趙巖，李根，張瑩，初樂，路遙，馬寅斐，朱風(fēng)濤，余曉斌*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(中華全國供銷合作總社濟(jì)南果品研究院，山東 濟(jì)南，250014) 3(山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 德州，251100)

紅棗(ZizyphusjujubaMill.)又名棗子，鼠李科棗屬植物棗樹果實(shí)，在我國分布極廣，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國現(xiàn)有上萬公頃棗樹，年產(chǎn)鮮棗140多萬t，占世界總產(chǎn)量的98%[1]。紅棗營養(yǎng)價(jià)值豐富，含有豐富的有機(jī)酸、生物堿類、三萜皂苷類、黃酮類化合物以及各種維生素，具有良好的營養(yǎng)保健作用[2]。目前市場上紅棗大部分仍作為原棗進(jìn)行銷售，由于深加工技術(shù)不足導(dǎo)致了大量的損失，我國紅棗制品主要為基于初級(jí)加工的干棗、棗粉等，而其深加工產(chǎn)品，產(chǎn)品如棗酒、棗醋等相對(duì)較少，使得紅棗資源的利用價(jià)值大大降低[3]。

紅棗酒具有酒精度低、營養(yǎng)價(jià)值豐富、口感酸甜適宜等特點(diǎn)，可提高機(jī)體免疫力、防治骨質(zhì)疏松、軟化血管等[4]，SAN等[5]研究發(fā)現(xiàn)，使用稀釋過的紅棗酒給小鼠灌胃7 d后發(fā)現(xiàn)小鼠腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)顯著提高，說明紅棗酒具有提高機(jī)體免疫力的作用；PAWLOWSKA等[6]利用HPLC/PDA/ESI-MS法對(duì)紅棗酒中的黃酮類化合物含量進(jìn)行了測定并對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行了研究，結(jié)果表明紅棗酒中的黃酮類化合物具有良好的抗氧化活性。但是紅棗中果膠含量十分豐富，導(dǎo)致紅棗在制汁過程中產(chǎn)生大量的甲醇，不僅會(huì)對(duì)紅棗酒的品質(zhì)產(chǎn)生不良影響，同時(shí)過量的甲醇也會(huì)對(duì)人的健康造成危害[7]，目前常見的降低果酒中甲醇的方法通常是利用膠體物質(zhì)吸附果汁中的果膠甲酯酶，從而降低其活性，或是通過添加酚酸來降低果膠甲酯酶的活性[8]，但不含果膠甲酯酶的酶制劑往往活性較低，對(duì)果膠分解不徹底，從而導(dǎo)致酶解效果不好，出汁率較低。如何能夠在不影響出汁率的情況下降低紅棗汁中的甲醇，同時(shí)最大程度保留其原有的風(fēng)味，是紅棗酒產(chǎn)業(yè)急需解決的問題。

分子蒸餾技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種高效、環(huán)保的分離技術(shù)，它是一種非平衡的短程液-液蒸餾技術(shù)[9]，由于不同物質(zhì)分子的平均自由程不同，因此其表面蒸發(fā)速率有差異，在高真空條件下，分子受熱逸出液體表面，使液體中不同成分在遠(yuǎn)低于其沸點(diǎn)的溫度下分離[10]。分子蒸餾技術(shù)具有真空度高、操作溫度低、受熱時(shí)間短、分離程度高等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛用于天然藥物精制及香精香料提純等行業(yè)[11]。本研究通過分子蒸餾技術(shù)，將酶解后紅棗汁中的甲醇分離出來，從而達(dá)到降低紅棗酒中甲醇含量的效果，通過響應(yīng)面法優(yōu)化分子蒸餾最佳工藝條件，并與未蒸餾的紅棗酒進(jìn)行品質(zhì)對(duì)比，探討分子蒸餾在降低甲醇含量方面的工藝適用性，以期為分子蒸餾降低甲醇含量提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅棗、灰棗，購于新疆，4 ℃貯藏；果漿酶，諾維信；乙醇、甲醇、叔戊醇，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KL70-5分子蒸餾儀器，德國TA公司；TRACE ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國賽默飛科技公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；WAY阿貝折光儀，上海光學(xué)儀器五廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紅棗酶解液制備工藝流程

將無病害、新鮮紅棗用自來水沖洗干凈，加入80 ℃水，按料水比1∶3(g∶mL)混合浸泡1 h后打漿，在勻漿加入0.5 g/kg果漿酶在50 ℃下酶解1.5 h，后經(jīng)40目尼龍濾袋壓榨取汁，此為紅棗酶解液。

1.3.2 紅棗酶解液甲醇分子蒸餾清除

將150 mL紅棗汁酶解液加入到分子蒸餾設(shè)備進(jìn)料器中，依次打開散熱泵、刮板泵、真空泵和冷卻泵，當(dāng)設(shè)備真空度到達(dá)0.1 Pa后往冷阱中倒入適量液氮。打開加熱器調(diào)整至設(shè)定的溫度，調(diào)節(jié)刮板轉(zhuǎn)速和進(jìn)料流速，對(duì)紅棗酶解液進(jìn)行分子蒸餾。記錄輕組分餾出液的體積，同時(shí)以未處理酶解液甲醇質(zhì)量(mg)作為對(duì)照。

1.3.3 分子蒸餾清除甲醇條件優(yōu)化

控制蒸餾溫度30 ℃、進(jìn)料流速20 mL/min、刮板轉(zhuǎn)速100 r/min。分別研究蒸餾溫度(20、30、40、50、60 ℃)，進(jìn)料流速(10、15、20、25、30 mL/min)，刮板轉(zhuǎn)速(50、100、150、200、250 r/min)對(duì)150 mL紅棗酶解液中甲醇含量的影響，并計(jì)算清除率，分析蒸餾效果。

1.3.4 分子蒸餾響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素確定3個(gè)水平，以蒸餾溫度、進(jìn)料流速、刮板轉(zhuǎn)速為試驗(yàn)因素，以酶解液甲醇清除率為響應(yīng)值，采取Box-Behnken中心組合法進(jìn)行3因素3水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)水平表Table 1 Factors and leels in response surface design

1.3.5 分子蒸餾對(duì)紅棗酒品質(zhì)的影響

將300 mL紅棗酶解液平均分為2份，通過優(yōu)化后的分子蒸餾工藝進(jìn)行蒸餾處理的為蒸餾組；不經(jīng)分子蒸餾的為未蒸餾組。后加入釀酒酵母在20 ℃發(fā)酵7 d，發(fā)酵結(jié)束后對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行可溶性固形物、酒精度、香氣成分檢測。

1.4 測定方法

1.4.1 甲醇含量測定

參考GB 5009.266—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中甲醇的測定》，采用氣相色譜法測定甲醇含量，甲醇清除率按照公式(1)計(jì)算。

(1)

1.4.2 可溶性固形物測定

將待測液充分混勻，用阿貝折光儀檢測。

1.4.3 酒精度測定

使用酒度計(jì)檢測。

1.4.4 香氣含量測定

參照文獻(xiàn)[12]的方法，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)紅棗酒的揮發(fā)性成分進(jìn)行測定。

1.4.4.1 樣品處理

量取5 mL樣品于頂空進(jìn)樣瓶中，加入1 g NaCl，進(jìn)樣瓶40 ℃平衡30 min，將老化處理過的萃取頭(SPME Fiber Assembly：DB/CAR/PDMS, Autosampler)插入進(jìn)樣瓶中，頂空吸附30 min，解吸。

1.4.4.2 氣相色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱：TG-WAXMS色譜柱(30 mm×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持2 min，然后以5 ℃/min升溫至150 ℃，保持2 min，最后以8 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min；載氣(He)流速1.2 mL/min，壓力52.76 kPa；進(jìn)樣量1 μL；不分流。

電子電離離子源：電子能量70 e，質(zhì)量掃描范圍m/z35～450，0.2 scans/s；傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度280 ℃。

1.4.4.3 數(shù)據(jù)處理

采用NIST MS search 2.0數(shù)據(jù)采集及分析，根據(jù)保留指數(shù)及譜庫檢索確定風(fēng)味物質(zhì)；采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)各揮發(fā)性成分進(jìn)行定量，內(nèi)標(biāo)為2-辛醇(質(zhì)量濃度16.33 mg/L)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Origin 9.0、SPSS 20、Excel等軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒸餾溫度對(duì)甲醇清除率效果的影響

分子蒸餾系統(tǒng)的特點(diǎn)是蒸發(fā)器與冷凝器間距很小(20～50 mm)，蒸餾溫度是決定物料分離效果的關(guān)鍵因素，溫度越高，蒸汽分子的平均自由程越大，物料的分離效果越好[13]。由圖1可知，甲醇清除率隨蒸餾溫度的升高而逐漸增大，溫度>30 ℃后趨勢變緩，40 ℃時(shí)甲醇清除率達(dá)到74.94%，之后清除效果趨于飽和。但考慮到較高溫度對(duì)果酒中香氣及營養(yǎng)成分產(chǎn)生較大損失，因此選取蒸餾溫度為40 ℃。

圖1 蒸餾溫度對(duì)紅棗酶解液中甲醇清除效果的影響Fig.1 Effect of distillation temperature on the remoal of methanol in jujube enzymatic hydrolysate 注：甲醛質(zhì)量為餾出液中的含量(下同)

2.2 進(jìn)料流速對(duì)甲醇清除效果的影響

由圖2可知，隨著進(jìn)料流速的增大，發(fā)酵液中甲醇清除效果逐漸降低，可能是當(dāng)蒸餾溫度和刮板轉(zhuǎn)速一定的情況下，進(jìn)料流速大則意味著在蒸發(fā)器表面停留時(shí)間短，液體厚度增加，導(dǎo)致受熱時(shí)間減小，單位面積上需要蒸發(fā)的物料量增加，不利于甲醇的分離[14]。當(dāng)進(jìn)料流速15 mL/min時(shí)，甲醇清除率最大為79.46%，繼續(xù)減小進(jìn)料流速差異不明顯，對(duì)甲醇清除達(dá)到飽和狀態(tài)，但導(dǎo)致發(fā)酵液過度受熱[15]。綜上所述，選取的最適進(jìn)料流速為15 mL/min。

圖2 進(jìn)料流速對(duì)紅棗酶解液中甲醇清除效果的影響Fig.2 Effect of feeding speed on the remoal of methanol in jujube enzymatic hydrolysate

2.3 刮板轉(zhuǎn)速對(duì)甲醇清除效果的影響

刮板通過圍繞蒸發(fā)器壁轉(zhuǎn)動(dòng)，盡可能提高物料的駐留時(shí)間和適合的薄膜厚度，進(jìn)而到達(dá)更好的傳熱分離效果[16]。若轉(zhuǎn)速過小，物料無法形成均勻的薄膜，導(dǎo)致分離效果降低，提高轉(zhuǎn)速可以減小液體薄膜厚度，增加傳熱傳質(zhì)效果，提高分離效率[17]。由圖3可知，發(fā)酵液中甲醇含量隨著刮板轉(zhuǎn)速的提升而逐漸降低，清除率逐漸提高。當(dāng)刮板轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)，甲醇清除率最大為79.88%，當(dāng)刮板轉(zhuǎn)速繼續(xù)提高后，甲醇清除率呈下降趨勢，這可能是刮板轉(zhuǎn)速過高導(dǎo)致蒸發(fā)面液膜飛濺，甲醇分子劇烈運(yùn)動(dòng)易于與飛沫碰撞而返回液面中，使分離效果下降，這與黃會(huì)娜等[18]的研究結(jié)果一致。

圖3 刮板轉(zhuǎn)速對(duì)紅棗酶解液中甲醇清除效果的影響Fig.3 Effect of scraping speed on the remoal of methanol in jujube enzymatic hydrolysate

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.4.1 回歸模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)以甲醇清除率為響應(yīng)值，分析蒸餾溫度、進(jìn)料流速、刮板轉(zhuǎn)速對(duì)響應(yīng)值的影響，響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface methodology

用Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸擬合，并進(jìn)一步研究和優(yōu)化影響甲醇清除率的因素，做響應(yīng)面圖。多元回歸擬合，得到甲醇清除率與各因素的二次方程模型為：

Y=79.43+3.97A-1.60B+1.28C-2.06AB+4.6AC+2.22BC-4.63A2-7.57B2-4.46C2

根據(jù)表2響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果由表3所示。得出的回歸模型對(duì)酶解液甲醇清除率性達(dá)到顯著水平(P<0.01)，表明該回歸方程模型極顯著，失擬項(xiàng)差異性不顯著(P>0.05)，說明建立的回歸模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的擬合情況誤差較小，能夠很好地表現(xiàn)出各影響因素和響應(yīng)值之間的聯(lián)系并能較好地預(yù)測試驗(yàn)值。其中，3個(gè)因素蒸餾溫度(A)、進(jìn)料流速(B)、刮板轉(zhuǎn)速(C)，二次項(xiàng)交互作用的AB、AC、BC以及二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)甲醇清除率均有顯著影響(P<0.05)，3個(gè)因素對(duì)酶活性的影響大小依次為蒸餾溫度>刮板轉(zhuǎn)速>進(jìn)料流速。

表3 回歸模型甲醇清除率方差分析Table 3 ANOA of response surface model for pectinesterase

2.4.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖的坡度陡峭程度決定了兩者交互作用對(duì)甲醇清除率的影響大小，坡度越陡峭，兩者作用越顯著[19]。由圖4可知，蒸餾溫度和進(jìn)料流速、蒸餾溫度和刮板轉(zhuǎn)速、進(jìn)料流速和刮板轉(zhuǎn)速的響應(yīng)面圖坡度陡峭，說明該三者的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響顯著(P<0.05)，其他作用不顯著(P>0.05)，這與表3方差分析的結(jié)果一致。

通過Design-Expert 10軟件分析得到酶解液分子蒸餾最佳工藝條件為蒸餾溫度46.96 ℃、進(jìn)料流速14.35 mL、刮板轉(zhuǎn)速223.72 r/min，預(yù)測在此工藝條件甲醇清除率為81.23%?？紤]到工藝可行性，將上述工藝條件優(yōu)化為蒸餾溫度47 ℃，進(jìn)料流速14 mL/min，刮板轉(zhuǎn)速223 r/min，測定實(shí)際甲醇清除率為82.11%，與預(yù)測值較接近，采用響應(yīng)面優(yōu)化的工藝條件較可靠。

a-蒸餾溫度和進(jìn)料流速；b-進(jìn)料流速和刮板轉(zhuǎn)速；c-蒸餾溫度和刮板轉(zhuǎn)速圖4 交互作用響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plots for the interactie effects

2.5 分子蒸餾對(duì)紅棗酒品質(zhì)的影響

2.5.1 分子蒸餾對(duì)紅棗酒發(fā)酵效果的影響

由表4可知，分子蒸餾過程中有部分水蒸出，提高了酶解液的可溶性固形物含量，更利于酵母發(fā)酵，成品酒的酒精度更高，分析可知同等條件下酒精度提高約1%(ol)，同時(shí)經(jīng)過分子蒸餾后，果酒甲醇含量也低于未蒸餾組。綜上所述，分子蒸餾作為發(fā)酵前處理工藝能夠顯著提高發(fā)酵效率，降低成品酒中甲醇含量。

表4 分子蒸餾對(duì)紅棗酒發(fā)酵效果的影響Table 4 Effect of molecular distillation on the fermentation of jujube wine

2.5.2 分子蒸餾對(duì)紅棗酒香氣成分的影響

香氣是評(píng)價(jià)紅棗酒品質(zhì)好壞的重要指標(biāo)[20]，本實(shí)驗(yàn)通過GC-MS對(duì)蒸餾與未蒸餾組紅棗酒香氣成分進(jìn)行定量分析，共檢測出35種香氣成分，其中酯類物質(zhì)17種，醇類物質(zhì)7種，酸類物質(zhì)7種，其他成分4種。如表5所示，經(jīng)過分子蒸餾后紅棗酒中香氣化合物總量(146.37 mg/L)高于未蒸餾組(123.34 mg/L)。酯類物質(zhì)是紅棗酒中主要的香氣成分，其中乙酸酯多產(chǎn)生于酵母發(fā)酵階段，具有怡人果香和酒香味[21]，分子蒸餾在減壓加熱過程中雖然溫度不高，但也伴隨著一些果香味的逸出，因此發(fā)酵后乙酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯等含量略有降低，但酯類物質(zhì)總量蒸餾組(101.58 mg/L)顯著高于未蒸餾組(90.23 mg/L)。醇類物質(zhì)是發(fā)酵過程中主要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其中異戊醇作為含量最高的物質(zhì)，是構(gòu)成酒香味的主要成分；酸類物質(zhì)可增加紅棗酒風(fēng)味的復(fù)雜性和濃郁性，其中辛酸含量最高，給予酒更好的水果香味；同時(shí)一些萜烯類和醛類物質(zhì)賦予了紅棗酒玫瑰香、蘋果香等香氣，使紅棗酒的香味更加協(xié)調(diào)、厚重[22]。由表5可知，蒸餾組的醇類、酸類、醛類物質(zhì)的含量均高于未蒸餾組，可能是分子蒸餾后糖度上升，特征香氣成分含量也得到顯著提升，紅棗酒的香氣也更加濃郁。

表5 分子蒸餾對(duì)紅棗酒香氣成分的影響Table 5 Effect of molecular distillation on the aroma components of jujube wine

3 結(jié)論

通過對(duì)分子蒸餾溫度、進(jìn)料流速、刮板轉(zhuǎn)速對(duì)紅棗酶解液甲醇清除率的影響，結(jié)合響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化清除甲醇的最適工藝條件為蒸餾溫度47 ℃，進(jìn)料流速14 mL/min，刮板轉(zhuǎn)速223 r/min，在此工藝條件下，酶解液甲醇清除率達(dá)到82.11%。通過與未經(jīng)分子蒸餾紅棗酒品質(zhì)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，分子蒸餾能使酶解液糖度上升，使紅棗酒酒精度和香氣成分含量提升，提高紅棗酒品質(zhì)。

分子蒸餾作為一種近幾十年發(fā)展起來的分離技術(shù)廣泛應(yīng)用于天然物質(zhì)的提取與分離，對(duì)在紅棗酒中去除甲醇的應(yīng)用研究較少，本文針對(duì)紅棗酒中清除甲醇的工藝條件及適用性進(jìn)行了探討，為果酒加工產(chǎn)品在甲醇控制方面提供理論支持。