李曉嬌，汪玉潔，楊麗華，唐金山，宋志姣*

1(保山學(xué)院 資源環(huán)境學(xué)院，云南 保山，678000) 2(云南省高校怒江河谷生物質(zhì)資源高值轉(zhuǎn)化與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 保山，678000)

果膠是一種存在于植物細(xì)胞壁和胞間層的酸性多糖[1]，主鏈由半乳糖醛酸經(jīng)α-1,4-糖苷鍵連接形成，側(cè)鏈?zhǔn)怯砂肴樘恰⑹罄钐呛桶⒗堑戎行远嗵墙M成。果膠具有良好的凝膠性、吸附性、乳化性和增稠性等特性，被廣泛地應(yīng)用于食品和化妝品等生產(chǎn)領(lǐng)域[2-3]。此外，果膠多糖還具有抗菌、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫和抗癌等生物活性[4]。目前主要從柑橘皮、向日葵盤、香蕉皮和蘋果皮渣中提取果膠[5-7]，從小粒咖啡果皮中提取果膠還鮮有報(bào)道。

通常加工1 t小粒咖啡鮮果會(huì)產(chǎn)生0.5 t皮渣(包括果皮、果肉)，云南小?？Х戎矃^(qū)每年鮮果處理生產(chǎn)皮渣約39.68萬t[8]。這些咖啡皮渣除部分用作堆肥外，絕大部分作為廢棄物丟棄，造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。近年來，已有將小?？Х裙ぶ瞥煽Х裙げ琛⒐频犬a(chǎn)品，但均是小批次試驗(yàn)，未形成規(guī)?；a(chǎn)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，小?？Х裙ぶ泄z含量約為15%，其果膠水解物有較好的抑菌活性[9]。目前，果膠提取方法多達(dá)十余種，其中微波輔助法和超聲波輔助法提取可以縮短果膠的提取時(shí)間、節(jié)約溶劑，且較大限度地保留原料的天然活性，保護(hù)果膠的組分結(jié)構(gòu)[10-11]。然而，不同提取方法對(duì)果膠的理化性質(zhì)和生物活性的影響不同，馬麗蘋等[12]通過酸堿法和高壓蒸汽法改性蘋果果膠，改性后的蘋果果膠具有更好的抗氧化活性，因此，本研究采用鹽酸浸提法(traditional acid extraction, TAE)、微波輔助法(microwae assisted extraction, MAE)和超聲波輔助法(ultrasound assisted extraction, UAE)提取小?？Х裙ぶ械墓z，再通過酸堿改性和熱改性獲得2種改性果膠，并在分析改性前后果膠理化性質(zhì)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步測定改性前后果膠對(duì)DPPH自由基、·OH、·O2-和ABTS陽離子自由基的清除能力，為小?？Х裙べY源的綜合開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小?？Х?CoffeaarabicaL.)果皮由云南保山老基地咖啡有限公司提供；無水乙醇、鹽酸、水楊酸、硫酸亞鐵、氫氧化鈉、三氟乙酸，分析純，重慶川東化工有限公司；間羥聯(lián)苯、鄰苯三酚，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚環(huán)氧乙烷(poly ethylene oxide, PEO)、聚乙二醇(poly ethylene glycol, PEG)、巖藻糖(Fuc)鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、核糖(Rib)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖醛酸(GlcA)，美國Sigma公司；PEO/PEG(分子質(zhì)量:202 400，134 300，72 750，31 440，3 870，615 Da)，安捷倫；DPPH、ABTS，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(沃凱)。

U2600紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津公司；PL-GPC50高效凝膠滲透色譜，美國Agilent公司；ICS5000離子色譜、Nicolet is5FTIR紅外光譜儀，美國賽默飛公司；LDZX-75KB立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；N-1001D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，東京理化公司；Noa-Nano450掃描電鏡，美國FEI公司；550脫殼機(jī)，河南伍德機(jī)械設(shè)備有限公司；DZF 602真空干燥機(jī)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；XM-500UF智能靜音超聲儀，小美超聲儀器(昆山)有限公司；G80F23CN3L-C2微波爐，廣州電器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 果膠提取方法

1.2.1.1 小?？Х裙悠诽幚?/p>

小?？Х弱r果→[料液比：1∶8.5(g∶mL)，25 ℃]水浸泡12 h→脫殼機(jī)脫殼→果皮放置通風(fēng)處，太陽光下自然晾曬2～3 d直至水分含量為16.52%→粉碎機(jī)粉碎(20 000 r/min，3 min)→過80目篩→果皮粉末→加水(15 mL/g)煮沸10 min使酶失活→加入80%乙醇溶液脫色(10 min/次，重復(fù)3次)→干燥，粉碎備用。

1.2.1.2 TAE法

稱取10.00 g上述小?？Х裙悠酚?50 mL錐形瓶內(nèi)，按料液比1∶25 (g∶mL)加入pH 1.5的鹽酸溶液(0.032 mol/L)，于60 ℃水浴中提取90 min，冷卻后抽濾，濾液于40 ℃減壓濃縮至原體積的1/3，冰水浴冷卻后加入1.5倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇析，減壓過濾，用75%乙醇洗滌，除去醇溶性雜質(zhì)，濾渣于40 ℃下真空干燥至恒重，得果膠固體，稱重計(jì)算得率[9]。

1.2.1.3 MAE法

稱取10.00 g小?？Х裙悠酚?50 mL錐形瓶內(nèi)，按料液比1∶20 (g∶mL)加入pH 1.5的鹽酸溶液，于微波功率700 W下提取5 min，冷卻后抽濾，濾液按照1.2.1.2所述方法獲得果膠計(jì)算得率。

1.2.1.4 UAE法

稱取10.00 g小?？Х裙悠酚?50 mL錐形瓶內(nèi)，按料液比1∶20 (g∶mL)加入pH 1.5的鹽酸溶液，在超聲功率為200 W，溫度為40 ℃的條件下提取35 min。冷卻后抽濾，濾液按照1.2.1.2所述方法獲得果膠計(jì)算得率。

1.2.2 小?？Х裙すz改性方法

1.2.2.1 酸堿改性

稱取1.50 g小粒咖啡果皮果膠于250 mL錐形瓶中，加入100 mL、55 ℃的蒸餾水，配制得到質(zhì)量濃度為15 mg/mL的果膠樣品溶液。待果膠全部溶解后，緩慢加入3 mol/L NaOH溶液至pH 10.0，并置于55 ℃水浴中45 min。于室溫下，加入3 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至3.0，在室溫下靜置過夜(12 h)。然后加入3 倍體積的無水乙醇，攪拌產(chǎn)生大量的白色絮狀沉淀，過濾，濾渣于50 ℃真空烘干得到酸堿改性小粒咖啡果皮果膠[12]。改性果膠得率按公式(1)計(jì)算。

(1)

式中：m0，小粒咖啡果皮果膠質(zhì)量，g；m1，改性小?？Х裙すz質(zhì)量，g。

1.2.2.2 熱改性

稱取1.50 g小?？Х裙すz于250 mL錐形瓶中，加入50 mL、55 ℃的蒸餾水，配制得到質(zhì)量濃度為30 mg/mL的果膠樣品溶液。待果膠溶解后，調(diào)節(jié)pH值至4.0，置于高壓蒸汽滅菌鍋中，在115 ℃下維持45 min，取出冷卻至室溫，50 ℃下減壓蒸餾至原液體積的1/3，然后向濃縮液中加入3倍體積無水乙醇，攪拌產(chǎn)生白色絮狀沉淀，過濾，濾渣于50 ℃真空烘干得到熱改性小?？Х裙すz[12]。

1.2.3 小?？Х裙すz理化性質(zhì)測定

1.2.3.1 酯化度測定

稱取0.10 g果膠，充分溶解于100 mL蒸餾水中。加入2～3滴酚酞指示劑，用濃度為0.10 mol/L的NaOH溶液標(biāo)定，當(dāng)溶液變?yōu)榉奂t色并保持1 min不變色時(shí)，記錄所消耗的NaOH溶液體積(1，mL)，即為初始滴定度。再加入濃度為3.00 mol/L的NaOH溶液2.5 mL，搖勻，5 min后加入濃度為3.00 mol/L的HCl溶液2.5 mL，振蕩直至粉紅色消失。然后再加入2～3 滴酚酞指示劑，用0.10 mol/L NaOH溶液滴定至再次呈粉紅色并保持1 min不變色，記錄NaOH溶液的消耗體積(2，mL)，根據(jù)公式(2)計(jì)算酯化度。

(2)

1.2.3.2 微觀結(jié)構(gòu)測定

將果膠樣品粘于導(dǎo)電膠片上，噴金后在加速電壓為20 k的條件下利用掃描電子顯微鏡觀察9種果膠的表面形貌。

1.2.3.3 高效凝膠滲透色譜法(high performance gel permeation chromatography，HPGPC)測定分子質(zhì)量

準(zhǔn)確稱取(10±0.05)mg果膠樣品和標(biāo)準(zhǔn)品于20 mL樣瓶中，向其中分別加入10 mL的流動(dòng)相(水+0.2 mol/L NaNO3+0.01 mol/L NaH2PO4, pH 7.0)制成2 mg/mL溶液，加熱攪拌溶解，待樣品完全溶解后，微孔濾膜(0.22 μm)過濾，然后轉(zhuǎn)移至2 mL進(jìn)樣瓶。以不同分子質(zhì)量的PEO/PEG標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定樣品的分子質(zhì)量。測定條件：溫度40 ℃，溶劑流速1.0 mL/min，流動(dòng)相：水+0.2 mol/L NaNO3+0.01 mol/L NaH2PO4(pH 7.0)，標(biāo)樣：PEO/PEG，進(jìn)樣體積100 μL；色譜柱：2× PLgel 8 μm aquagel-OH Mixed-M 7.5 mm×300 mm，檢測器：示差折光檢測器。

1.2.3.4 單糖組分測定

取干凈的色譜瓶，精確稱量多糖樣品(5±0.05)mg，加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液，105 ℃加熱6 h，通N2吹干。加入甲醇清洗，通氮?dú)獯蹈?，重?fù)清洗2～3次。加入無菌水溶解，轉(zhuǎn)入色譜瓶中待測。

將上述乙酰化產(chǎn)物采用DionexTMCarboPacTMPA20(150 mm×3.0 mm，10 μm)液相色譜柱測定；進(jìn)樣量為5 μL；流動(dòng)相A(0.1 mol/L NaOH)，流動(dòng)相B(0.1 mol/L NaOH和0.2 mol/L NaAc)，流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃；洗脫梯度：0 min (A相)∶(B相)=95∶5，30 min (A相)∶(B相)=80∶20，30.1 min (A相)∶(B相)=60∶40，45 min (A相)∶(B相)=60∶40，45.1 min (A相)∶(B相)=95∶5，60 min (A相)∶(B相)=95∶5。

1.2.3.5 傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)測定

用KBr壓片法測定小?？Х裙すz的紅外光譜。將果膠樣品干燥至恒重，按照1∶100的質(zhì)量比取少量果膠與KBr混合均勻后壓片，在紅外光區(qū)為400～4 000 cm-1用FTIR掃描16次，掃描分辨率為4 cm-1。

1.2.4 小?？Х裙すz的抗氧化活性測定

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力測定

取2.0 mL 0.2 mmol/L新制的DPPH溶液(95%乙醇溶解)分別與2.0 mL不同質(zhì)量濃度的小?？Х裙すz樣品(0.2～3.2 mg/mL)充分混勻，在室溫下避光反應(yīng)20 min后，在517 nm處測定吸光度，記為A1，以95%乙醇溶液代替上述體系中的DPPH溶液，在517 nm處測定吸光度，記為A2，以蒸餾水代替上述體系中果膠樣品溶液，在517 nm處測定吸光度，記為A0，按公式(3)計(jì)算DPPH自由基清除率。

(3)

1.2.4.2 ·OH的清除能力測定

取0.6 mL 6 mmol/L FeSO4溶液分別與2.0 mL不同質(zhì)量濃度的果膠樣品溶液(0.2～3.2 mg/mL)混勻后，再加入0.6 mL 6 mmol/L的H2O2溶液，充分混勻后于室溫下反應(yīng)10 min，再分別加入6 mmol/L水楊酸0.6 mL混勻，繼續(xù)反應(yīng)10 min，在510 nm處測得吸光度為A1。在上述反應(yīng)體系中，以無水乙醇代替水楊酸，測定吸光度為A2，以蒸餾水代替樣品溶液，測定吸光度為A0，按1.2.4.1中的公式(3)計(jì)算清除率。

1.2.4.3 ·O2-清除能力測定

取不同質(zhì)量濃度(0.2～3.2 mg/mL)的果膠樣品溶液0.8 mL，分別加入2 mL Tris-HCl緩沖液(16 mmol/L pH 8.2)混合均勻，在25 ℃水浴30 min后，加入20 ℃水浴的鄰苯三酚樣品溶液0.2 mL混勻，室溫下靜置35 min，測定混合液在325 nm處的吸光度A1。在上述反應(yīng)體系中，以蒸餾水代替鄰苯三酚樣品溶液測得A2，以蒸餾水代替樣品測得的吸光度為A0，按公式(3)計(jì)算·O2-的清除率。

1.2.4.4 ABTS陽離子自由基清除能力測定

用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4、0.2 mol/L)配制7.4 mmol/L的ABTS溶液，加入2.6 mmol/L的過硫酸鉀，室溫下避光反應(yīng)16 h，然后再用上述磷酸鹽緩沖液稀釋，使溶液在734 nm處的吸光度A0為(0.70±0.02)，得ABTS陽離子自由基稀釋液。將果膠樣品用磷酸鹽緩沖液配制成質(zhì)量濃度為 0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL的溶液，分別量取0.2 mL不同質(zhì)量濃度果膠樣品溶液與2.0 mL ABTS陽離子自由基稀釋液混合，搖勻，室溫避光反應(yīng)20 min后，在734 nm處測定吸光度(A1)；同時(shí)將0.2 mL不同質(zhì)量濃度的果膠溶液與2 mL 磷酸鹽緩沖液振搖20 s使其混合，并室溫避光反應(yīng)20 min以后，在734 nm處測定吸光度(A2)。按公式(3)計(jì)算ABTS陽離子自由基清除率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。采用Origin 2019進(jìn)行作圖，SPSS 22.0進(jìn)行多重比較分析，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法對(duì)果膠得率的影響

3種不同方法提取的果膠得率如圖1所示，得率大小為：MAE法(7.24%)>UAE法(6.88%)>TAE法(5.21%)。通過多重比較分析，MAE法和UAE法的果膠得率無顯著差異(P>0.05)，而TAE法果膠得率較MAE和UAE法差異顯著(P<0.05)。可能原因是MAE法的熱效應(yīng)和UAE法的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)對(duì)小?？Х裙さ募?xì)胞壁的分解破壞程度大，使細(xì)胞更容易破裂，從而細(xì)胞中更多的多糖等物質(zhì)被分解出來，所得果膠得率相對(duì)較高[13]。

圖1 不同提取方法的果膠得率Fig.1 Pectin yield of different extraction methods

2.2 改性小?？Х裙すz的理化性質(zhì)

3種方法提取的果膠分別經(jīng)過酸堿改性和熱改性共得到6種不同的改性果膠，其理化性質(zhì)見表1。TAE法熱改性果膠(A3)產(chǎn)率36.50%，略高于酸堿改性果膠(A2)產(chǎn)率35.69%；MAE法的2種改性果膠產(chǎn)率均達(dá)到40%以上，高于其他2種方法所得的改性果膠；UAE法的2種改性果膠產(chǎn)率最低，為28.44%和28.69%。與改性前相比，6種改性果膠的GalA含量均顯著提高(P<0.05)。改性前3種方法提取的果膠酯化度均高于30%，而改性后酯化度均顯著降低(P<0.05)，且均降低到25%以下，且酸堿改性的果膠酯化度最低。果膠在酸堿改性時(shí)，堿處理產(chǎn)生β-消除反應(yīng)能使同聚半乳糖醛酸骨架解聚，同時(shí)也使酯化度降低；酸處理則優(yōu)先脫下側(cè)鏈上的中性糖[12,14]，因此，果膠通過酸堿改性后，其GalA含量增加，而酯化度下降；果膠熱改性，高溫高壓會(huì)引起β-消除反應(yīng)和脫甲酯基作用[15]，從而也導(dǎo)致酯化度下降，GalA含量增加。

式中，W′維數(shù)為s×m，θ2為閾值，維數(shù)為m×1，f2（I2）為輸出層的傳遞函數(shù)，可采用Sigmoid函數(shù)或Purelin函數(shù)。

如表1所示，9種果膠的阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)均含量相對(duì)較高，其次是鼠李糖(Rha)、和葡萄糖(Glc)。改性前果膠的中性糖含量均高于改性后果膠，且TAE法提取的果膠中性糖含量最高。改性后果膠的糖醛酸含量均高于改性前的果膠，且MAE法提取的果膠改性前后的糖醛酸含量均高于TAE法和UAE法提取的果膠。以Rha與GalA相對(duì)含量比表示果膠的分支程度，比值越高說明分支度更高[16]。表1中Rha/GalA的比值為0.10～0.30，表明不同提取方式和改性方法得到的9種果膠有較多支鏈，且果膠局部降解較少，其結(jié)構(gòu)主要為RG-I型[17]。

表1 改性前后小?？Х裙すz得率和理化性質(zhì) 單位：%

2.3 小?？Х裙すz的掃描電鏡分析

圖2是改性前后小?？Х裙すz的掃描電子顯微鏡圖，未改性的A1、B1和C1果膠表面凹凸不平但質(zhì)地比改性后的果膠緊密，其中C1果膠表面凸起較多，并且有特殊的折疊結(jié)構(gòu)和少量的孔隙；A1和B1果膠質(zhì)地緊密無明顯孔隙結(jié)構(gòu)。酸堿改性果膠(A2、B2、C2)質(zhì)地都較為疏松，其中B2果膠表面有顆粒狀堆積，C2果膠存在空腔結(jié)構(gòu)，而A2果膠無明顯顆粒堆積和孔隙結(jié)構(gòu)。熱改性果膠(A3、B3、C3)與未改性和酸堿改性果膠相比表面質(zhì)地更加疏松，存在空腔結(jié)構(gòu)或片層結(jié)構(gòu)。不同的提取方法及改性方法使得果膠的分子質(zhì)量、多糖含量、酯化度等都發(fā)生了不同程度的變化，從而導(dǎo)致果膠多糖存在結(jié)構(gòu)形態(tài)上的差異。

圖2 改性前后小?？Х裙すz的掃描電子顯微鏡圖Fig.2 Scanning electron micrograph of natie and modified C.arabica pomace pectin

2.4 不同提取方式和改性對(duì)分子質(zhì)量的影響

利用HPGPC法對(duì)改性前后的果膠分子質(zhì)量進(jìn)行測定，結(jié)果如表2所示。改性前后的果膠分子質(zhì)量在1.42×102～6.79×104Da，不同提取方式和改性方法制備的小粒咖啡果皮果膠多糖分子質(zhì)量分布不均一，均由3種不同分子質(zhì)量的組分峰組成(峰1，峰2，峰3)。9種果膠的峰2和峰3的分散系數(shù)(Mw/Mn)均接近1.0，說明分子質(zhì)量分布比較集中，峰1的分散系數(shù)(Mw/Mn)均大于2.0，分布比較分散。比較這9種果膠峰面積較大的峰(即峰1)的重均分子質(zhì)量：A1>A3>A2，B1>B2>B3，C1>C2>C3，而A3、B3、C3這部分的果膠含量相對(duì)較高(峰面積較大)；比較峰2的重均分子質(zhì)量：A1>A3>A2，B1>B3>B2，C1>C3>C2，而A3、B2、C2這部分的果膠含量相對(duì)較高；比較峰3的重均分子質(zhì)量：A1>A3>A2，B1>B2>B3，C1>C2>C3，而A1、B1、C2這部分的果膠含量相對(duì)較少。其中酸堿改性和熱改性的重均分子質(zhì)量均小于未改性果膠的分子質(zhì)量，這可能是由于酸堿和高壓加熱的條件下，果膠分子發(fā)生β-消除反應(yīng)和去酯化反應(yīng)，使得果膠主鏈斷裂，生成一些聚半乳糖醛酸低聚物[18]。

表2 改性前后小?？Х裙すz的分子質(zhì)量Table 2 The relatie molecular weight and its distributionof natie and modified C. arabica pomace pectin

續(xù)表2

2.5 小?？Х裙すz的紅外光譜分析

圖3 改性前后的小粒咖啡果皮果膠的紅外光譜圖Fig.3 The FTIR of natie and modified C.arabica pomace pectin

2.6 改性小?？Х裙すz的抗氧化活性

2.6.1 DPPH自由基清除能力

由圖4可知，隨著果膠質(zhì)量濃度的增加，9種不同果膠對(duì)DPPH自由基的清除率也不同程度地增加。當(dāng)果膠質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí)，3種未改性的果膠A1、B1、C1對(duì)DPPH自由基的清除率均低于酸堿改性和熱改性的果膠；當(dāng)果膠質(zhì)量濃度大于0.8 mg/mL時(shí)，酸堿改性的果膠A2、B2、C2對(duì)DPPH自由基的清除率均高于未改性和熱改性的果膠，而A1和A3，B1和B3之間對(duì)DPPH自由基的清除率無顯著差異。當(dāng)果膠樣品質(zhì)量濃度為6.2 mg/mL時(shí)，9種果膠對(duì)DPPH自由基的清除率均大于90%，其中酸堿改性果膠A2、B2、C2對(duì)DPPH自由基的清除率最高，分別為97.36%、99.12%和98.11%，IC50值分別為0.58、0.52、0.53 mg/mL(表3)，高于南酸棗果膠多糖(IC50=3.08 mg/mL)[22]?？梢娝釅A改性的小粒咖啡果皮果膠具有更好的清除DPPH自由基的能力。A2、B2、C2果膠的GalA含量均高于未改性和熱改性的果膠，因此具有更強(qiáng)的抗氧化活性。

a-TAE法果膠;b-MAE法果膠;c-UAE法果膠圖4 不同小粒咖啡果皮果膠對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.4 Scaenging capacity of different C.arabica pomace pectins against DPPH radical

表3 改性前后小?？Х裙すz清除4種自由基的IC50值Table 3 The IC50 alues of natie and modified C.arabica pomace pectin

2.6.2 ·OH的清除能力

由圖5可知，隨著果膠質(zhì)量濃度的增加，9種果膠對(duì)·OH的清除率也有不同程度的增加。當(dāng)果膠質(zhì)量濃度為0.02～6.4 mg/mL時(shí)，A2果膠對(duì)·OH的清除率要高于A1和A3，果膠質(zhì)量濃度小于0.08 mg/mL時(shí)，A3果膠低于A1果膠。當(dāng)果膠質(zhì)量濃度高于1.6 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH的清除率由高到低依次為：A2>A3>A1。果膠質(zhì)量濃度為0.02～6.4 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH的清除率由高到低依次為：B2>B3>B1，當(dāng)果膠質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL時(shí)，B1和B3對(duì)·OH的清除能力無顯著差異。在果膠質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL時(shí)，B1和B3對(duì)·OH的清除率分別為41.20%和41.64%，無顯著差異，而B2果膠的清除率則小于前兩者，僅為32.54%。當(dāng)果膠質(zhì)量濃度大于1.6 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH的清除率由高到低依次為：C2>C3>C1。

當(dāng)果膠質(zhì)量濃度為6.4 mg/mL時(shí)，9種小粒咖啡果皮果膠(A1～A3,B1～B3,C1～C3)對(duì)·OH的清除率均大于90%，其中TAE法提取和改性得到的A1、A2、A33種果膠均大于96%，3種提取方法中，均為酸堿改性的果膠A2、B2、C2的清除率最高，分別為：99.97%、98.56%和99.23%，IC50值分別為0.77、0.68、0.78 mg/mL(表3)，高于南酸棗果膠多糖(IC50=3.69 mg/mL)。果膠多糖中的羧基可以絡(luò)合Fe2+，從而抑制Fe2+與H2O2生成·OH，同時(shí)果膠多糖中的羧基和羥基可作為氫供體與·OH反應(yīng)[23-25]。而A2、B2、C2中的GalA含量相對(duì)較高(表1)，由此可知，GalA相對(duì)含量較高的酸堿改性小?？Х裙すz對(duì)·OH有更強(qiáng)的清除能力。

a-TAE法果膠;b-MAE法果膠;c-UAE法果膠圖5 不同小?？Х裙すz對(duì)·OH的清除率Fig.5 Scaenging capacity of different C.arabica pomace pectins against ·OH

2.6.3 ·O2-的清除能力

由圖6可知，9種果膠均隨著果膠質(zhì)量濃度的增加·O2-的清除率也在不同程度的增加。當(dāng)果膠質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL時(shí)，熱改性(A3)和未改性果膠(A1)對(duì)·O2-的清除能力無顯著差異。質(zhì)量濃度小于1.6 mg/mL時(shí)，果膠對(duì)·O2-的清除率為A2>A1>A2，而當(dāng)果膠質(zhì)量濃度高于1.6 mg/mL時(shí)，對(duì)·O2-的清除率為A2>A3>A1。在果膠濃度為1.6～6.4 mg/mL時(shí)，對(duì)·O2-的清除率為B2>B3>B1，當(dāng)果膠質(zhì)量濃度小于1.6 mg/mL時(shí)，清除能力為B3>B2>B1。C1和C3在質(zhì)量濃度在0.2～0.8 mg/mL時(shí)，對(duì)·O2-的清除率無顯著差異。當(dāng)果膠質(zhì)量濃度高于0.8 mg/mL時(shí)清除率為C2>C3>C1。

當(dāng)果膠質(zhì)量濃度為6.4 mg/mL時(shí)，9種小?？Х裙すz(A1～A3,B1～B3,C1～C3)對(duì)·O2-的清除率均大于90%，3種提取方法中，酸堿改性的果膠A2、B2、C2的清除率最高，分別為99.87%、97.28%和99.92%，IC50值分別為0.49、0.68、0.54 mg/mL(表3)，由于UAE法提取的果膠GalA含量最高，因此對(duì)·O2-的清除能力高于TAE和MAE法提取的果膠。

a-TAE法果膠;b-MAE法果膠;c-UAE法果膠圖6 小?？Х裙すz對(duì)·O2-的清除率Fig.6 Scaenging capacity of different C.arabica pomace pectins against ·O2-

2.6.4 ABTS陽離子自由基的清除能力

由圖7可知，隨著果膠質(zhì)量濃度的增加9種果膠對(duì)ABTS陽離子自由基的清除率也隨之增加。在果膠質(zhì)量濃度為0.2～0.4 mg/mL時(shí)，A1、A2和A3對(duì)ABTS陽離子自由基的清除率的差異不顯著，當(dāng)果膠質(zhì)量濃度高于0.8 mg/mL時(shí)，呈現(xiàn)A2>A3>A1的規(guī)律。在果膠質(zhì)量濃度高于1.6 mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS陽離子自由基的清除率呈現(xiàn)B2>B3>C1的規(guī)律。果膠質(zhì)量濃度低于1.6 mg/mL時(shí)，B2對(duì)ABTS陽離子自由基的清除率均小于B1和B3，B1和B3無顯著差異。呈現(xiàn)B2>B3>B1的規(guī)律，當(dāng)果膠質(zhì)量濃度為6.4 mg/mL時(shí)，9種小粒咖啡果皮果膠(A1～A3, B1～B3, C1～C3)對(duì)ABTS陽離子自由基的清除率均大于90%，其中MAE法和UAE法提取的果膠(B1～B3, C1～C3)清除率均大于96%，3種提取方法中，酸堿改性的果膠A2、B2、C2的清除率最高，分別為99.12%、99.97%和99.82%，IC50值分別為0.76、0.89、0.90 mg/mL(表3)。

a-TAE法果膠;b-MAE法果膠;c-UAE法果膠圖7 小?？Х裙すz對(duì)ABTS陽離子自由基的清除率Fig.7 Scaenging capacity of different C.arabica pomace pectins against ABTS cationicradical

3 結(jié)論與討論

本研究采用TAE、MAE和UAE 3種方法提取小?？Х裙ぶ械墓z，其中MAE法果膠得率最高，3種方法提取的果膠的半乳糖醛酸含量為C1>B1>A1，酯化度為A1>B1>C1；改性前后9種果膠(A1～A3, B1～B3，C1～C3)的阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)均相對(duì)較高。果膠酸堿改性和熱改性后，3種方法提取的果膠的GalA含量均升高，酯化度均降低。2種改性方法中，酸堿改性的果膠的GalA含量高于熱改性果膠，MAE法酸堿改性后的果膠(B2)GalA含量最高。改性果膠質(zhì)地都較為疏松、有空腔結(jié)構(gòu)或片層結(jié)構(gòu)。改性前后的果膠分子質(zhì)量在5.62×102～6.79×104Da，均由3種不同分子質(zhì)量的組分峰組成。不同的提取方法及改性方法使得果膠的分子質(zhì)量、多糖含量、酯化度等都發(fā)生了不同程度的變化，從而導(dǎo)致果膠多糖存在結(jié)構(gòu)形態(tài)上的差異。

9種果膠對(duì)DPPH自由基、·OH、·O2-和ABTS陽離子自由基的清除率呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴效應(yīng)，其中當(dāng)果膠質(zhì)量濃度大于3.2 mg/mL時(shí)，清除能力均為酸堿改性果膠>熱改性果膠>未改性果膠。超聲波輔助提取和酸堿改性果膠的半乳糖醛酸含量較高，且對(duì)4種自由基的清除能力也相對(duì)較好，因此果膠中半乳糖醛酸的含量和對(duì)自由基的清除能力存在正比關(guān)系。本研究為以小粒咖啡果皮為原料的天然食源性抗氧化劑的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)，具有潛在的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。