楊曉鋼，趙鑫銳,2,3，堵國成,2,3*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 未來食品科學(xué)中心，江蘇 無錫，214122) 3(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

發(fā)酵劑是具有特定酶活性的單獨或混合的菌株配方，肉用發(fā)酵劑是能夠在肉制品中自我繁殖的活性微生物，它們可以保持肉制品的鮮度，控制肉制品衛(wèi)生安全，增強(qiáng)其可接受性[1]。在肉制品中添加發(fā)酵劑還具有降膽固醇、降生物胺、抗氧化等功能特性，同時可以產(chǎn)生促進(jìn)碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪分解的酶類，賦予發(fā)酵肉良好風(fēng)味。自然發(fā)酵肉制品存在著品質(zhì)不穩(wěn)定、生產(chǎn)易受環(huán)境制約且生產(chǎn)周期長等缺點。采用接種發(fā)酵劑的方法發(fā)酵牛肉，可以提高產(chǎn)品的品質(zhì)和安全、確保產(chǎn)品獨特風(fēng)味的形成。牛肉富含脂類、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和B族維生素等營養(yǎng)成分，是人們膳食中常見的肉類品種。隨著生活質(zhì)量的提高，消費者對牛肉制品的要求也越來越高，迫切需要研制營養(yǎng)均衡、風(fēng)味獨特的中高檔牛肉制品。因此制備一款能產(chǎn)生良好風(fēng)味、適用于發(fā)酵牛肉的發(fā)酵劑具有重要的意義。

目前歐美國家對微生物發(fā)酵肉制品的特性進(jìn)行了較為深入的研究，已經(jīng)完成了從傳統(tǒng)的自然發(fā)酵向微生物定向接種發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)變，發(fā)酵肉制品的生產(chǎn)工藝已相當(dāng)成熟[2]。我國發(fā)酵肉制品行業(yè)起步較晚，國內(nèi)的發(fā)酵肉制品開發(fā)目前還主要停留在實驗室階段，市面產(chǎn)品較少。發(fā)酵劑中的乳酸菌利用碳水化合物生成的乳酸和少量的乙酸、甲酸、琥珀酸等，可在抑制腐敗菌生長同時賦予發(fā)酵肉特殊的香味[3]。葡萄球菌與肉制品色澤的形成相關(guān)，而木糖葡萄球菌能夠轉(zhuǎn)換氨基酸和游離脂肪酸，協(xié)調(diào)風(fēng)味的形成[4]。酵母菌在發(fā)酵過程中能夠抑制脂肪的氧化，此外還能形成一定量的酯類和醇類改善肉制品的風(fēng)味。單獨使用酵母，會使氨的含量上升，而乳酸和乙酸的含量下降，從而導(dǎo)致pH的上升；酵母菌與乳酸菌和微球菌聯(lián)合使用時，效果較好[5]。目前多數(shù)研究聚焦，單菌或兩菌混合發(fā)酵肉類，張?zhí)K蘇等[6]從自然發(fā)酵酸菜汁中分離出乳酸菌，將其和漢遜德巴利酵母菌混合發(fā)酵塊狀鹿肉并研究其發(fā)酵特性。SUN等[7]在哈爾濱干腸中接種木糖葡萄球菌和植物乳桿菌，研究其對香腸的腸桿菌數(shù)、生物胺積累量和感官品質(zhì)的影響。RUIZ-MOYANO等[8]將乳酸片球菌SP979和發(fā)酵乳桿菌HL57混合作為發(fā)酵劑，進(jìn)行伊比利亞發(fā)酵香腸的研制。然而對于乳酸菌、葡萄球菌和酵母菌3種菌組合發(fā)酵肉的研究報道較少。

在肉制品發(fā)酵過程中，微生物可以代謝亮氨酸生成3-甲基丁醛，3-甲基丁醛可以和含硫化合物反應(yīng),產(chǎn)生良好的風(fēng)味。同時，3-甲基丁醛的閾值很低，對發(fā)酵肉制品的典型風(fēng)味有重要影響，可以作為發(fā)酵劑菌種產(chǎn)香性狀量化的標(biāo)準(zhǔn)。本實驗從傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品出發(fā)，經(jīng)過發(fā)酵特性試驗初步篩選出符合要求的乳酸菌、葡萄球菌和酵母菌，以產(chǎn)3-甲基丁醛的能力為標(biāo)準(zhǔn)復(fù)篩篩選出產(chǎn)香菌株。再經(jīng)拮抗實驗，并以pH和游離氨基酸含量為標(biāo)準(zhǔn)確定最優(yōu)的菌種組合以及其比例。經(jīng)過單因素試驗確定優(yōu)化范圍，以pH和感官評分為標(biāo)準(zhǔn)運用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝。隨后，將本實驗研制的發(fā)酵劑與商業(yè)發(fā)酵劑進(jìn)行對比，探討與商業(yè)發(fā)酵劑發(fā)酵的肉制品在pH、色差、游離氨基酸含量、質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味等方面的差異，以期為我國優(yōu)良發(fā)酵劑的制備和研發(fā)提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

各種來源的中國傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品如宣威火腿、金華火腿、皇上皇臘腸、松桂坊臘魚、如皋火腿、四川臘腸、哈爾濱紅腸、湖南煙熏臘肉、貴州酸渣肉等十余種樣品，市售。商業(yè)發(fā)酵劑WBX-43、THM-17、BM-60和BM-101，上海昊岳有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基、氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基、葡萄糖產(chǎn)氣培養(yǎng)基、產(chǎn)H2S培養(yǎng)基、產(chǎn)氨培養(yǎng)基、H2O2產(chǎn)生檢測培養(yǎng)基、硝酸鹽還原培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基、MSA培養(yǎng)基、發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣培養(yǎng)基、硝酸鹽還原酶培養(yǎng)基、精氨酸產(chǎn)氨培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、生長培養(yǎng)基、DNA酶培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基等培養(yǎng)基配制參考王永霞[9]的方法,TTC上層培養(yǎng)基和TTC下層培養(yǎng)基配制參考許艷豐等[10]的方法。

1.3 儀器與設(shè)備

電子天平，奧豪斯儀器有限公司；可見分光光度計，島津儀器有限公司；顯微鏡，上海永亨光學(xué)儀器制造有限公司；SW-CJ-2G型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，致微(廈門)儀器有限公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HG303-4型電熱恒溫培養(yǎng)箱，南京試驗儀器廠。

1.4 實驗方法

1.4.1 乳酸菌初步篩選

1.4.1.1 樣品處理

在無菌環(huán)境下準(zhǔn)確稱取各樣品10 g，剪碎后將各樣品分別轉(zhuǎn)入90 mL無菌蛋白胨水中，于搖床振蕩混勻(220 r/min，1 h)，隨后靜置5 min。取1 mL上清液接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h。以2%(體積分?jǐn)?shù)，下同)接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。用無菌生理鹽水將培養(yǎng)液稀釋成不同倍數(shù)的菌懸液，分別吸取0.2 mL菌懸液均勻涂布于MRS鑒別培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h，挑取變?yōu)辄S色的單菌落，隨后將單菌落在MRS固體培養(yǎng)基上劃線分離純化2次，得到純菌落。將篩選出來的菌株進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢，將革蘭氏陽性的菌株進(jìn)行16S rRNA測定，篩選出乳酸菌。將篩選出的乳酸菌接種到MRS固體試管斜面，于4 ℃保藏。

1.4.1.2 乳酸菌發(fā)酵特性試驗

將篩選得到的乳酸菌進(jìn)行產(chǎn)黏性試驗、產(chǎn)H2O2試驗、產(chǎn)氨試驗、葡萄糖產(chǎn)氣試驗、產(chǎn)H2S試驗、硝酸鹽還原能力試驗、氨基酸脫羧酶實驗、耐鹽性實驗和耐亞硝酸鹽實驗，參考盧士玲[11]的方法進(jìn)行實驗。

1.4.2 葡萄球菌初步篩選

1.4.2.1 樣品處理

在無菌環(huán)境下準(zhǔn)確稱取各樣品10 g，剪碎后將各樣品分別轉(zhuǎn)入90 mL無菌蛋白胨水中，于搖床振蕩混勻(220 r/min，1 h)，隨后靜置5 min。取1 mL上清液接種于MSA液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h。以2%接種量接種到MSA液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。用無菌生理鹽水將培養(yǎng)液稀釋成不同倍數(shù)的菌懸液，均勻涂布于MSA固體培養(yǎng)基上，篩選出單菌落。隨后將單菌落在MSA固體培養(yǎng)基上劃線分離純化2次，得到純菌落。將篩選出來的菌株進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢，將革蘭氏陽性的菌株進(jìn)行16S rRNA測定，篩選出葡萄球菌。將篩選出的葡萄球菌接種到MSA固體試管斜面，于4 ℃保藏。

1.4.2.2 葡萄球菌發(fā)酵特性試驗

將篩選得到的菌株進(jìn)行過氧化氫酶檢測、凝固酶檢測、脫氧核糖核酸酶檢測、硝酸還原酶檢測、發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣實驗、產(chǎn)H2S試驗、分解精氨酸檢測、氨基酸脫羧酶、蛋白酶活性測定和脂肪酶活性測定實驗檢測，參考劉艷霞[12]的方法進(jìn)行實驗。

1.4.3 酵母菌初步篩選

1.4.3.1 樣品處理

取各樣品10 g于無菌下剪碎，將樣品加入YPD液體培養(yǎng)基中，加入鏈霉素和四環(huán)素鹽酸鹽至終質(zhì)量濃度為25 mg/L，于220 r/min 搖床，30 ℃培養(yǎng)24 h后，取1 mL培養(yǎng)液上清液，用無菌生理鹽水稀釋成不同的倍數(shù)，涂布于YPD固體平板培養(yǎng)基上于30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，挑取單菌落。隨后將單菌落在YPD固體培養(yǎng)基上劃線分離純化2次，得到純菌落。

1.4.3.2 酵母菌發(fā)酵特性試驗

將篩選的菌株進(jìn)行產(chǎn)酒精能力測定、耐鹽性試驗、耐亞硝酸鹽試驗、產(chǎn)香能力試驗測定，參照張鵬[13]的方法進(jìn)行實驗。

1.4.4 初篩菌株產(chǎn)3-甲基丁醛能力的復(fù)篩[14]

1.4.4.1 活化培養(yǎng)

將菌株于液體培養(yǎng)基中35 ℃活化2次，然后按2%的接種量接種到100 mL培養(yǎng)基中，35 ℃下培養(yǎng)24 h，4 ℃、10 000 r/min離心10 min收集菌體，將菌體重懸于無菌生理鹽水中，再次離心。重復(fù)操作1次，以洗去殘余培養(yǎng)基。所獲菌體于-20 ℃貯藏下備用。

1.4.4.2 3-甲基丁醛的生成

在已滅菌固相微萃取樣品瓶中加入0.5 mL待測菌液，3 mL含有2 mmol/L亮氨酸、2 mmol/L 5′-磷酸吡哆醛、10 mmol/L α-酮戊二酸、0.067 mol/L已滅菌磷酸緩沖液(pH 6.5)，反應(yīng)體系共3.5 mL；對照組加入0.5 mL無菌生理鹽水。35 ℃培養(yǎng)24 h。

1.4.4.3 3-甲基丁醛的提取

在室溫下用萃取纖維頭[羧基-聚二甲基硅氧烷(carboxen-polydimethylsiloxane, CAR-PDMS)]在固相微萃取樣品瓶中頂空萃取15 min，隨后在氣譜上解吸10 min。色譜條件：載氣N2，流量1.4 mL/min；毛細(xì)管色譜柱DB-1701(30 m×0.32 mm×1 μm)；柱箱溫度：維持38 ℃的溫度2 min，然后以3 ℃/min升溫到90 ℃，然后以10 ℃/min升溫到220 ℃，隨后保持3 min。檢測器：氫火焰離子化檢測器(flame ionization detector，F(xiàn)ID);溫度275 ℃。

1.4.4.4 3-甲基丁醛的鑒定和定量測定

根據(jù)3-甲基丁醛標(biāo)品的保留時間來定性，根據(jù)峰面積來定量。

1.4.5 菌種拮抗實驗

將復(fù)篩篩選出的3株菌用接種環(huán)挑取單菌落，不同菌株間兩兩依次交叉劃線于MRS固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行拮抗試驗。35 ℃培養(yǎng)48 h，待長出菌落后，觀察菌株劃線的交叉處是否生長菌落。如試驗菌落不能在交叉處生長，說明菌間有拮抗作用；反之則無拮抗作用，可用于發(fā)酵。

1.4.6 發(fā)酵牛肉工藝流程

參考李疆[15]的方法并稍作修改，選用檢驗合格的牛里脊肉，剔除筋膜和脂肪后，切成500 g左右的小塊，立即浸入準(zhǔn)備好的涼水中，除去殘余血液，大約浸泡1 h左右，中間換水2次。浸泡后瀝干，漂煮10 min，漂煮后的牛肉經(jīng)切塊(順纖維，20 g，5 cm×2 cm×1.5 cm)、發(fā)酵(注射)、烘烤(55～60 ℃，3～4 h)、殺菌(115 ℃滅菌，30 min)，冷卻至室溫將牛肉進(jìn)行真空包裝即為成品。牛肉處理過程中不添加任何調(diào)味料。

1.4.7 發(fā)酵牛肉品質(zhì)特性檢測

pH測定參照 GB/T 9695.5—2008《肉與肉制品 pH測定》；游離氨基酸測定采用茚三酮比色法；感官評定參照龐國強(qiáng)[16]的方法；色差和質(zhì)構(gòu)檢測參照付麗等[17]的方法；揮發(fā)性風(fēng)味化合物檢測參照周亞軍等[18]的方法。

1.4.8 單因素試驗設(shè)計

1.4.8.1 最適發(fā)酵組合確定

選擇35 ℃為發(fā)酵溫度，發(fā)酵時間48 h，接種量107CFU/g，菌種比例1∶1∶1，以pH和游離氨基酸含量為標(biāo)準(zhǔn)篩選出發(fā)酵劑最優(yōu)菌種組合。

1.4.8.2 發(fā)酵組合最適發(fā)酵比例確定

選擇35 ℃為發(fā)酵溫度，發(fā)酵時間48 h，接種量107CFU/g，將最優(yōu)發(fā)酵劑組合按著不同發(fā)酵劑菌種比例(1∶1∶1、1∶1∶2、1∶2∶1、1∶2∶2、2∶1∶1、2∶1∶2、2∶2∶1)進(jìn)行發(fā)酵，以pH和游離氨基酸含量為標(biāo)準(zhǔn)篩選出發(fā)酵劑最佳菌種組合的最佳菌種配比。

1.4.8.3 響應(yīng)面優(yōu)化工藝范圍確定

以pH和游離氨基酸含量為評價標(biāo)準(zhǔn)，確定發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和接種量響應(yīng)面優(yōu)化的條件范圍選擇。將各實驗研究因素定為變量，其他因素固定不變。不變因素為發(fā)酵溫度35 ℃、接種量107CFU/g，發(fā)酵時間48 h，發(fā)酵劑菌種配比植物乳桿菌LM34∶肉葡萄球菌SAB18∶異常威克漢姆酵母YE3為2∶1∶1。

1.4.9 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝

為確定最優(yōu)發(fā)酵工藝水平,在單因素實驗的基礎(chǔ)上,對發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量三因素進(jìn)行優(yōu)化組合，以pH和感官評分為響應(yīng)值采用三因素三水平Box-Behnken試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)，利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken實驗設(shè)計，其編碼水平見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and leels used in Box-Behnken design

1.4.10 與商業(yè)發(fā)酵劑發(fā)酵制品品質(zhì)對比

將本實驗篩選出的菌種按照最佳比例配制成發(fā)酵劑，發(fā)酵劑命名為FBS-55。將此發(fā)酵劑與4種商業(yè)發(fā)酵劑WBX-43、THM-17、BM-60和BM-101在響應(yīng)面優(yōu)化的發(fā)酵條件下共同發(fā)酵牛肉樣品，分析比較FBS-55與商業(yè)發(fā)酵劑發(fā)酵的樣品在pH、色差、游離氨基酸含量、質(zhì)構(gòu)和揮發(fā)性風(fēng)味化合物差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵劑菌株篩選

2.1.1 發(fā)酵特性實驗

從樣品中共篩選出乳酸菌、葡萄球菌和酵母菌各270株。經(jīng)一系列發(fā)酵特性試驗(表2)共篩選出符合全部發(fā)酵特性試驗要求的菌株，其中乳酸菌21株，葡萄球菌9株，酵母菌12株。經(jīng)16S rRNA菌株鑒定后，21株乳酸菌中15株為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，6株為戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)；9株葡萄球菌皆為肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)；12株酵母菌中，5株為近平滑假絲酵母(Candidametapsilosis)，7株為異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)。其中植物乳桿菌、戊糖乳桿菌和肉葡萄球菌為一般認(rèn)為安全(Generally Recognized As Safe，GRAS)的食品級菌株，異常威克漢姆酵母可用于酸面團(tuán)的發(fā)酵[19]，而近平滑假絲酵母為非食品級菌株，因此僅選擇除近平滑假絲酵母外的37株菌用于低酸牛肉發(fā)酵劑的篩選。

表2 分離菌株主要發(fā)酵特性Table 2 The main fermentation characteristics of the isolates

2.1.2 產(chǎn)3-甲基丁醛實驗結(jié)果

對發(fā)酵特性實驗所篩選得到的菌株產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)3-甲基丁醛的能力的大小進(jìn)行檢測。由表3可知，葡萄球菌產(chǎn)3-甲基丁醛能力較強(qiáng)，乳酸菌和酵母菌產(chǎn)3-甲基丁醛能力較差，這與王海燕等[14]的研究結(jié)果一致。挑選出3-甲基丁醛產(chǎn)量最高的乳酸菌、葡萄球菌和酵母菌各3株，分別為植物乳桿菌LRS3、LRS50和LM34；肉葡萄球菌SAB18、SAB113和SAB25；異常威克漢姆酵母YE3、YE10和YE15。

表3 不同菌株的3-甲基丁醛產(chǎn)量Table 3 Production of 3-methyl-butanal by different strains

2.1.3 拮抗實驗

將3種菌兩兩交叉劃線涂布培養(yǎng)，共27個組合每組3個平行。當(dāng)2種菌的相交處沒有出現(xiàn)抑菌圈，說明2種菌之間不存在拮抗作用。統(tǒng)計結(jié)果可知，27個組合之間均未出現(xiàn)抑菌圈，3種菌株兩兩之間不存在拮抗作用，可用于發(fā)酵劑配制。

2.1.4 最佳菌種組合確定

不同組合發(fā)酵牛肉的pH和游離氨基酸含量見表4。游離氨基酸含量最高的3組為第5組、第19組和第21組，其游離氨基酸均>1 000 mg/kg，其中第19組的游離氨基酸含量最高，為1 174.44 mg/kg。傳統(tǒng)上認(rèn)為低酸牛肉pH≥5.50，低酸發(fā)酵在風(fēng)味、營養(yǎng)方面都優(yōu)于高酸發(fā)酵，而且從我國消費習(xí)慣來看，低酸發(fā)酵肉制品更具有市場競爭力。而pH>5.90時腐敗菌會生長，導(dǎo)致牛肉腐敗[15]。3組中，第5組pH為6.00，第19組pH為5.53，第21組pH為5.77。第19組最接近低酸發(fā)酵牛肉的酸度標(biāo)準(zhǔn)且游離氨基酸含量最高，故選擇第19組即植物乳桿菌LM34、肉葡萄球菌SAB18和異常威克漢姆酵母YE3作為發(fā)酵劑菌種組合。

表4 不同菌種組合發(fā)酵牛肉的pH和游離氨基酸含量Table 4 pH and free amino acid contents of the different combination of strains

2.2 工藝條件優(yōu)化

2.2.1 最佳配比確定

由圖1可知游離氨基酸含量最高的2組菌種配比是植物乳桿菌LM34∶肉葡萄球菌SAB18∶異常威克漢姆酵母YE3為2∶1∶1和1∶1∶2，其他組游離氨基酸含量差別不大。但由于1∶1∶2組的pH值為5.93>5.90，可能會導(dǎo)致腐敗菌生長。2∶1∶1組的pH為5.43，符合低酸牛肉標(biāo)準(zhǔn)，更適合國人口感且能抑制腐敗菌生長。選擇發(fā)酵劑菌種比例為植物乳桿菌LM34∶肉葡萄球菌SAB18∶異常威克漢姆酵母YE3 2∶1∶1。

圖1 發(fā)酵劑配比對牛肉pH及游離氨基酸含量的影響Fig.1 Effect of mixed starter cultures on pH and free amino acid content of fermented beef

2.2.2 發(fā)酵時間的選擇

由圖2可知，隨著發(fā)酵時間的延長，乳酸菌大量繁殖，牛肉干pH逐漸降低，游離氨基酸含量顯著提高。在發(fā)酵時間12～36 h，pH值急速下降，36 h時達(dá)到5.60，能夠抑制腐敗菌生長。在36 h后pH值降低速度變緩，在48 h達(dá)到5.47，符合低酸牛肉發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)。在48 h后pH值繼續(xù)下降，到達(dá)發(fā)酵終點時pH值為5.27，可能會造成口感過酸。綜合考慮，發(fā)酵時間選擇18(pH 6.37)～66 h(pH 5.29)。

圖2 發(fā)酵時間對牛肉pH和游離氨基酸含量的影響Fig.2 Effect of fermentation time on pH and free amino acid content of fermented beef

2.2.3 發(fā)酵溫度的選擇

由圖3-a可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵牛肉的產(chǎn)酸速率增大。其中22 ℃組pH下降速率較小，到發(fā)酵終點時pH值為6.03，無法抑制腐敗菌生長。26 ℃組在12～36 h發(fā)酵產(chǎn)酸速率比22 ℃組高，但明顯低于其他3組。產(chǎn)生這樣變化的原因可能是乳酸菌低溫產(chǎn)酸能力小于高溫產(chǎn)酸能力[20]。30、34和38 ℃發(fā)酵在12 h之前pH下降速率不大，在12 h后迅速下降，在36 h后下降速率又開始變慢，最終34和38 ℃ 2組發(fā)酵終點pH相近，均為5.10左右。由圖3-b可知,隨著發(fā)酵時間延長，5組游離氨基酸含量都增加，在48 h前38 ℃組的游離氨基酸含量低于34 ℃組，隨后38 ℃組的游離氨基酸含量慢慢超過34 ℃組，在發(fā)酵終點時，發(fā)酵溫度越高，游離氨基酸含量越高。綜上，發(fā)酵溫度優(yōu)化范圍選擇26～38 ℃較為適宜。

a-pH；b-游離氨基酸含量圖3 發(fā)酵溫度對牛肉pH和游離氨基酸含量的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on pH and free amino acid content of fermented beef

2.2.4 菌種接種量的選擇

由于乳酸菌分解碳水化合物生成乳酸，由圖4-a可知，隨著乳酸菌的接種量增大，乳酸的產(chǎn)量增加，pH逐漸降低。接種量為104和105CFU/g時，發(fā)酵終點的pH分別為6.43和6.18，無法抑制腐敗菌生長。由圖4-b可知，隨接種量增加和發(fā)酵時間延長，牛肉中游離氨基酸含量逐漸增加。這與CANDOGAN等[21]的研究一致。因此接種量選擇106～108CFU/g較為適宜。

a-pH；b-游離氨基酸含量圖4 接種量對發(fā)酵牛肉pH和游離氨基酸含量的影響Fig.4 Effect of inoculum size on pH and free amino acid content on fermented beef

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵工藝

2.3.1 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果見表5。試驗共17個試驗點(零點5個、析因點12個)，A、B、C三因素所構(gòu)成三維頂點為自變量值。pH值和感官評分為響應(yīng)值，所得數(shù)據(jù)由Design-Expert 8.0.6軟件回歸分析。

表5 Box-Behnken試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 5 Box-Behnken design and results

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析

pH響應(yīng)面模型F值為19.31、P為0.000 4，失擬項F為3.52、P為0.127 8>0.05，變異系數(shù)為2.21%；感官評分響應(yīng)面模型F值為27.63、P為0.000 1，失擬項F為3.63、P為0.122 5>0.05，變異系數(shù)為0.89%。2個實驗?zāi)Ｐ突貧w極顯著，失擬合相對于純誤差不顯著、模型建立有效，試驗精密度及可靠性較高。由圖5可知對pH值影響的因素由大到小為：接種量>發(fā)酵溫度>發(fā)酵時間；對感官評分影響的各因素從大到小依次為：發(fā)酵溫度>接種量>發(fā)酵時間(圖6)。在Design-Expert 8.0.6軟件中，Optimization設(shè)定感官評價為Maximize，pH為5.40～5.70，得到的最優(yōu)發(fā)酵條件組合是發(fā)酵溫度35.87 ℃，發(fā)酵時間48.18 h，接種量1.32×107CFU/g。其pH預(yù)測值為5.43，感官評價得分預(yù)測值為89.33。經(jīng)發(fā)酵驗證試驗后測得發(fā)酵牛肉干pH值為5.48，感官評價得分為87.67，得分與預(yù)測值相近，表明本研究確定的工藝可行度高，發(fā)酵劑可用于牛肉的發(fā)酵，將此發(fā)酵劑命名為FBS-55。

a-發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間；b-發(fā)酵溫度和接種量；c-發(fā)酵時間和接種量圖5 各因素對牛肉pH影響的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the effect fermentation conditions on the pH of fermented beef

a-發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間；b-發(fā)酵溫度和接種量；c-發(fā)酵時間和接種量圖6 各因素對牛肉感官評分影響的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the effect of fermentation conditions on the sensory ealuation score of fermented beef

2.4 與商業(yè)發(fā)酵劑發(fā)酵制品品質(zhì)對比

2.4.1 pH對比

由圖7可知BM-60和THM-17兩組發(fā)酵劑發(fā)酵牛肉所得的牛肉pH值相近，分別為5.25和5.27，F(xiàn)BS-55和BM-101兩組發(fā)酵劑發(fā)酵牛肉所得pH值相近分別為5.51和5.56，WBX-43發(fā)酵牛肉pH最低為5.04。5組發(fā)酵劑均能抑制腐敗菌生長，但發(fā)酵劑WBX-43發(fā)酵的牛肉由于pH過低，可能會造成口感偏酸。最符合低酸牛肉的標(biāo)準(zhǔn)的兩組是發(fā)酵劑FBS-55和發(fā)酵劑BM-101。

圖7 不同發(fā)酵劑的發(fā)酵牛肉pHFig.7 pH of fermented beef with different starters

2.4.2 色澤對比

由表6可知THM-17、BM-101和FBS-55三組發(fā)酵劑的樣品L*差別不顯著(P<0.05)，WBX-43組L*明顯低于BM-60。FBS-55的樣品紅度值a*明顯高于其他組發(fā)酵劑，WBX-43和FBS-55組的黃度b*小于其他組，其余3組差別不大。在發(fā)酵牛肉干制作過程中，對色澤影響最關(guān)鍵的是紅度值a*，但黃度值b*和亮度值L*對其也有一定的影響[22]。因此參考段艷[23]的方法引入影響參數(shù)E值作為衡量、評價牛肉色的主要參數(shù)。由表6可知FBS-55的E值高于其余發(fā)酵劑組。綜合以上結(jié)果，在發(fā)酵牛肉干整個制作過程中，F(xiàn)BS-55發(fā)酵劑組的紅度值a*和E值顯著高于其他3組(P<0.05)。說明添加FBS-55發(fā)酵劑可以有效地改善發(fā)酵牛肉干的色澤，使其顏色更鮮艷，更易吸引消費者。

表6 不同發(fā)酵劑發(fā)酵牛肉色度Table 6 Chroma of fermented beef by different starters

2.4.3 游離氨基酸含量差異

如圖8所示，5組發(fā)酵劑中游離氨基酸含量最高的是FBS-55，BM-60游離氨基酸含量最低，其余3組游離氨基酸含量差別不大(P<0.05)。游離氨基酸的含量直接影響著發(fā)酵牛肉干風(fēng)味物質(zhì)的形成[24]。因此采用FBS-55發(fā)酵牛肉，可能會產(chǎn)生更好的風(fēng)味。

圖8 不同發(fā)酵劑發(fā)酵牛肉游離氨基酸含量Fig.8 Free amino acid contents of fermented beef by different starters

2.4.4 發(fā)酵牛肉質(zhì)構(gòu)特性分析

在質(zhì)地屬性中，硬度對消費者來說是最重要的，它決定了肉類的商業(yè)價值[25]。由表7可知，BM-60組樣品的硬度最高，THM-17組樣品硬度最低，WBX-43、BM-101和FBS-55三組樣品的硬度適宜[26]。造成發(fā)酵肉樣硬度和咀嚼度不同的原因是發(fā)酵時菌種的蛋白酶作用不同，蛋白酶含量在發(fā)酵過程中增強(qiáng)，促使牛肉中肌漿蛋白與肌原纖維蛋白分解，破壞樣品內(nèi)部結(jié)合力，降低硬度和咀嚼性。THM-14和BM-101兩組發(fā)酵肉黏性過大，可能會造成不良口感。5組發(fā)酵肉樣的彈性之間差別不大。

表7 不同發(fā)酵劑發(fā)酵牛肉質(zhì)構(gòu)參數(shù)Table 7 Texture parameters of fermented beef by different starters

2.4.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

分離出的揮發(fā)性化合物主要以醛類和醇類化合物為主，碳?xì)浠衔锏南阄堕撝递^高，對肉品香味形成直接貢獻(xiàn)不大。醛類是最重要的揮發(fā)性化合物，其風(fēng)味閾值較低。己醛、壬醛、癸醛等直鏈醛類主要是脂肪氧化降解產(chǎn)生的，這說明接種復(fù)合發(fā)酵劑在一定程度上促進(jìn)了牛肉蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化[18]。由表8可知，其中5組發(fā)酵劑醛類相對含量最多的是WBX-43，其中壬醛含量遠(yuǎn)高于其他組。壬醛為油酸的氧化之后的產(chǎn)物，具有油脂的清新味，是燒制類牛肉中常見的風(fēng)味物質(zhì)[27]。FBS-55組是5組中唯一含有3-甲基丁醛的樣品，相對含量為2.26%。3-甲基丁醛來源于亮氨酸，與風(fēng)味密切相關(guān)。此外在高濃度的酸和醇存在以及微生物酯酶活力低的情況下，它們能夠進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成芳香的酯類物質(zhì)改善產(chǎn)品風(fēng)味。

表8 不同發(fā)酵劑發(fā)酵牛肉主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類及相對含量Table 8 Types and relatie contents of olatile flaor substances in fermented beef by different starters

3-甲基-1-丁醇風(fēng)味閾值較低，是熟肉制品中重要的香氣成分。5組發(fā)酵劑中FBS-55和THM-17發(fā)酵樣品中檢出3-甲基-1-丁醇，其含量分別為2.90%和0.30%。1-辛烯-3-醇被認(rèn)為是產(chǎn)生香氣的重要因素，具有蘑菇般的氣味[28]，F(xiàn)BS-55發(fā)酵樣品中1-辛烯-3-醇含量較高，為6.03%。醇類中乙醇是多數(shù)酯類風(fēng)味物質(zhì)的合成底物，對醬類制品風(fēng)味的形成起到間接重要影響。乙醇，有的被氧化生成有機(jī)酸，有的和氨基酸或有機(jī)酸等生成醋，有的部分揮發(fā)或殘留在醬膠中，對發(fā)酵型醬制品的香味構(gòu)成有重要的作用[29]。5組發(fā)酵中只有FBS-55組樣品中檢出乙醇，含量為5.11%。

吡嗪類物質(zhì)是美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物，具有濃郁的烤肉香氣，5組發(fā)酵劑中FBS-55和BM-101發(fā)酵樣品吡嗪相對含量較高，分別為3.52%和3.01%。適量的有機(jī)酸可提高醬制品的香味和口感，除了本身呈味之外，有機(jī)酸參與酯化反應(yīng)，形成酯香風(fēng)味[30]。由表8可知WBX-43發(fā)酵的牛肉中含有10種酸類，相對含量為35.62%。乙酸含量為7.01%，遠(yuǎn)高于其余4組，有機(jī)酸含量過高，可能會造成不良風(fēng)味。

綜上所述，自主研發(fā)發(fā)酵劑FBS-55發(fā)酵的肉制品中含有3-甲基丁醛，能夠產(chǎn)生良好風(fēng)味，有機(jī)酸含量適量，有助于提高牛肉口感，同時含有熟肉肉制品中重要的香氣物質(zhì)3-甲基-1-丁醇和1-辛烯-3-醇。此外還含有乙醇，可以使肉制品產(chǎn)生良好的醬香。

3 結(jié)論

從我國傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中篩選出3種菌，經(jīng)過發(fā)酵特性實驗的初篩和產(chǎn)3-甲基丁醛能力的復(fù)篩篩選出植物乳桿菌、肉葡萄球菌和異常威克漢姆酵母各3株。經(jīng)過拮抗實驗和最佳組合篩選實驗篩選出植物乳桿菌LM34、肉葡萄球菌SAB18和異常威克漢姆酵母YE3作為發(fā)酵劑菌種。以pH和游離氨基酸為評價指標(biāo)進(jìn)行一系列的單因素試驗，確定發(fā)酵劑菌種配比為2∶1∶1，發(fā)酵條件優(yōu)化的選擇范圍為：發(fā)酵溫度26～38 ℃、發(fā)酵時間18～66 h和接種量106～108CFU/g。以pH和感官評分為響應(yīng)值采用三因素三水平Box-Behnken試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)，優(yōu)化后的參數(shù)為發(fā)酵溫度35.87 ℃，發(fā)酵時間48.18 h，接種量1.32×107CFU/g。其pH預(yù)測值為5.43，感官評價得分預(yù)測值為89.33。經(jīng)發(fā)酵驗證試驗后測得發(fā)酵牛肉干pH值為5.48，感官評價得分為87.67。

將本實驗研制發(fā)酵劑FBS-55與4種商業(yè)發(fā)酵劑進(jìn)行pH、游離氨基酸含量、質(zhì)構(gòu)、色差和風(fēng)味物質(zhì)的對比。自制發(fā)酵劑發(fā)酵的牛肉樣品pH值適宜符合低酸牛肉標(biāo)準(zhǔn)，游離氨基酸含量較高，口感優(yōu)良、軟硬適中，色澤較好，同時具有良好的風(fēng)味，可用于低酸牛肉的發(fā)酵。