桿菌首先以發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖為主要原料，隨著時間延長，木糖和阿拉伯糖在葡萄糖消耗殆盡后作為主要碳源進入糖酵解過程生成丙酮酸，丙酮酸在乙酰乳酸合成酶作用下合成乙酰乳酸，乙酰乳酸繼而在乙酰乳酸脫氫酶催化下合成乙偶姻。當發(fā)酵至168 h時，乙偶姻獲得最高產(chǎn)量9.3 g/L，還原糖全部被利用，轉(zhuǎn)化率為0.44 g/g。

在5 L發(fā)酵罐實驗中，使用同樣的發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為2 L，枯草芽孢桿菌代謝乙偶姻的發(fā)酵周期縮短，如圖5，乙偶姻產(chǎn)量在120 h時到達最高，為10.4 g/L，轉(zhuǎn)化率有所提高，為48.7%，120 h后產(chǎn)物產(chǎn)量基本不變。

圖5 發(fā)酵罐中枯草芽孢桿菌利用秸稈水解液發(fā)酵的 乙偶姻產(chǎn)量、發(fā)酵液OD600和殘?zhí)菨舛惹闆rFig.5 Acetoin yield，fermentation broth OD600，and residual sugar concentration fermented with corn stoer hydrolyzate by B. subtilis in a 5 L fermenter

從枯草芽孢桿菌發(fā)酵水解液生產(chǎn)乙偶姻的各個特征趨勢來看，玉米秸稈水解液可以作為一種有效、經(jīng)濟的生物合成乙偶姻的原料，并且枯草芽孢桿菌可以高效利用秸稈水解液中的糖類物質(zhì)，是一種可以工業(yè)生產(chǎn)乙偶姻的潛力菌株。

2.3 玉米秸稈水解殘渣造紙研究

玉米秸稈稀酸水解后的水解殘渣，經(jīng)打漿、抄紙、壓榨、脫水、干燥處理后易于打漿，容易漂白。如圖6所示，紙張白度、勻度較好，紙漿得率較高，制成的紙張物理強度高，耐破度、耐折度良好，且外觀穩(wěn)定，總體性能較好，適用于紙板的制造。

圖6 秸稈殘渣為原料造的紙Fig.6 Paper made from straw residues

3 結(jié)論與展望

目前，生物合成乙偶姻雖然在合成途徑工藝方面和工業(yè)應(yīng)用等方面取得了一定成果，但想要讓生物合成法成為主要方法，很大程度上取決于底物的選用，目前生物轉(zhuǎn)化法所用的原料仍主要是葡萄糖，成本較高。葡萄糖、木糖和阿拉伯糖是木質(zhì)纖維素生物質(zhì)中含量最豐富的3種單糖，而玉米秸稈富含木質(zhì)纖維素，所以玉米秸稈水解液則是一種經(jīng)濟、高效的優(yōu)質(zhì)原料。通過優(yōu)化得到最優(yōu)水解條件為120 ℃，1.0%硫酸水解1 h，然后通過優(yōu)化菌株選育、培養(yǎng)方案及發(fā)酵工藝，提高乙偶姻的產(chǎn)率，產(chǎn)量到達9.3 g/L，轉(zhuǎn)化率為0.44 g/g，水解殘渣經(jīng)處理后還可以作為原料應(yīng)用到造紙工業(yè)中，實現(xiàn)玉米秸稈的高效利用。未來，還需進一步增強對木質(zhì)纖維素化學(xué)組成成分以及水解條件影響機制等理論體系的研究，針對性地剖析影響木質(zhì)纖維素降解的反應(yīng)機理，為繼續(xù)探尋新穎木質(zhì)纖維素預(yù)處理技術(shù)提供信息支撐。