陳國恒，李靜，鄧毛程，譚才鄧，葉茂，吳林杰，李美玲，謝擁葵

1(新疆天牛乳業(yè)有限公司，新疆 伊犁，835700)2(廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州，510300)

肽是含有2個至幾十個氨基酸殘基的特定蛋白質(zhì)片段，其中，肽鏈上含有10個及以上氨基酸的肽稱為多肽，含有2～9個氨基酸的肽稱為寡肽，含有2～4個氨基酸的肽又稱為小分子肽[1]。20世紀(jì)80年代初，GARDNER等研究人員證明了寡肽不需被分解為游離氨基酸，而可以直接被機(jī)體吸收，在被消化吸收方面具有蛋白質(zhì)無法比擬的優(yōu)點(diǎn)[2-3]。肽鏈通常因氨基酸組成及排列方式不同，會表現(xiàn)出不同的生理調(diào)節(jié)功能[4]。乳蛋白重要功能是提供氨基酸和氮，是膳食蛋白質(zhì)的重要組成部分，促進(jìn)多種重要營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，如微量元素和維生素。此外研究表明，乳源蛋白質(zhì)經(jīng)降解，可釋放出具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性、抗氧化活性、抗菌活性、免疫調(diào)節(jié)活性和阿片樣活性的肽類物質(zhì)，例如，由牛乳αs1酪蛋白中的23～34、23～27、194～199氨基酸殘基和β酪蛋白的177～183氨基酸殘基組成的4個寡肽具有抗高血壓活性，由牛乳β酪蛋白的60～64氨基酸殘基組成的β-酪啡肽5具有很強(qiáng)的阿片樣活性，可發(fā)揮鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、刺激胰島素和生長激素釋放、免疫調(diào)節(jié)等功能[5-9]。近年來，乳源蛋白肽的研究及應(yīng)用是食品領(lǐng)域的熱點(diǎn)。但是，乳源蛋白質(zhì)經(jīng)水解，一些水解產(chǎn)物末端暴露了疏水性氨基酸殘基，與味蕾上的受體蛋白接觸會產(chǎn)生苦味[10]，從而限制乳源蛋白肽在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。

酸奶可以滿足乳糖不耐癥人群對乳制品的需求，提供豐富的蛋白質(zhì)和鈣，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一些生理活性物質(zhì)可以抑制有害微生物的增殖，維持腸道菌群平衡，對慢性疾病有一定功效，但不易于保藏，酸奶粉具有保質(zhì)期長、便于儲存等優(yōu)點(diǎn)，已形成了商品化生產(chǎn)[11-12]。但是，由于寡肽苦味困擾，市場上尚未有富含寡肽的酸奶粉。本文篩選高產(chǎn)氨肽酶的乳酸菌，并利用該菌種對乳源蛋白肽進(jìn)行脫苦研究，以期為解決富含寡肽酸奶粉的苦味問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

自然發(fā)酵馬奶、脫脂牛乳，新疆天牛乳業(yè)有限公司提供。DNA提取試劑盒、16S rDNA的擴(kuò)增引物以及PCR擴(kuò)增試劑，其中細(xì)菌通用引物27F/1492R，27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3、1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，購于深圳華大基因科技服務(wù)公司。葡萄糖、酪蛋白胨、酵母粉、脫脂奶粉、NaCl、瓊脂、HCl、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、L-亮氨酸對硝基苯胺，市售。

1.2 主要儀器

SW-11厭氧培養(yǎng)箱，上海勝衛(wèi)電子科技有限公司；S-300掃描電鏡，日本日立公司；A200型PCR儀，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；酶解罐、種子罐、發(fā)酵罐，新疆天牛乳業(yè)有限公司；H1850R高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；752 N型紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；LNG-UF-101超濾膜分離裝置，上海朗極膜分離設(shè)備工程有限公司。

1.3 平板分離

平板分離培養(yǎng)基(g/L)：乳糖10，酪蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 5，瓊脂18，調(diào)節(jié)pH 7.0，121 ℃滅菌15 min。用無菌生理鹽水對自然發(fā)酵馬奶進(jìn)行梯度稀釋，涂布于平板分離培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h，挑取周圍有透明圈的菌落。

1.4 氨肽酶產(chǎn)生菌篩選

種子培養(yǎng)基(g/L)：乳糖40，脫脂奶粉5，酪蛋白胨20，酵母粉5，調(diào)節(jié)pH 7.0，121 ℃滅菌15 min。發(fā)酵培養(yǎng)基同種子培養(yǎng)基。將上述挑取菌落的斜面菌種分別接入10 mL種子培養(yǎng)基，于37 ℃厭氧培養(yǎng)8 h，再分別接入200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，于37 ℃厭氧培養(yǎng)16 h。然后，測定發(fā)酵液中氨肽酶活力，優(yōu)選產(chǎn)酶能力最強(qiáng)的菌株。

1.5 氨肽酶產(chǎn)生菌鑒定

利用普通光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察菌體形態(tài)。按照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》(第八版)的方法[13-14]，對菌種的生理生化特性進(jìn)行分析。參照文獻(xiàn)[15]的分子生物學(xué)鑒定方法，對菌種進(jìn)行16S rDNA測序。將序列在NCBI中進(jìn)行同源性檢索，利用MEGA7.0軟件以Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

用20 kDa超濾膜濃縮脫脂牛乳至一半體積，按蛋白質(zhì)含量加入5 000 U/g風(fēng)味蛋白酶，于55 ℃下進(jìn)行酶解3 h，升溫至90 ℃滅酶。將5 L牛乳酶解液放入錐形瓶，于105 ℃滅菌10 min，冷卻后，接入氨肽酶產(chǎn)生菌的斜面菌種，于37 ℃下培養(yǎng)8 h，作為發(fā)酵種子液。將100 L牛乳酶解液放入發(fā)酵罐，于105 ℃滅菌10 min，冷卻后，接入上述種子液，分別在不同溫度下和不同初始pH的條件下進(jìn)行氨肽酶發(fā)酵，優(yōu)選最佳的發(fā)酵產(chǎn)酶條件。

1.7 發(fā)酵脫苦時間的優(yōu)化

在最佳溫度和初始pH條件下進(jìn)行發(fā)酵，從發(fā)酵9 h開始，每隔3 h取樣評價苦味強(qiáng)度，優(yōu)選最佳的脫苦時間。

1.8 氨肽酶測定方法

采用LNA法測定粗酶液的酶活力[16]。測定前，配制一系列對硝基苯胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在405 nm下測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將發(fā)酵液于8 000 r/min、4 ℃的條件下離心15 min，收集上清液，即為粗酶液。在具塞試管中，依次加入Tris-HC1緩沖溶液、L-亮氨酸對硝基苯胺和粗酶液，在40 ℃水浴反應(yīng)10 min，用30%乙酸終止反應(yīng)，在405 nm波長下測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計算酶活力。酶活力定義：在40 ℃的條件下，1 min分解L-亮氨酸對硝基苯胺產(chǎn)生1 nmol對硝基苯胺所需的酶量即為1個酶活力單位。

1.9 苦味強(qiáng)度評價方法

將不同發(fā)酵時間的發(fā)酵液與等體積純凈水混勻，用360 Da超濾膜進(jìn)行濃縮至一半體積，收集濃縮液，用于苦味強(qiáng)度評價。參照文獻(xiàn)[17]的苦味評價方法，以0.5×10-2、0.5×10-3、0.5×10-4、0.5×10-5、0.5×10-6g/L的硫酸奎寧溶液為苦味強(qiáng)度參照物，分別對應(yīng)5個苦味強(qiáng)度級別：強(qiáng)、較強(qiáng)、中、弱、無，由11名人員組成的小組進(jìn)行感官評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選

從分離平板上挑取126個周邊有透明圈的菌落，經(jīng)過氨肽酶發(fā)酵篩選，發(fā)酵16 h的氨肽酶活力分布于302～1 962 U/mL。發(fā)酵液中氨肽酶活力最強(qiáng)的10個菌株產(chǎn)酶情況如圖1所示，其中，菌種KM-022發(fā)酵液的酶活力最高，與有關(guān)文獻(xiàn)報道的德氏乳桿菌保加利亞亞種、乳酸乳球菌等乳酸菌相比[18-19]，屬于產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的氨肽酶產(chǎn)生菌，故優(yōu)選為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的研究菌種。

圖1 十株菌發(fā)酵液中的酶活力Fig.1 Enzyme actiity in fermentation broth of 10 strains

2.2 菌種鑒定

經(jīng)革蘭氏染色與顯微鏡觀察，菌種KM-022的菌體形態(tài)呈球形，是革蘭氏陽性菌。在掃描電鏡下觀察，菌體的呈現(xiàn)形式主要是2個卵圓形菌體連成的長鏈，長度約為1.0～1.4 μm(圖2)。

圖2 菌種KM-022的電子顯微鏡掃描結(jié)果Fig.2 Scanning electron microscope result of strain KM-022

菌種KM-022的生理生化試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，該菌種具有耐熱性能，能夠在15～45 ℃生長，其明膠液化試驗(yàn)為陽性，表明能夠產(chǎn)生蛋白酶。

表1 菌種KM-022生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical test results of strain KM-022

經(jīng)測序，16S rDNA序列為1 539 bp，在NCBI中Blast比較后，發(fā)現(xiàn)該菌種與嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)的許多菌種序列同源性達(dá)到99%以上，采用MEGA10的Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示。

圖3 菌種KM-022的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain KM-022

菌種KM-022與菌株StreptococcusthermophilusA7033(登錄號：MN447108.1)遺傳距離最近，結(jié)合形態(tài)觀察和生理生化試驗(yàn)，菌種KM-022被鑒定為嗜熱鏈球菌(S.thermophilus)。研究表明，嗜熱鏈球菌可產(chǎn)生包括氨肽酶T、氨肽酶N、氨肽酶C、Xaa-Pro氨肽酶、三肽氨肽酶、谷?；彪拿?、蛋氨酸氨肽酶等氨肽酶[20]，已有多個氨肽酶基因被克隆和研究，包括pepN、pepC、pepS等基因序列，通過轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究，表明嗜熱鏈球菌生長后期上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)有肽類與氨基酸運(yùn)載體及特定氨基酸合成[21-22]，這與菌種KM-022具有氨肽酶產(chǎn)生能力的性質(zhì)是一致的。

2.3 溫度對產(chǎn)酶的影響

在初始pH 7.0和不同溫度下，嗜熱鏈球菌KM-022產(chǎn)氨肽酶的結(jié)果如圖4所示。分別在37、40、43 ℃的條件下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液中酶活力最大值均出現(xiàn)在18 h，分別為2 097、2 416、2 203 U/mL，隨后呈下降趨勢。在40 ℃下發(fā)酵的酶活力最高，故嗜熱鏈球菌KM-022氨肽酶發(fā)酵最適溫度優(yōu)選為40 ℃。其最適產(chǎn)酶溫度與該菌種以及文獻(xiàn)報道的其他菌株的最適生長溫度是一致的[23-24]，表明該菌種在生長和發(fā)酵過程中均有較好的耐熱性能。

圖4 溫度對產(chǎn)酶的影響Fig.4 Influence of temperature on enzyme production

2.4 初始pH對產(chǎn)酶的影響

在不同初始pH和40 ℃下，嗜熱鏈球菌KM-022產(chǎn)氨肽酶的結(jié)果如圖5所示。分別在初始pH 6.5、7.0、7.5下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液中酶活力最大值分別出現(xiàn)在18、18、21 h，分別為2 135、2 416、2 197 U/mL，隨后呈下降趨勢。在初始pH 7.0下發(fā)酵的酶活力最高，故嗜熱鏈球菌KM-022氨肽酶發(fā)酵最適初始pH優(yōu)選為7.0。

圖5 初始pH對產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of initial pH on enzyme production

2.5 時間對短肽脫苦的影響

在初始pH 7.0和40 ℃下，嗜熱鏈球菌KM-022發(fā)酵脫苦的結(jié)果如表2所示。在產(chǎn)酶以后，產(chǎn)酶和酶解作用是同步的，隨著發(fā)酵產(chǎn)酶和氨肽酶酶解作用的進(jìn)行，發(fā)酵液的苦味強(qiáng)度逐漸減弱，發(fā)酵21 h的苦味基本消失。該條件下發(fā)酵液最高酶活力出現(xiàn)在18 h，脫苦效果僅延遲3 h，表明該菌種對牛乳酶解液的發(fā)酵脫苦效果良好。

表2 發(fā)酵濃縮液的苦味強(qiáng)度變化Table 2 Bitterness intensity of concentrated fermented liquid

3 結(jié)論

從自然發(fā)酵馬奶中分離得到126株氨肽酶產(chǎn)生菌株，經(jīng)產(chǎn)酶發(fā)酵篩選，確定菌種KM-022產(chǎn)酶能力最強(qiáng)。經(jīng)菌體形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA分子鑒定，菌種KM-022被鑒定為嗜熱鏈球菌，屬于我國可用于食品的微生物菌種。利用脫脂牛乳的酶解液為基質(zhì)進(jìn)行氨肽酶發(fā)酵，產(chǎn)酶的最佳溫度和初始pH分別為40 ℃和7.0。在最佳溫度和初始pH的條件下，嗜熱鏈球菌KM-022發(fā)酵18 h的氨肽酶酶活力達(dá)到最大值2 416 U/mL，發(fā)酵21 h苦味基本消失。該菌種對乳肽的發(fā)酵脫苦效果明顯，具有生產(chǎn)應(yīng)用潛力。