岳晨博，李敏玉，于雷雷，田豐偉，王家林*，翟齊嘯*

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214000)2(海軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院，上海，200433)

綠茶的食用已被證明具有許多健康益處，這主要歸功于綠茶中的主體成分兒茶素。在綠茶中已經(jīng)確定了5種主要的兒茶素，其中含量最豐富的是表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)，占兒茶素的50%～70%[1]。EGCG是一種黃酮-3-醇多酚類化合物，具有酚類抗氧化性，結構中的6個鄰位酚羥基使其具有優(yōu)于其他兒茶素的許多性質[2]?，F(xiàn)有研究多集中于EGCG具有的功能上，例如預防齲病、緩解酒精性脂肪性肝病、抗氧化、抗病毒、誘導腫瘤細胞凋亡等，或者是分析主要成分以及研究藥物代謝等，而探究EGCG對腸道菌群影響的研究較少[3]。

腸道菌群參與機體營養(yǎng)物質的消化與吸收，與腸黏膜一起構成的腸道生物屏障能阻止病原體的入侵。腸道菌群與許多代謝疾病如肥胖、Ⅱ型糖尿病等聯(lián)系密切[4]。腸道菌群受到多種因素的調(diào)節(jié)，其中膳食成分是影響菌群結構組成最直接且較快速的一種[5]。與其他酚類化合物一樣，EGCG的生物利用度很低，消化吸收主要發(fā)生在小腸部位，EGCG能與腸道微生物發(fā)生相互作用從而影響菌群及代謝物的組成[6]。而腸道微生物與宿主的相互作用是物質發(fā)揮生理功能的重要途徑之一[7]。

少有的一些關于EGCG與腸道微生物的研究都是基于小鼠疾病模型，還沒有研究關注健康小鼠的變化。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)補充EGCG能在緩解結腸炎[8]和肥胖[9]疾病癥狀的同時提高腸道中阿克曼氏菌(Akkermansia)的豐度。但這種提高是由于EGCG緩解疾病導致的還是EGCG本身能促進Akkermansia的豐度尚未見報道。因此本研究選用SPF級C57BL/6J健康小鼠，進行為期4周的EGCG補充實驗。利用16S rRNA測序、短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)測定、非靶向代謝物分析、血漿生化分析等分析手段，探究攝入EGCG后，健康小鼠腸道菌群及糞便代謝物的變化。

1 材料與方法

1.1 材料、動物與試劑

EGCG(純度≥98%)，上海創(chuàng)賽科技有限公司。

20只6周齡無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級C57BL/6J雄性小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。實驗動物飼養(yǎng)于江南大學實驗動物中心SPF級屏障中。期間，環(huán)境室溫控制在23～25 ℃，相對濕度控制在40%～60%，照明制度為標準的12 h光-暗周期循環(huán)。

糞便DNA提取試劑盒(Fast DNA SPIN Kit for Feces)，美國MP Biomedicals；膠回收試劑盒，德國Qiagen；血漿生化指標所有試劑盒，深圳邁瑞。

葡萄糖、NaCl、H2SO4、無水乙醚、Na2SO4、甲醇、乙腈等其他常見試劑，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

5417離心機，德國Eppendorf；高通量組織破碎儀，寧波新芝；PCR儀，美國Bio-Rad；2000C超微量分光光度計，美國Nano Drop；GC-MS系統(tǒng)、UltiMate 3000 HPLC系統(tǒng)、Q-Exactie質譜儀、真空離心濃縮儀，美國Thermo Fisher Scientific；振蕩器，德國IKA；Acc-Check血糖儀，德國羅氏；BS-480生化分析儀，深圳邁瑞。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物實驗

所有操作均按照《江南大學實驗動物管理辦法》進行，實驗經(jīng)江南大學實驗動物福利倫理委員會批準(倫理批準編號：JN.No20201130c0880125[350])。實驗動物在進行自由飲食7 d后，隨機分為2組，每組10只。制備1 mmol/L的EGCG水溶液，用無菌濾膜(0.22 μm)過濾以保證無菌。實驗組(EGCG)每天灌胃0.2 mL/只EGCG水溶液，空白組(Control)灌胃同體積無菌水。灌胃4周后，隔夜禁食，進行口服葡萄糖耐量(oral glucose tolerance test, OGTT)試驗。實驗結束后，對每只小鼠進行異氟烷麻醉并處死。收集小鼠血液于EDTA抗凝管中，靜置30 min后4 ℃、2500×g離心15 min，將上層血漿小心收集到干凈的PCR管中。解剖小鼠后，小心取出組織放入液氮中猝滅，隨后轉移至-80 ℃保存。

1.3.2 糞便DNA提取與16S rRNA測序

按照試劑盒說明書進行糞便DNA的提取，然后以其為模板對細菌的3～4片段進行聚合酶鏈式反應擴增。正向引物341F(5′-CCT AYG GGR BGC ASC AG-3′)，反向引物806R(5′-GGA CTA CNN GGG TAT CTA AT-3′)。利用12%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，具體步驟按照膠回收試劑盒說明書進行。在Illumina MiSeq PE300平臺上進行上機檢測，下機數(shù)據(jù)采用QIIME Ⅱ軟件進行分析，參考WANG等[10]的方法進行下機數(shù)據(jù)的質量控制。

1.3.3 結腸內(nèi)容物SCFAs含量的測定

小鼠結腸內(nèi)容物預先冷凍干燥，稱取30～50 mg凍干樣本，加入500 μL飽和NaCl溶液，均質后加入20 μL 10% H2SO4溶液，用漩渦振蕩儀振蕩30 s。在通風櫥中加入800 μL無水乙醚以萃取SCFAs，振蕩均勻后靜置30 min提高萃取率。14 000 r/min離心15 min，將上清液轉移至裝有0.25 g Na2SO4的2 mL離心管中，再以同樣的條件離心，取上清液置于氣相瓶中待測。采用配備Rtx-WAX毛細管柱的GC-MS系統(tǒng)進行檢測，載氣He，流速0.89 mL/min。將樣品注入GC中，柱溫以7.5 ℃/min從100 ℃升至140 ℃，隨后以60 ℃/min升溫至200 ℃，保持3 min。GC-MS條件：柱頭壓力62.7 kPa， 分流比10∶1， 離子源溫度220 ℃，界面溫度250 ℃，掃描范圍設置m/z2～100。

1.3.4 糞便非靶向代謝物的測定

樣品前處理：稱取20 mg樣品轉移至1.5 mL離心管中，加入200 μL H2O勻漿，再加入800 μL (甲醇)∶(乙腈)=1∶1(提前-20 ℃預冷)沉淀蛋白，渦旋30 s后超聲波處理10 min。放置樣本于-20 ℃冰箱孵育1 h，提高蛋白沉淀率(二次沉淀去除蛋白)。4 ℃下，15 000 r/min高速離心20 min，取上清液用旋轉蒸發(fā)儀蒸干。上機前，加入200 μL (甲醇)∶(水)=4∶1后渦旋30 s復溶，4 ℃下，15 000 r/min高速離心15 min，用0.22 μm濾膜過濾上清液，移取適當體積裝入進樣小瓶上機檢測。質量控制樣本制備：從待測樣品中移取等量體積至新的進樣瓶中?？瞻讟颖局苽?1 mL (甲醇)∶(水)=4∶1至上樣瓶混合均勻。具體的測定過程與參數(shù)參考FAN等[11]的方法。

1.3.5 OGTT測定

干預4周后，小鼠禁食不禁水12 h保證空腹狀態(tài)下進行OGTT。稱量體重后，按照2 g/kg的劑量灌胃400 mg/mL的葡萄糖溶液，體重20 g的小鼠灌胃劑量為100 μL。由尾部靜脈取血，用Accu-Chck活力型血糖試紙測定空腹血糖值及灌胃后15、30、60、90、120 min的血糖值。根據(jù)6個時間點的血糖值計算OGTT的曲線下面積。

1.3.6 血漿生化指標測定

將1.3.1得到的血漿在全自動生化分析儀上檢測分析。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

本文實驗數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”表示，兩組間差異用非配對t檢驗方法進行統(tǒng)計學分析，P<0.05表示具有顯著性差異，利用Graph pad Prism 8.3軟件進行繪圖。在生科云中進行菌群分析(https://www.bioincloud.tech)。在Compound Discoer3.2軟件上處理代謝組學數(shù)據(jù)，并用Microbiome Analyst 進行分析和繪圖(https://www.microbiomeanalyst.ca/faces/home.xhtml)。

2 結果與分析

2.1 EGCG對小鼠糞便微生物組成和多樣性的影響

如圖1-a所示，在門水平上，擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)占據(jù)腸道微生物組成的85%以上，且在空白組和EGCG組含量基本一致。剩余15%左右的菌主要是疣微菌門(errucomicrobia)、變形菌門(Proteobacteria)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)和放線菌門(Actinobacteria)等。值得注意的是，EGCG組顯著增加了errucomicrobia并降低了Deferribacteres。

在屬水平上，圖1-b展示了相對豐度排名前20的分組柱狀圖，為了進一步確認關鍵生物學標志物，進行了LEfSe分析，結果如圖1-c所示。相較于空白組，EGCG組阿克曼氏菌屬(Akkermansia)(P=0.009)、Muribaculaceae科未分類的屬(P=0.023 1)、厭氧棒狀菌屬(Anaerostipes)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、羅姆布茨菌屬(Romboutsia)等豐度顯著增加。Mucispirillum菌屬(P=0.046 1)、Lachnospiraceae NK4A136 group菌屬(P=0.047 8)、理研菌屬(Alistipes)(P=0.014 5)、Family Ⅷ UGG-001菌屬、Eubacteriumxylanophilumgroup菌屬(P=0.034 1)、Eubacteriumbrachygroup菌屬、Lachnospiraceae UCG-006菌屬等豐度顯著降低。

a-門水平豐度柱狀圖；b-屬水平豐度柱狀圖；c-LEfSe分析結果圖；d-屬水平單菌豐度圖圖1 EGCG對小鼠糞便微生物組成的影響Fig.1 Effect of EGCG on fecal microbial composition of mice 注:ns 表示沒有統(tǒng)計學差異；*表示P<0.05；**表示P<0.01(下同)

圖1-d展示了其中6個單菌的豐度，其他的菌屬雖然出現(xiàn)了明顯的變化，比如Anaerostipes是在空白組中相對豐度為0，攝入EGCG后增殖的一種菌，但因為單菌豐度小于1%，因此沒有進行P值的統(tǒng)計和分析，也未在圖1-d中展示相對豐度的變化。

Akkermansia是在攝入EGCG后變化最為明顯的一種菌，這是一種由DERRIEN等[12]在健康人糞便中分離出來的一種黏液降解菌。Akkermansia既降解黏蛋白獲取能量，又刺激宿主分泌黏液、增強黏液層厚度，因此其豐度與腸道屏障和宿主免疫關系密切。近年來。諸多研究證明了Akkermansia可以在糖尿病[13]、肥胖[7]、上皮性腫瘤[14]等多種疾病中發(fā)揮益生功能。其主要益生機制是增加黏液層厚度、保護腸道屏障完整性[15]。此前，一些研究發(fā)現(xiàn)口服EGCG能在緩解結腸炎[8]和肥胖[9]等疾病的同時提高Akkermansia的豐度。本實驗結果證明，EGCG在小鼠健康狀態(tài)下也能促進Akkermansia的豐度，因此這種促進作用與小鼠的疾病狀態(tài)無關。近日，一項體外研究證明了EGCG能直接促進Akkermansia豐度的增長[16]。本實驗為定向促進體內(nèi)Akkermansia豐度提供了依據(jù)。

Muribaculaceae菌科成員也是黏蛋白單糖的主要利用者，其作為共生菌與其他4個菌株一起可以阻止致病菌艱難梭菌的定植[17]，且促進了益生菌Bifidobacterium的增殖。而脫鐵桿菌門下脫鐵桿菌科中唯一的屬——Mucispirillum顯著降低。Mucispirillum是一種螺旋形細菌，分布在腸分泌黏液層，被認為具有降解黏液蛋白層的能力。這是一種高致病性的菌株，大量的研究已經(jīng)將Mucispirillum與炎癥性腸病聯(lián)系起來[18]?？偠灾a充EGCG促進了有益菌豐度的增加，抑制了有害菌的定植，促進了腸道菌群的健康。

接下來使用腸道菌群的多樣性(Shannon指數(shù))和豐富度(Chao 1指數(shù))表征α多樣性，如圖2-a、圖2-b所示。EGCG組較空白組Shannon指數(shù)無顯著差異，即通過加權物種均勻度反映的群落復雜程度未發(fā)生改變；Chao 1指數(shù)出現(xiàn)顯著下降，即物種操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)總量下降。這可能是EGCG發(fā)揮了其抗菌作用，抑制了一些菌的生長。通過LEfSe分析的結果也可以看到，增加OTU數(shù)的物種少于減少OTU數(shù)的物種。

a-Shannon指數(shù)；b-Chao 1指數(shù)；c-主坐標分析圖2 EGCG對小鼠糞便微生物多樣性的影響Fig.2 Effect of EGCG on fecal microbial diersity of mice

基于Bray-Curtis距離，β多樣性用主坐標分析表示。如圖2-c所示，空白組小鼠腸道微生物在空間上分布的較為分散，而補充EGCG能顯著改變菌落結構，在空間上形成聚集狀態(tài)。過往的研究結果中，攝入類似的多酚類物質會使空白組和實驗組分屬在不同的區(qū)域，表示微生物組成具有顯著性差異[19]。本實驗中空白組微生物結構個體間差異較大，分散在了不同的位置。但攝入EGCG 4周后，能明顯看到在空間上形成了聚集的狀態(tài)，表明EGCG能夠改變健康小鼠腸道菌群使得組內(nèi)差異逐漸縮小并與未攝入EGCG的菌群結構具有顯著差異。

2.2 EGCG對小鼠SCFAs的影響

EGCG的攝入會改變健康小鼠的腸道菌群，腸道代謝產(chǎn)物可能也會隨之發(fā)生變化，因此我們測定了靶向代謝組即SCFAs和非靶向代謝組來探究腸道代謝產(chǎn)物的變化。小鼠結腸內(nèi)容物中主要SCFAs濃度檢測結果如圖3所示，補充EGCG能顯著提高乙酸、丙酸、丁酸濃度(P<0.05)，而異丁酸、異戊酸和戊酸雖有升高的趨勢，但沒有顯著性變化。

SCFAs通常是由腸道有益細菌代謝膳食纖維等碳水化合物所產(chǎn)生的代謝物，具有多種有益功能，如阻止有害細菌和病原體的入侵、控制食欲、為結腸細胞提供能量、對抗慢性炎癥等作用[20]。過往研究報道Akkermansia可以產(chǎn)生乙酸和丙酸，并且與腸道中產(chǎn)丁酸鹽細菌協(xié)同合作促進丁酸的產(chǎn)生，從而激活G41和G43蛋白偶聯(lián)受體，并改善宿主糖脂代謝異常[7]。EGCG的補充促進了產(chǎn)SCFA菌如Akkermansia、Bifidobacterium等菌的增加，雖然我們不能確定其中的因果關系，但乙酸、丙酸、丁酸含量的增加再次證明了補充EGCG有益于健康小鼠的腸道健康，我們猜測Akkermansia豐度的增加可能是出現(xiàn)這一變化的主要原因。

a-乙酸濃度；b-丙酸濃度；c-異丁酸濃度；d-丁酸濃度；e-異戊酸濃度；f-戊酸濃度圖3 EGCG對小鼠結腸SCFA含量的影響Fig.3 Effect of EGCG on SCFA content in colon of mice

2.3 EGCG對小鼠糞便代謝物的影響

相比于空白組，EGCG組中顯著富集了胸腺嘧啶脫氧核苷、2′-脫氧鳥苷、鳥嘌呤、2′-脫氧腺苷、花生四烯酸乙酯等物質。胸腺嘧啶脫氧核苷是基本核糖核苷中的一種，酸化后是RNA鏈上的一個基本單元，脫氧后變成DNA的組成部分。在醫(yī)學上用于乳腺癌、卵巢癌、原發(fā)性支氣管肺癌和消化道腫瘤等疾病的輔助化療，能降低腫瘤治療中DNA的損傷和凋亡；2′-脫氧鳥苷作為一種重要的原料，用來合成抗病毒、抗腫瘤的核酸藥物如寡脫氧核苷酸等；鳥嘌呤可以用作抗病毒藥物阿昔洛韋中間體；2′-脫氧腺苷可作為重要中間體合成2′-氟-2′-脫氧腺苷、阿昔洛韋、雙脫氧腺苷等抗病毒、抗癌、抗艾滋病藥物。本研究中顯著富集的代謝產(chǎn)物都與抗病毒、抗癌藥物有關。EGCG具有的抗病毒、抗癌等功效可能與其生成的代謝產(chǎn)物有關。

代謝通路氣泡圖(圖4-c)顯示，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成是顯著富集的代謝通路。苯丙氨酸作為一種必需氨基酸，在體內(nèi)大部分經(jīng)由羥化酶生成酪氨酸，并且可以跟酪氨酸一起合成重要的激素和神經(jīng)遞質，參與機體糖脂代謝。顯著性通路還有不飽和脂肪酸的生物合成?；谶@2個與糖代謝和脂肪代謝的通路，對小鼠進行了OGTT以及血漿脂代謝相關指標的測定。

a-OPLS-DA得分圖；b-前25個代謝物聚類熱圖；c-代謝通路氣泡圖圖4 EGCG對小鼠糞便代謝物判別分析、聚類分析和代謝途徑的影響Fig.4 Effects of EGCG on discriminant analysis, cluster analysis and metabolic pathway of fecal metabolites in mice

2.4 差異菌和差異代謝物的Spearman相關性分析

在之前的分析中用LEfSe分析確定了兩組間的差異菌，用OPLS-DA模型篩選出差異代謝物。代謝產(chǎn)物在腸道中的分布取決于腸道菌群的組成和功能，因此，采用Spearman相關性分析來探究屬水平差異菌和前30個差異代謝物之間的關系。如圖5所示，差異代謝物與差異菌之間具有強相關性。

圖5 Spearman相關性分析結果聚類熱圖Fig.5 Clustering heatmap diagram of the Spearman’s rank correlation analysis

EGCG組顯著富集的2′-脫氧鳥苷、鳥嘌呤、2′-脫氧腺苷、花生四烯酸乙酯等物質與Romboutsia屬、Faecalibacterium屬、Anaerostipes屬呈顯著正相關。推測EGCG可能通過增加Romboutsia屬、Faecalibacterium屬、Anaerostipes屬的增殖來促進2′-脫氧鳥苷、鳥嘌呤、2′-脫氧腺苷、花生四烯酸乙酯等物質的增加，從而發(fā)揮其抗病毒和抗癌的生理功能。

2.5 EGCG對小鼠OGTT和血漿生化指標的影響

補充EGCG顯著提高了Akkermansia菌，這是一種被公認與肥胖癥狀具有負相關的菌，并且在分析代謝物中發(fā)現(xiàn)顯著富集了與糖代謝和脂肪代謝的相關通路。因此，我們對發(fā)現(xiàn)的標志菌和標志代謝物變化可能產(chǎn)生的生理意義通過OGTT和血漿生化指標的測定進行了驗證。

根據(jù)灌胃葡萄糖0、15、30、60、90、120 min的血糖值繪制了OGTT曲線(圖6-a)并計算了線下面積(圖6-b)。2組小鼠灌胃葡萄糖15 min后血糖水平急速上升，之后的105 min內(nèi)血糖水平逐漸下降?？瞻捉M灌胃后15、30、60 min的血糖值顯著高于EGCG組，90、120 min兩組間血糖值無顯著差異。說明2組小鼠在2 h內(nèi)都能恢復正常血糖值，但EGCG組小鼠血糖恢復水平高于空白組。同時，空白組線下面積顯著高于EGCG組。可以得出，補充4周EGCG有益于小鼠血糖代謝能力。

a-OGTT曲線；b-OGTT曲線下面積圖6 EGCG對小鼠葡萄糖耐量的影響Fig.6 Effects of EGCG on glucose tolerance in mice

如圖7所示，補充EGCG顯著提高了低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、顯著降低了甘油三酯(triglyceride，TG)，但總膽固醇(total cholesterol，TC)和高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)無顯著性差異?？偟膩碚f，補充EGCG對小鼠血脂水平影響不大。本研究結果與COLLINS等[21]和劉振云等[22]的研究結果一致，即EGCG具有改善血糖、降低血脂的功能，且本研究驗證了這些功能與菌群和代謝物具有潛在關聯(lián)的生理意義。

a-血漿TC；b-血漿TG；c-血漿LDL-C；d-血漿HDL-C圖7 EGCG對小鼠血漿生化指標的影響Fig.7 Effects of EGCG on plasma biochemical indices in mice.

3 結論

本研究對小鼠糞便菌群16S rRNA進行測序，結果證明，EGCG能改變健康小鼠腸道菌群的結構和組成，促進了Akkermansia、Bifidobacterium等有益菌豐度的增加，抑制了Muribaculaceae等有害菌的定植，促進了腸道菌群的健康。EGCG不僅可以促進肥胖和結腸炎疾病模型小鼠體內(nèi)Akkermansia屬豐度的增加[8-9]，也能促進健康小鼠體內(nèi)該菌豐度的增加，結合最近的一項體內(nèi)實驗，為定向促進體內(nèi)Akkermansia豐度提供了依據(jù)。靶向代謝物分析結果表明，EGCG的攝入顯著提高了乙酸、丙酸和丁酸的含量，這與產(chǎn)SCFA菌豐度的增加有關。非靶向代謝物分析結果表明，相對于空白組，EGCG組提高了胸腺嘧啶脫氧核苷、2′-脫氧鳥苷、鳥嘌呤、2′-脫氧腺苷等與抗病毒和抗癌藥物有關的代謝產(chǎn)物?；诓町惥筒町惔x物之間的Spearman相關性分析，我們推測EGCG可能通過增加Romboutsia屬、Faecalibacterium屬、Anaerostipes屬的增殖來促進2′-脫氧鳥苷、鳥嘌呤、2′-脫氧腺苷等物質的增加，從而有助于發(fā)揮其抗病毒和抗癌的生理功能。最后我們重新驗證了與差異菌和差異代謝物相關的生理功能，證明EGCG顯著改善了小鼠血糖代謝水平。本研究為EGCG發(fā)揮健康益處及產(chǎn)品開發(fā)提供了科學依據(jù)。