封成玲，劉洋，賈紫偉，劉丹丹，李清向，寧亞維，王志新

(河北科技大學 食品與生物學院，河北 石家莊，050018)

目前在植物病害的防治中，化學防治仍處于主要地位，但長期使用化學農藥不僅會造成環(huán)境污染、土壤結構破壞、抗藥性病害菌增多等后果，也會對人畜的健康造成危害[1]。生物防治具有成本低、見效快、環(huán)保健康、不易產生耐藥菌等優(yōu)點[2]，是目前替代化學防治或減少化學農藥用量的有效手段。研究者已經從土壤、種子等材料中開發(fā)出多種生防菌[3]，并將其應用于人參[4]、檳榔芋[5]、馬鈴薯[6]等多種植物病害的防治，同時，在食品防腐[7]等領域亦有應用。這些生防菌主要有芽孢桿菌、鏈霉菌、枯草桿菌、側單胞菌等。研究報道顯示，雖然已經有大量的生防菌被開發(fā)，但由于菌株的篩選多處于實驗室環(huán)境，導致在應用中仍存在菌株不穩(wěn)定、抑菌活性弱等不足，因此開發(fā)新型、優(yōu)良的菌株，已成為生防菌研究亟需解決的問題。溶桿菌是一類新興的生防菌，對多種微生物如真菌、卵菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌等均具有很高的拮抗作用，應用前景廣泛[8]。

產酶溶桿菌屬于溶桿菌屬，是極具生防潛力的一類菌株，主要通過分泌多種胞外酶與小分子次生代謝物起生物防治作用，包括蛋白酶、磷酸酶、幾丁質酶、纖維素酶、β-1,3-葡聚糖酶、熱穩(wěn)定性抗真菌因子(heat-stable antifungal factor, HSAF)、脂肽類化合物等。產酶溶桿菌分泌的α-蛋白酶可以降解線蟲體壁的蛋白質[9]；磷酸酶能夠有效降解病原菌胞膜中的磷脂，導致菌體細胞破滅[10-11]；幾丁質酶可以降解病原微生物細胞壁中的幾丁質而發(fā)揮作用[12]；纖維素酶能夠作用于卵菌的細胞壁，破壞卵菌的結構；β-1,3-葡聚糖酶作用于病原真菌細胞壁，抑制菌體的生長[13]。多種酶類協同作用，加強了產酶溶桿菌的拮抗作用。HSAF是一類大環(huán)內酰胺類化合物，對絲狀真菌與卵菌有很強的抑制作用。此外，HSAF熱穩(wěn)定性高，可以靶向作用于絲狀真菌鞘脂的生物合成[14-15]，且對植物與哺乳類動物不產生危害。目前報道的脂肽類化合物WAP-8294有WAP-8294A1、WAP-8294A2、WAP-8294A3幾種結構，其對革蘭氏陽性菌具有較強的拮抗作用，但熱穩(wěn)定性不高[16]。KATO等[17]對WAP-8294A2進行了臨床試驗，將其作用于由耐甲氧西林金黃色葡萄球菌引起的小鼠系統性感染，發(fā)現其藥效是萬古霉素的14倍。此外，產酶溶桿菌產生的表面活性物質[18]，也可以防治植物病害。

產酶溶桿菌分泌的多種酶類與次生代謝物相互協同作用，使產酶溶桿菌具有廣譜的抑菌性，在食品、農業(yè)與醫(yī)學等方面具有廣泛的應用價值。本課題組前期從土壤中分離并鑒定出1株產酶溶桿菌L-43，經研究發(fā)現其代謝物對革蘭氏陽性菌和部分真菌均具有很強的抑制性，對其抑菌物質進行鑒定發(fā)現其為小分子肽類化合物，且與WAP-8294不同，其熱穩(wěn)定性較好，具有研究應用價值，有望開發(fā)為生物防菌劑。前期研究發(fā)現，僅用常規(guī)的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進行菌株培養(yǎng)時，菌株并不能有效合成抗菌肽，抑菌活性低，因此，尋求抗菌肽高效合成且成本低廉的培養(yǎng)基十分必要，這也是實現規(guī)模生產的基礎。

目前，國內外對溶桿菌屬的發(fā)酵優(yōu)化研究還較少。2008年，王云霞等[19]采用單因素與正交試驗對產酶溶桿菌OH11的搖瓶發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，優(yōu)化后培養(yǎng)基中活菌數明顯高于原基礎培養(yǎng)基中的活菌數。2011年，田囡[20]對產酶溶桿菌OH11產HSAF的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，優(yōu)化后的HSAF產量比優(yōu)化前提高了25%～30%。2012年，李寧等[21]利用響應面法對溶桿菌UCo1產溶菌酶的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，將溶菌酶活力提高了11.93%。2015年，應晨等[22]在LB液體培養(yǎng)基的基礎上，采用正交試驗對產酶溶桿菌R-2-1的發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，優(yōu)化后培養(yǎng)基中的活菌數與發(fā)酵代謝物產量得到了有效提高。2018年，TANG等[23]對產酶溶桿菌OH11發(fā)酵HSAF的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，以價格低廉的大豆粉、葡萄糖、CaCl2作為營養(yǎng)成分，HSAF的合成量提高了近12倍。本研究以實驗室分離獲得的產酶溶桿菌L-43作為實驗菌株，利用價格低廉的碳源、氮源與無機鹽對產酶溶桿菌合成抗菌肽的發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，降低了發(fā)酵成本，并在此基礎上，對發(fā)酵時間等6個發(fā)酵條件進一步優(yōu)化，以期為產酶溶桿菌L-43抗菌肽的規(guī)?；l(fā)酵生產，以及抗菌肽的性質、合成途徑與應用等研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

產酶溶桿菌(Lysobacterenzymogenes)L-43由本實驗室前期從土壤中分離并保藏。抑菌性測定指示菌：金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)ATCC 25923，由河北科技大學酶工程實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NB，g/L)：蛋白胨10.0、牛肉膏3.0、NaCl 5.0；牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(NA，g/L)：蛋白胨10.0、牛肉膏3.0、NaCl 5.0、瓊脂18.0，pH 7.2～7.4，上述培養(yǎng)基均于121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1L.enzymogenesL-43生長曲線測定

將L.enzymogenesL-43接種至NB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24 h時取樣并用生理鹽水進行適當稀釋后，涂布于NA固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h進行菌落計數。

1.2.2L.enzymogenesL-43種子液制備

將L.enzymogenesL-43接種至NB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)24 h后，以2.0%(體積分數)接種量接種至NB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)10 h至二代對數生長期。將二代種子液以2.0%(體積分數)接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基進行搖瓶發(fā)酵。

1.2.3 抗菌肽效價測定

選用牛津杯瓊脂擴散法測定效價。選用金黃色葡萄球菌為指示菌，參照張鳳嬌[24]的方法進行發(fā)酵上清液效價測定。

1.2.4 培養(yǎng)基的碳源優(yōu)化

向NB培養(yǎng)基中，分別添加10.0 g/L的葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、糊精、殼聚糖、甘露醇、可溶性淀粉和液糖，以NB培養(yǎng)基為對照，篩選出最優(yōu)碳源。分別向NB培養(yǎng)基中添加5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、40.0、50.0 g/L的最優(yōu)碳源，優(yōu)化碳源添加量。

1.2.5 培養(yǎng)基的氮源優(yōu)化

以10.0 g/L麥芽糖為碳源，5.0 g/L NaCl為無機鹽，分別以10.0 g/L的牛肉膏、蛋白胨、酪蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、酵母浸粉、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)2SO4、玉米漿粉、魚蛋白胨和尿素作為氮源，以不添加氮源的培養(yǎng)基作為對照，篩選最優(yōu)氮源。分別向培養(yǎng)基中添加5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、40.0 g/L的最優(yōu)氮源，優(yōu)化其添加量。

1.2.6 培養(yǎng)基無機鹽優(yōu)化

以10.0 g/L麥芽糖作為碳源、10.0 g/L胰蛋白胨作為氮源，分別以1.0 g/L的NaCl、MgSO4、K2HPO4、CaCl2、FeCl3、Fe2(SO4)3、ZnSO4、CuSO4和MnSO4作為無機鹽，以不添加無機鹽的培養(yǎng)基作為對照，篩選出最優(yōu)無機鹽。設置最優(yōu)無機鹽添加量為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L，進一步優(yōu)化無機鹽添加量。

1.2.7 培養(yǎng)基表面活性劑優(yōu)化

以10.0 g/L麥芽糖為碳源，10.0 g/L胰蛋白胨為氮源，1.0 g/L MgSO4為無機鹽，分別添加0.5%(體積分數)的吐溫-80和吐溫-20作為表面活性劑，以不添加表面活性劑的培養(yǎng)基作為對照，篩選出最優(yōu)表面活性劑。設置最優(yōu)表面活性劑添加量(體積分數)為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%，優(yōu)化表面活性劑添加量。

1.2.8 發(fā)酵培養(yǎng)基的正交試驗

以1.2.4～1.2.7篩選出的最佳碳源(麥芽糖)、氮源(胰蛋白胨)、無機鹽(MgSO4)為因素，分別設置3個水平，采用L9(33)正交試驗，因素與水平如表1所示，進行搖瓶發(fā)酵，篩選出最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組合。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基成分正交試驗因素與水平Table 1 Factors and leels of orthogonal experiment of fermentation medium

1.2.9 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH優(yōu)化

其他條件不變，調整發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0，進行搖瓶發(fā)酵，測定其效價，篩選出最佳初始pH。

1.2.10 發(fā)酵溫度優(yōu)化

其他條件不變，分別設置發(fā)酵溫度為28、30、32、34、36 ℃，進行搖瓶發(fā)酵，測定其效價，篩選出最佳發(fā)酵溫度。

1.2.11 發(fā)酵時間優(yōu)化

其他條件不變，分別測定發(fā)酵液16、20、22、24、30、36、48、60、72 h時的效價，確定最佳發(fā)酵時間。

1.2.12 接種量優(yōu)化

其他條件不變，分別設置種子液接種量為(體積分數)：1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%和6.0%，進行搖瓶發(fā)酵，測定其效價，確定最佳接種量。

1.2.13 發(fā)酵溶氧量優(yōu)化

其他條件不變，分別設定搖床轉速為180、200、220、240、260 r/min進行搖瓶發(fā)酵，測定其效價，確定最佳搖瓶發(fā)酵轉速；分別設定250 mL三角瓶中，裝液量為30、40、50、60、70、80 mL，進行搖瓶發(fā)酵，測定其效價，確定最佳裝液量。

1.2.14 發(fā)酵條件的正交試驗

以1.2.9～1.2.13篩選出的初始pH、裝液量、接種量與發(fā)酵時間為因素，分別設置4個水平，進行L16(44)的正交試驗，水平與因素如表2所示，進行搖瓶發(fā)酵，篩選出最優(yōu)發(fā)酵條件組合。

表2 發(fā)酵條件正交試驗因素與水平Table 2 Factors and leels of orthogonal experiment of fermentation conditions

2 結果與分析

2.1 L.enzymogenes L-43生長曲線

根據L.enzymogenesL-43在24 h內的菌體生長情況，繪制其生長曲線(如圖1所示)。L.enzymogenesL-43在NB培養(yǎng)基中生長的遲緩期在0～4 h內，對數生長期在4～12 h內，穩(wěn)定期在12～24 h內。

圖1 L.enzymogenes L-43的生長曲線Fig.1 The growth cure of L.enzymogenes L-43

2.2 培養(yǎng)基碳源優(yōu)化

對于一切異源微生物，碳源又兼做能源，是菌體生長存活必不可少的營養(yǎng)物質之一，不同的碳源會對菌體的生長代謝產生不同的影響。本研究選用10種碳源，探究其對抗菌肽合成的影響，結果如圖2所示。

1-空白CK組；2-果糖；3-蔗糖；4-麥芽糖；5-葡萄糖； 6-殼聚糖；7-乳糖；8-淀粉；9-甘露醇；10-液糖；11-糊精圖2 碳源對L.enzymogenes L-43合成抗菌肽的影響Fig.2 Effect of different carbons on the antimicrobial peptides production by L.enzymogenes L-43

相比于果糖、葡萄糖，麥芽糖更有利于抗菌肽的合成，上清液效價達到了1 185.72 AU/mL，與NB培養(yǎng)基(空白CK組)相比，效價提高了近2倍。可見，以麥芽糖為碳源不僅能明顯促進抗菌肽合成，而且成本較低，可以作為工業(yè)化生產的碳源參考。

進一步對麥芽糖的添加量進行優(yōu)化(圖2)，當添加量為10.0 g/L時，最利于抗菌肽的合成。麥芽糖具有一定黏度，添加量過高可能會導致溶氧量降低從而影響菌體生長。

2.3 培養(yǎng)基氮源優(yōu)化

對于L.enzymogenesL-43來說，氮源不僅是支持菌體生長繁殖的必需營養(yǎng)物質，更是支持合成代謝物抗菌肽的原料。本研究對9種有機氮源與3種無機氮源進行了篩選，結果如圖3所示。當培養(yǎng)基中不添加氮源時，發(fā)酵效價僅為44.31 AU/mL，說明氮源是影響抗菌肽合成的重要因素。此外，氮源的種類也影響了抗菌肽的合成。與常見的牛肉膏、蛋白胨相比，胰蛋白胨作為氮源更能促進L.enzymogenesL-43抗菌肽的合成，其發(fā)酵液效價達到了2 281.30 AU/mL。

1-空白組；2-胰蛋白胨；3-牛肉膏；4-蛋白胨；5-酪蛋白胨； 6-魚蛋白胨；7-玉米浸粉；8-酵母膏；9-酵母浸粉；10-NH4Cl； 11-NH4NO3；12-(NH4)2SO4；13-尿素圖3 氮源對L.enzymogenes L-43合成抗菌肽的影響Fig.3 Effect of different nitrogen on the antimicrobial peptides production by L.enzymogenes L-43

進一步優(yōu)化胰蛋白胨的添加量(圖3)。當添加量為10.0 g/L時，抗菌肽合成量最高，效價達到了2 390.02 AU/mL，而當添加量低于10.0 g/L或高于10.0 g/L時其合成量均呈現降低趨勢，這可能與培養(yǎng)基中的碳氮比有關。氮源能夠促進菌體的生長繁殖與代謝物的合成，但當氮源比例過高時，菌體生長旺盛，pH也隨之升高，并不利于代謝物的積累。

2.4 培養(yǎng)基無機鹽優(yōu)化

L.enzymogenesL-43抗菌肽的合成需要多種酶作用，無機鹽與酶的激活等作用息息相關。本研究對9種無機鹽進行了篩選，其中包括對酶有激活作用的Cu2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+以及調節(jié)滲透壓的Na+等，結果如圖4所示。CaCl2、FeCl3、Fe2(SO4)3對抗菌肽的合成沒有明顯影響，ZnSO4、MnSO4、CuSO4、K2HPO4抑制抗菌肽的合成，NaCl與MgSO4會促進抗菌肽合成，其中MgSO4對L.enzymogenesL-43合成抗菌肽的促進作用最強，發(fā)酵效價達到了3 483.74 AU/mL，與其他無機鹽相比，較為突出。

1-空白組；2-MgSO4；3-NaCl；4-CaCl2；5-FeCl3；6-Fe2(SO4)3； 7-ZnSO4；8-K2HPO4；9-MnSO4；10-CuSO4圖4 無機鹽對L.enzymogenes L-43合成抗菌肽的影響Fig.4 Effect of different inorganic salt on the antimicrobial peptides production by L.enzymogenes L-43

進一步對MgSO4添加量進行優(yōu)化(圖4)，當添加量為1.0 g/L時能夠顯著促進抗菌肽的合成。對于菌體來說，MgSO4作為無機鹽可以提供與酶活力息息相關的Mg2+，從而促進菌體的代謝。

2.5 培養(yǎng)基表面活性劑優(yōu)化

表面活性劑對L.enzymogenesL-43抗菌肽合成量的影響結果如圖5所示。

1-空白組；2-吐溫-20；3-吐溫-80圖5 表面活性劑對L.enzymogenes L-43合成抗菌肽的影響Fig.5 Effect of different surface actie agents on the antimicrobial peptides production by L.enzymogenes L-43

培養(yǎng)基中加入2種表面活性劑對抗菌肽的合成均無促進作用，吐溫-20甚至會抑制L.enzymogenesL-43抗菌肽的合成。對吐溫-80的添加量進行優(yōu)化，結果顯示，隨著添加量的增加，L.enzymogenesL-43抗菌肽合成量逐漸降低，可見加入吐溫-80并不利于抗菌肽的合成。

2.6 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗

將碳源、氮源、無機鹽3個因素進行正交試驗，結果如表3所示，與其他組合相比，組合5的抗菌肽合成量最高，效價達到了3 770.52 AU/mL，與NB培養(yǎng)基中發(fā)酵效價(602.32 AU/mL)相比，提高了6.26倍。最終確定優(yōu)化的培養(yǎng)基組合為A2B2C3，即麥芽糖10.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，MgSO41.5 g/L。

表3 發(fā)酵培養(yǎng)基成分正交試驗結果Table 3 Orthogonal test results of fermentation culture

2.7 發(fā)酵初始pH優(yōu)化

同一種微生物在不同生長階段或生理生化過程中對pH值有不同的要求。對L.enzymogenesL-43合成抗菌肽的初始pH進行優(yōu)化，結果如圖6-a所示。圖6-a顯示，隨著初始pH的逐漸升高，抗菌肽合成量先增高后降低。當初始pH為6.5時，合成量最高，效價達到了4 335.34 AU/mL；pH高于6.5后，隨著pH的升高，效價逐漸降低；pH為10時，效價最低，這可能是由于pH太高，導致菌體死亡或不能生長，從而抑制抗菌肽合成。

2.8 發(fā)酵溫度優(yōu)化

對L.enzymogenesL-43的發(fā)酵溫度進行優(yōu)化。根據菌體生長的溫度規(guī)律，分別設置了5個溫度進行發(fā)酵，結果如圖6-b所示。L.enzymogenesL-43在28 ℃不能高效地合成抗菌肽，隨著溫度升高，抗菌肽合成量逐漸提高，至32 ℃時，抗菌肽合成量最高，效價達到了5 186.32 AU/mL；發(fā)酵溫度高于32 ℃后，抗菌肽合成量又逐漸降低，這可能與抗菌肽合成酶的催化溫度有關。

2.9 發(fā)酵時間優(yōu)化

抗菌肽作為L.enzymogenesL-43合成分泌的一種代謝物，會隨著培養(yǎng)時間的延長而積累。本研究分別設置了9個時間點，探究L.enzymogenesL-43抗菌肽在發(fā)酵培養(yǎng)基中的合成情況。結果如圖6-c所示，當菌體發(fā)酵至16 h時，抗菌肽合成量仍處于持續(xù)上升的趨勢，直至22 h效價最高，達到5 664.47 AU/mL；隨著時間的延長，效價又逐漸下降，至24 h后，效價幾乎穩(wěn)定不變。隨著發(fā)酵時間的延長，菌體量增多，導致培養(yǎng)基內營養(yǎng)成分減少，從而不利于抗菌肽的合成，綜合考慮發(fā)酵時間確定為22 h。目前，產酶溶桿菌抑菌物質的發(fā)酵周期較長，幾乎均在24 h以上[23,25-27]。本研究將L.enzymogenesL-43抗菌肽的發(fā)酵時間縮短至22 h，有效縮短了發(fā)酵周期，降低了發(fā)酵成本。

a-初始pH；b-發(fā)酵溫度；c-發(fā)酵時間圖6 發(fā)酵初始pH、發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間對L.enzymogenes L-43合成抗菌肽的影響Fig.6 Effect of different fermentation initial pH, temperature and time on the antimicrobial peptides production by L.enzymogenes L-43

2.10 接種量優(yōu)化

對菌體接種量進行優(yōu)化，結果如圖7-a所示。隨著接種量的增加，抗菌肽合成量也逐漸提高。當接種量為3.0%(體積分數，下同)時抗菌肽合成量最高，效價達到了5 961.75 AU/mL；當接種量超過3.0%時，抗菌肽合成量開始逐步降低，至接種量4.0%時其合成量趨于穩(wěn)定。

2.11 發(fā)酵溶氧量優(yōu)化

適宜的溶氧水平有助于菌體的生長與代謝。本研究從轉速與裝液量的角度對發(fā)酵溶氧水平進行調整。觀察轉速對抗菌肽合成的影響，結果如圖7-b所示，當搖床轉速在180～220 r/min時，抗菌肽合成量隨著轉速的升高而降低；當轉速上升至220～240 r/min時，抗菌肽合成量又逐漸升高；當轉速上升至240～260 r/min時，抗菌肽合成量呈現降低的趨勢。綜合比較，確定發(fā)酵的轉速為180 r/min，此時抗菌肽發(fā)酵效價最高，達到了6 876.55 AU/mL。

對發(fā)酵裝液量進行優(yōu)化，結果如圖7-c所示，當裝液量為30 mL/250 mL時，抗菌肽的發(fā)酵效價達到了最高(8 421.02 AU/mL)；隨著裝液量的增加，發(fā)酵效價逐漸降低，裝液量超過60 mL/250 mL，發(fā)酵效價顯著下降。裝液量的增加導致溶解氧降低，從而影響菌體的生長與代謝。

a-接種量；b-搖床轉速；c-裝液量圖7 接種量、搖床轉速與裝液量對L.enzymogenes L-43合成抗菌肽的影響Fig.7 Effect of different inoculum amount, shaking speed and liquid loading on the antimicrobial peptides production by L.enzymogenes L-43

2.12 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

對發(fā)酵條件的4個因素分別設置4個水平進行正交試驗。結果如表4所示，對抗菌肽效價影響的顯著程度依次是pH>裝液量>發(fā)酵時間>接種量；與其他組合相比，第11組試驗E3F3G1H2的抗菌肽合成量尤為突出，效價達到了9 422.33 AU/mL，與NB培養(yǎng)基中發(fā)酵效價(602.32 AU/mL)相比提高了15.6倍。通過正交試驗確定發(fā)酵條件為裝液量50 mL/250 mL，初始pH 7.0，接種量2.0%，發(fā)酵時間22 h。

表4 發(fā)酵條件正交試驗結果Table 4 Orthogonal test results of fermentation conditions

3 結論與討論

產酶溶桿菌具有廣譜的抑菌能力與多種生防機制[28-30]，在食品、農業(yè)與醫(yī)學等方面均具有廣闊的應用前景。目前，產酶溶桿菌的生防能力以及對作物病害的防治研究已經有了較大進展，但與其他類生防菌相比，開發(fā)利用的產酶溶桿菌仍較少[30-31]。因此，開發(fā)新型、優(yōu)良的產酶溶桿菌仍是研究的重點。利用廉價易得的原料對菌株進行發(fā)酵，優(yōu)化其培養(yǎng)環(huán)境，降低發(fā)酵成本，獲得較高的產物濃度、較高的底物轉化率和較高的生產強度，是菌株開發(fā)的重要環(huán)節(jié)。

本研究從發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵條件的角度對產酶溶桿菌L-43合成抗菌肽進行優(yōu)化，分別對10種碳源、12種氮源、9種無機鹽以及2種表面活性劑進行篩選，得到了以麥芽糖為碳源、胰蛋白胨為氮源、MgSO4為無機鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基，優(yōu)化后抗菌肽效價達到了3 770.52 AU/mL，與最初發(fā)酵效價相比(602.32 AU/mL)提高了6.26倍，且有效降低了發(fā)酵培養(yǎng)基成本。在優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上對培養(yǎng)基初始pH、裝液量、接種量、搖床轉速、發(fā)酵溫度以及發(fā)酵時間6個發(fā)酵條件進行優(yōu)化，獲得了初始pH 7.0、裝液量50 mL/250 mL、接種量2.0%(體積分數)、發(fā)酵溫度32 ℃、搖床轉速180 r/min和發(fā)酵時間22 h的組合，優(yōu)化后抗菌肽的效價達到了9 422.33 AU/mL，與最初發(fā)酵效價相比(602.32 AU/mL)提高了15.6倍。

2019年，CHEN等[26]從碳源、氮源、無機鹽以及初始pH角度對產酶溶桿菌在搖瓶中合成抗菌肽WAP-8294A的產量進行了優(yōu)化，得到了以葡萄糖、牛肉膏、大豆油、CaCO3、NaCl作為成分的發(fā)酵培養(yǎng)基與初始pH為8.5的發(fā)酵條件，發(fā)酵48 h，抗菌肽WAP-8294A的產量提高了近10倍，經過探究發(fā)現以雙糖作為碳源更能促進抗菌肽WAP-8294A的合成與菌體的生長，與本研究篩選出的麥芽糖結果相吻合。但不同的是，與CHEN等篩選出的CaCO3作為無機鹽相比，MgSO4作為無機鹽更能促進產酶溶桿菌L-43合成抗菌肽，且初始pH為7.0時更適宜菌體合成抗菌肽，這可能與菌體之間的代謝差異相關，需要后續(xù)進一步研究。與CHEN等優(yōu)化的培養(yǎng)基相比，本研究獲得的培養(yǎng)基成分較為簡單，仍有效提高了抗菌肽效價。除此之外，本研究亦對菌體的發(fā)酵時間進行了優(yōu)化，將發(fā)酵時間縮短至22 h，在保證產量的情況下節(jié)約了時間與成本；同時對初始pH、裝液量、接種量、發(fā)酵溫度以及搖床轉速進行了優(yōu)化，使產量進一步得到了提高，這也為后期產酶溶桿菌的放大生產以及抗菌肽的應用等研究提供了參考。